，， ，，

[1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第二附屬醫(yī)院急診科，重慶 400037；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第二附屬醫(yī)院麻醉科，重慶 400037；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第二附屬醫(yī)院呼吸科，重慶 400037]

學(xué)習(xí)和記憶屬于高等動(dòng)物腦功能的一部分，研究表明麻醉患者腦功能損害時(shí)有發(fā)生，主要表現(xiàn)在空間記憶以及學(xué)習(xí)能力的下降[1]，但對(duì)不同人群不同麻醉方式產(chǎn)生效應(yīng)的研究卻較為有限，對(duì)分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)也較為局限。既往研究表明環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)磷酸化與神經(jīng)元的數(shù)量、功能、再生、凋亡密切相關(guān)[2]，而記憶學(xué)習(xí)又受海馬區(qū)神經(jīng)元直接相調(diào)控，所以CREB或直接影響著學(xué)習(xí)和記憶的功能[3-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)對(duì)細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)十分廣泛，其反應(yīng)蛋白CREB參與多條細(xì)胞代謝過(guò)程[6]，然而CREB是否參與吸入麻醉所致的腦功能損害尚不明確。本研究通過(guò)臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較七氟醚聯(lián)合氧化亞氮吸入麻醉后對(duì)CREB表達(dá)及空間學(xué)習(xí)記憶運(yùn)動(dòng)影響，探討腦功能致?lián)p的潛在機(jī)制，同時(shí)對(duì)不同麻醉方式、不同麻醉人群以及麻醉時(shí)長(zhǎng)做了初步研究，為七氟醚聯(lián)合氧化亞氮吸入麻醉致腦功能下降提供可能的防治策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇我院急診科2014年1月至2017年4月收治的442例患者，按照麻醉方式的不同分為3組。吸入麻醉組118例采用七氟醚聯(lián)合氧化亞氮麻醉，其中男60例，女58例，年齡17～78歲，平均(42.2±9.8)歲；體質(zhì)量(62.3±15.2)kg，身高(167.4±8.8)cm。局部麻醉組206例采用普魯卡因麻醉，其中男101例，女105例，年齡22～76歲，平均(43.4±6.9)歲，體質(zhì)量(57±9)kg，身高(162.5±4.8)cm。對(duì)照組118例不做麻醉處理，其中男64例，女54例，年齡19～77歲，平均(44.2±6.8)歲，體質(zhì)量(67.3±13.4)kg，身高(169.4±9.1)cm。所有患者心肺功能良好，肝腎功能及電解質(zhì)等各項(xiàng)檢查均提示耐受麻醉及手術(shù)，排除重要臟器功能障礙、精神異常、感覺(jué)存在障礙、智力低下者。3組患者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，使用許可證號(hào)為SYXK(渝)2012-0002，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)并在第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。大鼠飼養(yǎng)置于SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫25 ℃，濕度60%，食物滅菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

兔抗鼠cAMP、CREB、pCREB單抗、β-actin抗體(內(nèi)參)以及ELISA Kit酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz biotechnology公司，生物素化抗兔IgG抗體，購(gòu)自北京方盛公司，蛋白濃度測(cè)定試劑盒、組織蛋白抽提試劑盒、BCA顯色試劑盒購(gòu)自Beyotime上海分公司，PVDF膜購(gòu)自德國(guó)MC公司，蛋白上樣緩沖SDS-PAGE液凝膠配制試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司。

1.4 ELISA 法檢查血液標(biāo)本中cAMP表達(dá)情況

靜脈穿刺獲取入組人員外周血5 mL于抗凝管內(nèi)，4 ℃保存，按Innogenetics公司生物診斷試劑人cAMP ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，450 nm讀取結(jié)果，Lowry法計(jì)算目的蛋白含量。

1.5 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均遵守第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物管理委員會(huì)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)規(guī)定。60只5月齡大鼠隨機(jī)分為麻醉組(n=30)和對(duì)照組(n=30)。麻醉組大鼠持續(xù)吸入1.3%七氟醚聯(lián)合50%氧化亞氮4 h，對(duì)照組吸入50%氧氣4 h，流量3 L/min。麻醉過(guò)程保留自主呼吸。大鼠Morris水迷宮主要設(shè)備包括：①1個(gè)裝有水的圓形水池，其直徑100 cm、高50 cm，水深25 cm，水溫(26.0±1.0)℃；②隱藏在水面下1 cm的透明平臺(tái)(平臺(tái)所在象限定義為四象限)；③1套圖像自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)。水迷宮訓(xùn)練過(guò)程包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索。開(kāi)始3 d讓大鼠適應(yīng)周?chē)h(huán)境，每天將大鼠面向池壁隨機(jī)從4個(gè)象限放入水中4次，通過(guò)攝像系統(tǒng)自動(dòng)記錄并應(yīng)用相應(yīng)軟件分析其游泳軌跡，大鼠尋找平臺(tái)的最大時(shí)限設(shè)定為2 min，登臺(tái)5 s視為成功找到隱蔽平臺(tái)，攝像系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄。平臺(tái)停留1 min，以提供時(shí)間讓大鼠觀察周?chē)崾疚铮缓箝_(kāi)始下一次訓(xùn)練。保證所有大鼠的訓(xùn)練間隔時(shí)間一致。如大鼠在1 min內(nèi)未找到隱蔽平臺(tái)，攝像系統(tǒng)自動(dòng)停止記錄，逃避潛伏期(自入水至尋找到隱蔽平臺(tái)的時(shí)間)記為1 min?？臻g探索實(shí)驗(yàn)分別在第3天、1個(gè)月、3個(gè)月進(jìn)行去除平臺(tái)，然后任選2個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入水池中，記錄其在1 min內(nèi)的游泳軌跡。取2次的平均值作為空間探索實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。根據(jù)系統(tǒng)自動(dòng)分析的結(jié)果，在空間探索實(shí)驗(yàn)中平臺(tái)象限游泳距離占總距離百分比大于30%，認(rèn)為大鼠對(duì)提示物和平臺(tái)空間位置關(guān)系形成記憶。

1.6 Western blot檢測(cè)cAMP、CREB、pCREB蛋白的表達(dá)

大鼠斷頭取腦，并研磨之后，充分裂解，BCA法測(cè)定蛋白濃度及蛋白變性。選用BCA試劑盒，計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。計(jì)算濃度后充分變性，低溫冰箱保存，根據(jù)檢測(cè)出的蛋白濃度，配平各蛋白，蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜孵育一抗以及二抗。之后根據(jù)BCA說(shuō)明書(shū)加入適量的發(fā)光液，進(jìn)行曝光并采集圖像，采用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平則通過(guò)目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白(本實(shí)驗(yàn)內(nèi)參采用β-actin)的灰度值的比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 吸入麻醉組麻醉前與麻醉后血液中cAMP濃度比較以及MMSE評(píng)分情況

吸入麻醉組患者麻醉前與麻醉后比較，麻醉后血液中cAMP濃度下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；麻醉后定向力、記憶力、語(yǔ)言能力MMSE評(píng)分下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；計(jì)算能力評(píng)分變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1吸入麻醉組患者麻醉前后血液中cAMP濃度及MMSE評(píng)分(n=118)

時(shí)間 cAMP濃度(μg/ mL)MMSE評(píng)分(分)定向力記憶力語(yǔ)言能力計(jì)算能力麻醉前0.71±0.158.21±0.953.21±1.157.04±0.854.21±1.35麻醉后0.54±0.187.15±0.962.11±0.755.21±0.974.17±1.22t 7.8818.5258.70315.4130.238P 0.0410.0370.0360.0200.425

2.2 各組患者麻醉后cAMP濃度比較以及MMSE評(píng)分情況

吸入麻醉組麻醉后血液中cAMP濃度較局部麻醉組和對(duì)照組比較均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且麻醉后定向力、記憶力、語(yǔ)言能力MMSE評(píng)分下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，計(jì)算能力評(píng)分變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 吸入麻醉患者中高齡組與低齡組cAMP濃度變化比較以及MMSE評(píng)分變化情況

高齡組患者(>50歲)72例與低齡組(<50歲)46例比較，高齡組液中cAMP濃度變化更大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；麻醉后定向力、記憶力、語(yǔ)言能力MMSE評(píng)分變化更大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，計(jì)算能力評(píng)分變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

2.4 吸入麻醉患者中長(zhǎng)時(shí)間麻醉組與短時(shí)間麻醉組cAMP濃度以及MMSE評(píng)分變化情況

麻醉長(zhǎng)時(shí)間組(>2 h)68例與短時(shí)間組(<2 h)50例比較，長(zhǎng)時(shí)間組中cAMP濃度變化更大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；麻醉后定向力、記憶力、語(yǔ)言能力MMSE評(píng)分變化更大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，計(jì)算能力評(píng)分變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

2.5 水迷宮實(shí)驗(yàn)

在定位航行實(shí)驗(yàn)中，麻醉組大鼠找到平臺(tái)的潛伏期比對(duì)照組找到平臺(tái)時(shí)間(平臺(tái)潛伏期)長(zhǎng)，麻醉組穿越平臺(tái)的次數(shù)比對(duì)照組大鼠少，麻醉組大鼠2 min內(nèi)在水迷宮中的運(yùn)動(dòng)距離比對(duì)照組大鼠少，2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且麻醉組各項(xiàng)指標(biāo)變化呈時(shí)間相關(guān)性(表5～7)。

表2 各組患者cAMP濃度及MMSE評(píng)分

*:與局部麻醉組比較，P<0.05；#：與對(duì)照組比較，P<0.05

表4 吸入麻醉患者中長(zhǎng)時(shí)間組與短時(shí)間組cAMP濃度變化及MMSE評(píng)分變化

組別 平臺(tái)潛伏期(min)越平臺(tái)的次數(shù)(次)運(yùn)動(dòng)距離(cm)麻醉組68.01±7.899.03±1.821 351.68±141.81對(duì)照組32.21±5.2516.61±3.511 751.03±181.49t 20.69010.5009.497P 0.0150.0300.034

組別 平臺(tái)潛伏期(min)越平臺(tái)的次數(shù)(次)運(yùn)動(dòng)距離(cm)麻醉組78.01±9.198.03±1.371 157.68±181.51對(duì)照組29.21±4.5118.91±2.111 651.03±201.87t 26.11011.4789.954P 0.0120.0260.031

組別 平臺(tái)潛伏期(min)越平臺(tái)的次數(shù)(次)運(yùn)動(dòng)距離(cm)麻醉組87.51±8.156.21±1.54911.51±151.82對(duì)照組30.21±5.5817.65±2.911 798.03±191.53t 30.84011.98719.866P 0.0100.0260.016

2.6 Western blot檢測(cè)cAMP、pCREB、CREB蛋白相對(duì)表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，麻醉組大鼠cAMP、pCREB蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，2組大鼠CREB蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1、圖2)。

β-actin為內(nèi)參對(duì)照

*：與麻醉組比較，P<0.05

3 討論

術(shù)后認(rèn)知功能障礙是麻醉后一種常見(jiàn)的并發(fā)癥，但其發(fā)生與麻醉方式、計(jì)量、時(shí)間的關(guān)系并不十分明確，其發(fā)病機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。神經(jīng)細(xì)胞凋亡、半胱天冬酶的激活、神經(jīng)變性、Aβ的沉積、cAMP-CREB-AKT通路的抑制都與阿爾茲海默癥的發(fā)生相關(guān)，都參與了腦功能的調(diào)節(jié)[7]，其中CREB是細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子蛋白的重要成員，參與了cAMP-CREB-AKT偶聯(lián)信號(hào)通路的激活，通過(guò)對(duì)ser133位點(diǎn)磷酸化的調(diào)控使其發(fā)揮調(diào)控作用，增強(qiáng)了神經(jīng)元鈉/鉀-ATP泵的活性，達(dá)到增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性，提高學(xué)習(xí)記憶能力[8]，此外該通路還能促進(jìn)神經(jīng)元間突觸聯(lián)系形成，增加特異性突觸偶聯(lián)加強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)、儲(chǔ)存。有研究表明抑制CREB表達(dá)，對(duì)大鼠長(zhǎng)期記憶起到顯著抑制作用，但短期記憶仍相對(duì)完整[9-10]，這是因?yàn)榱姿峄疌REB (p-CREB)能在mRNA調(diào)控下，轉(zhuǎn)錄并編碼蛋白，其中一部分對(duì)維持學(xué)習(xí)和長(zhǎng)期記憶有明顯作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉組患者麻醉后血液中cAMP濃度下降、定向力、記憶力、語(yǔ)言能力MMSE評(píng)分下降且差異顯著，計(jì)算能力評(píng)分差異不顯著，這就證實(shí)七氟醚、氧化亞氮等吸入性麻醉藥物確實(shí)能降低體內(nèi)cAMP濃度，并直接影響定向力、記憶力、語(yǔ)言能力，也就是說(shuō)麻醉藥物可能導(dǎo)致了體內(nèi)cAMP濃度改變，cAMP-CREB-AKT偶聯(lián)信號(hào)通路可能參與到了腦功能的調(diào)控。同時(shí)，吸入麻醉組血液中cAMP濃度較另兩組下降、麻醉后定向力、記憶力、語(yǔ)言能力MMSE評(píng)分下降且差異顯著，由此可見(jiàn)七氟醚、氧化亞氮等吸入性麻醉藥物可能是下調(diào)cAMP的關(guān)鍵因素，其效果較其他麻醉方式更顯著，且患者年齡越大，麻醉時(shí)間越長(zhǎng)，cAMP的下降及腦功能損害也越嚴(yán)重。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麻醉組大鼠找到平臺(tái)的潛伏期比對(duì)照組找到平臺(tái)時(shí)間長(zhǎng)，穿越平臺(tái)的次數(shù)及運(yùn)動(dòng)距離卻比對(duì)照組少且麻醉組各項(xiàng)指標(biāo)變化呈時(shí)間相關(guān)性，提示吸入麻醉所致的腦功能損害隨時(shí)間推移損害加重。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示麻醉組cAMP、pCERB蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于對(duì)照組，這可能與CAMP/CREB信號(hào)通路減弱，導(dǎo)致pCREB促進(jìn)新生神經(jīng)細(xì)胞的增殖與發(fā)育成熟的過(guò)程相關(guān)[12-13]。綜上所述七氟醚聯(lián)合氧化亞氮急診吸入麻醉致腦功能下降與受麻醉者的年齡以及接受麻醉時(shí)間相關(guān)，而致腦功能下降的原因可能是增加了核內(nèi)第二信使CAMP的水解，從而導(dǎo)致其介導(dǎo)的CREB蛋白發(fā)生磷酸化水平降低。故在臨床治療過(guò)程中，對(duì)于不同的受麻醉群體，應(yīng)當(dāng)盡量選擇更合理的麻醉方式，尤其老年患者應(yīng)盡量縮短其麻醉時(shí)間[14]。而麻醉后腦功能障礙是否能通過(guò)人為對(duì)cAMP-CREB-AKT偶聯(lián)信號(hào)通路的干預(yù)而發(fā)生逆轉(zhuǎn)也是值得研究的方向。

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