杜 艷，劉 華，張波克，劉鷖雯，何怡青，楊翠霞，張國良，高 鋒

（1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200233 2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200233）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1]，目前臨床診斷乳腺癌的方法主要依賴于體格檢查和影像學(xué)檢查，但這些方法對于早期乳腺癌的發(fā)現(xiàn)敏感性很低。而目前常用來診斷乳腺癌的血清標(biāo)志物——癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原15-3（carbohydrate antigen 15-3，CA15-3）對乳腺癌早期診斷的敏感性和特異性均不理想，因此尋找新的腫瘤標(biāo)志物迫在眉睫[2]。

單核細(xì)胞由骨髓釋放入血，在血中3～4 d后進(jìn)入組織和漿膜腔轉(zhuǎn)變成巨噬細(xì)胞。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。有研究表明，TAM在腫瘤組織中通常具有2種功能截然不同的極化狀態(tài)，即M1和M2。M1型巨噬細(xì)胞一般出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生的早期、良性病變以及癌巢周圍組織中，具有殺傷腫瘤細(xì)胞、促進(jìn)炎癥反應(yīng)等功能；M2型巨噬細(xì)胞存在于整個腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，具有促進(jìn)腫瘤生長、血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移等功能[3]。TAM的極化是一個動態(tài)發(fā)展的過程，根據(jù)腫瘤的進(jìn)展，TAM可受腫瘤微環(huán)境異常改變的透明質(zhì)酸作用而發(fā)生M2極化[4]。既往有研究證實(shí)，TAM能夠伴隨著癌細(xì)胞穿過腫瘤組織內(nèi)的毛細(xì)血管壁進(jìn)入外周血循環(huán)[5-6]。因此，外周血循環(huán)中M2/M1單核細(xì)胞比例的動態(tài)變化可能對乳腺癌的診斷具有重要意義。

近年有研究顯示，結(jié)直腸癌以及霍奇金淋巴瘤等患者的外周血M2單核細(xì)胞水平升高[7-8]，結(jié)直腸癌患者外周血和組織中M1單核及巨噬細(xì)胞并沒有明顯改變[7]。目前已知乳腺癌組織中M2型巨噬細(xì)胞增多，且與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)[4]。但關(guān)于乳腺癌患者外周血M2/M1單核細(xì)胞比例變化的研究尚未見報道。因此，本研究試圖通過采用流式細(xì)胞術(shù)分析乳腺癌患者外周血M2/M1單核細(xì)胞比例變化，并與乳腺癌常規(guī)的腫瘤標(biāo)志物（CEA、CA15-3）進(jìn)行對比，分析外周血M2/ M1單核細(xì)胞比例對乳腺癌的臨床診斷價值。

1 材料和方法

1.1 外周血標(biāo)本的收集

收集2017年1—6月上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院住院的乳腺癌患者術(shù)前的乙二胺四乙酸抗凝外周血標(biāo)本89例，患者年齡（51.05±10.12）歲，既往無腫瘤感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病，且術(shù)前均未接受放療、化療及藥物治療。選取體檢健康者53名，年齡（50.50±7.78）歲。血液標(biāo)本的收集符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》（2013版）的原則，全部研究對象知情同意。

1.2 主要試劑

異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的CD14抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記的CD86抗體購自美國Beckman Coulter公司；別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanion，APC）標(biāo)記的CD163抗體購自美國Biolegend公司；PE標(biāo)記的CD204抗體購自美國R&D公司。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中M1、M2單核細(xì)胞

采用全血標(biāo)本100 μL，一管同時加入CD14、CD163、CD204抗體檢測M2單核細(xì)胞（CD14+CD163+CD204+），另一管同時加入CD14、CD163、CD86抗體檢測M1單核細(xì)胞（CD14+CD163-CD86+），振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)25 min；加入2 mL 熒光激活細(xì)胞分離儀溶血劑，振蕩混勻，室溫避光放置10 min；加入300 μL 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）多聚甲醛；于2～8 ℃暗處保存，24 h內(nèi)上機(jī)分析。

1.4 血漿CEA、CA15-3的檢測

使用乙二胺四乙酸抗凝血液收集血漿。將收集管里的血液標(biāo)本1 900 × g 4 ℃離心10 min。將血漿轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，12 000×g 4 ℃離心10 min，去除細(xì)胞來源碎片。將上清移至新的Eppendorf管中，凍存于-80 ℃。檢測前，將其在室溫下溶解，將溶解好的血漿樣本在16 000×g 4 ℃離心5 min，吸取上清，根據(jù)試劑盒使用說明書在Cobas 6000化學(xué)發(fā)光分析儀（瑞士Roche公司）上進(jìn)行CEA、CA15-3檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示，2組樣本之間的比較采用兩獨(dú)立樣本Student's t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)） [M（P25～P75）]表示，2組樣本的統(tǒng)計學(xué)比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。M2/M1單核細(xì)胞比例診斷乳腺癌敏感性和特異性的評價用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測乳腺癌患者及體檢健康者外周血中M2、M1單核細(xì)胞的表達(dá)

本研究試圖從外周血中檢測M2和M1單核細(xì)胞。首先以前角散射光和側(cè)角散射光的中間細(xì)胞群設(shè)門，再以CD14+細(xì)胞群設(shè)門，M2單核細(xì)胞分析CD163+CD204+雙陽性細(xì)胞，M1單核細(xì)胞分析CD163-CD86+細(xì)胞，見圖1（a）。結(jié)果顯示乳腺癌患者外周血CD14+CD163+CD204+的M2單核細(xì)胞（5.88±1.31）較體檢健康者（3.70±1.00）增加（p＜0.05），見圖1（b）。乳腺癌患者外周血CD14+CD163-CD86+的M1單核細(xì)胞（27.89±5.69）較體檢健康者（33.83±5.80）減少（p＜0.05），見圖1（c）。

圖1 乳腺癌患者及體檢健康者外周血M2、M1單核細(xì)胞的表達(dá)

2.2 乳腺癌患者與體檢健康者外周血M2/M1單核細(xì)胞比例、CEA及CA15-3差異的分析

基于M2單核細(xì)胞與M1單核細(xì)胞之間存在動態(tài)轉(zhuǎn)換，本研究進(jìn)一步分析了外周血M2/M1單核細(xì)胞比例變化。發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者與體檢健康者外周血M2/M1單核細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.001）。同步分析了血漿CEA、CA15-3的水平差異，發(fā)現(xiàn)CA15-3在乳腺癌患者與體檢健康者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），而CEA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表1。

圖2 各組M2/M1單核細(xì)胞比例與血清CEA、CA15-3水平的比較

表1 乳腺癌患者與體檢健康者M(jìn)2/M1單核細(xì)胞比例等指標(biāo)的比較

2.3 M2/M1單核細(xì)胞比例的ROC曲線分析

經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，外周血M2/M1單核細(xì)胞比例所對應(yīng)的ROC曲線的曲線下面積大于CEA和CA15-3。見圖3。

圖3 M2/M1單核細(xì)胞比例、CEA和CA15-3診斷乳腺癌的ROC曲線

3 討論

惡性腫瘤的進(jìn)展是一個極其復(fù)雜的多步驟、多因素過程，越來越多的數(shù)據(jù)證明，在實(shí)體瘤的微環(huán)境中浸潤了大量TAM。TAM具有明顯的表型可變性和功能多樣性。在乳腺腫瘤微環(huán)境中，TAM極化成經(jīng)典激活的M1型巨噬細(xì)胞和選擇性激活的M2型巨噬細(xì)胞[9]。有研究提示隨著腫瘤進(jìn)展，TAM以M2型為主，主要發(fā)揮抑制炎癥，促進(jìn)組織修復(fù)及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等作用[3]。既往認(rèn)為血液中的單核細(xì)胞進(jìn)入組織轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞后，一般不再返回血液循環(huán)，但近年來發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的TAM能夠進(jìn)入外周血，引起外周血該類細(xì)胞的增加，鑒于TAM的不同極化類型與腫瘤的密切關(guān)系，分析外周血單核細(xì)胞極化差異很可能成為一種新的腫瘤診斷指標(biāo)。前期研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌患者外周血中以M2單核細(xì)胞為主，M2單核細(xì)胞能夠作為一種診斷實(shí)體瘤的生物標(biāo)志物[10，7]。最新研究提示乳腺癌外周血同樣以M2單核細(xì)胞為主[11]，但現(xiàn)有的關(guān)于TAM表型的臨床數(shù)據(jù)非常有限，鮮有報道分析外周血M1單核細(xì)胞的表達(dá)情況以及M2與M1單核細(xì)胞比例的動態(tài)轉(zhuǎn)化。根據(jù)TAM 2種極化狀態(tài)可因環(huán)境的改變而相互轉(zhuǎn)換的特性，本研究綜合分析M2/ M1單核細(xì)胞比例變化在乳腺癌患者與體檢健康者之間的差異。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者外周血M2/M1單核細(xì)胞比例（0.166±0.110）明顯高于體檢健康者（0.090±0.032）（p＜0.001）。

目前，已知CEA和CA15-3是診斷乳腺癌的常用腫瘤標(biāo)志物，但由于敏感性和特異性較低，CEA與CA15-3并不適合應(yīng)用于乳腺癌的早期診斷[12-13]。本研究結(jié)果表明，乳腺癌患者血漿CA15-3水平高于體檢健康者，而CEA水平在乳腺癌患者和體檢健康者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究將M2/M1單核細(xì)胞比例數(shù)據(jù)與CEA、CA15-3表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)M2/M1單核細(xì)胞比例對于乳腺癌的診斷價值優(yōu)于CEA及CA15-3。因此，就診斷乳腺癌而言，外周血M2/M1單核細(xì)胞比例的診斷潛能要優(yōu)于CEA和CA15-3。

本研究結(jié)果表明，外周血M2/M1單核細(xì)胞比例可能作為一種非創(chuàng)傷性的新的診斷乳腺癌的腫瘤標(biāo)志物。然而本研究仍然存在一些不足之處：首先，外周血M2、M1單核細(xì)胞所選擇的表型標(biāo)志物有限，本研究僅選擇CD163+CD204+來反映M2單核細(xì)胞的表達(dá)情況，選擇CD163-CD86+來反應(yīng)M1單核細(xì)胞的表達(dá)情況；其次，本研究選取的樣本量較少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來驗(yàn)證本研究的結(jié)果。

從外周血中發(fā)現(xiàn)敏感、特異的腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤的早期診斷是近年腫瘤診斷學(xué)的一個熱點(diǎn)。本研究用流式細(xì)胞術(shù)比較了外周血M2/M1單核細(xì)胞比例在乳腺癌患者和體檢健康者間的表達(dá)差異，并用ROC曲線評價其診斷性能，同時與臨床較常用的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行了比較分析。結(jié)果提示M2/M1單核細(xì)胞比例是一種十分有效的乳腺癌循環(huán)腫瘤標(biāo)志物，但其臨床應(yīng)用價值還需結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行更深入的評價。

[1]DESANTIS C， MA J， BRYAN L， et al. Breast cancer statistics， 2013[J]. CA Cancer J Clin，2014， 64（1）： 52-62.

[2]DUFFY M J， WALSH S， MCDERMOTT E W， et al.Biomarkers in breast cancer： where are we and where are we going?[J]. Adv Clin Chem， 2015， 71： 1-23.

[3]SICA A， LARGHI P， MANCINO A， et al.Macrophage polarization in tumour progression[J].Semin Cancer Biol， 2008， 18（5）： 349-355.

[4]ZHANG G， GUO L， YANG C， et al. A novel role of breast cancer-derived hyaluronan on inducement of M2-like tumor-associated macrophages formation[J].Oncoimmunology， 2016， 5（6）： e1172154.

[5]ROUSSOS E T， BALSAMO M， ALFORD S K， et al. Mena invasive （MenaINV） promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer[J]. J Cell Sci， 2011， 124（Pt 13）： 2120-2131.

[6]ADAMS D L， MARTIN S S， ALPAUGH R K，et al. Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2014， 111（9）： 3514-3519.

[7]LI C， LUO X， LIN Y， et al. A higher frequency of CD14+ CD169+ monocytes/macrophages in patients with colorectal cancer[J]. PLoS One，2015， 10（10）： e0141817.

[8]JONES K， VARI F， KEANE C， et al. Serum CD163 and TARC as disease response biomarkers in classical Hodgkin lymphoma[J]. Clin Cancer Res，2013， 19（3）： 731-742.

[9]陸寧，佟仲生. 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在乳腺癌中的研究進(jìn)展[J]. 國際免疫學(xué)雜志，2014，37（2）：122-125.

[10]MAEDA R， ISHII G， NERI S， et al. Circulating CD14+CD204+ cells predict postoperative recurrence in non-small-cell lung cancer patients[J]. J Thorac Oncol， 2014， 9（2）： 179-188.

[11]ZHANG B， CAO M， HE Y， et al. Combination of plasma HA and circulating M2-like monocytes may serve as a diagnostic marker for breast cancer[J]. J Cancer， 2017， 8（17）： 3522-3530.

[12]MIRABELLI P， INCORONATO M. Usefulness of traditional serum biomarkers for management of breast cancer patients[J]. Biomed Res Int， 2013，2013： 685641.

[13]陳彼得，吳三綱，何振宇，等. 術(shù)前CEA和CA15-3對乳腺癌的臨床應(yīng)用價值[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20（8）：1610-1613.