， ， ， [陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第二附屬醫(yī)院骨科，重慶 400037]

鉛是一種在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用的重金屬毒物，可對包括血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等各組織器官造成損傷[1]。有研究表明，骨骼同樣是鉛中毒的重要靶器官，鉛可對動物成骨細胞功能造成損害，鉛中毒還可導致兒童血清中骨鈣素的水平下降[2]。成骨細胞是參與骨骼形成的主要細胞,對體內(nèi)骨組織生長與發(fā)育、骨代謝的平衡以及損傷修復發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]，成骨細胞過度凋亡，會影響骨骼修復，甚至進而導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生[4]。

線粒體是細胞內(nèi)重要的細胞器，對細胞內(nèi)的能量代謝、離子平衡以及對外界因素的應激方面發(fā)揮著重要的作用。因此，線粒體也是諸多外源性化合物最為敏感的靶點，尤其是在氧化損傷最主要的靶細胞器[5-7]。為研究鉛對成骨細胞損傷的作用與機制，本研究通過對MC3T3-E1細胞染毒后培養(yǎng)，觀察并測定線粒體形態(tài)與功能變化，為揭示鉛對骨骼發(fā)揮毒性的機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及配制

醋酸鉛[Pb(Ac)2，分析純]購買于上?；瘜W試劑四廠，MC3T3-E1細胞株購買于中科院上海細胞庫，BCA蛋白濃度試劑盒、三磷酸腺苷(ATP)試劑盒、JC-1線粒體膜電位試劑盒、細胞色素c試劑盒購買于碧云天生物技術(shù)研究所。CCK-8細胞增殖毒性試劑盒購買于東仁化學科技公司。DMEM培養(yǎng)基購買于Hyclone公司。胎牛血清購買于Gibco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)MC3T3-E1細胞采用的DMEM培養(yǎng)基含體積分數(shù)10%的FBS、100 ku/L的青霉素和100 mg/L的鏈霉素，細胞培養(yǎng)箱參數(shù)為37 ℃，CO2體積分數(shù)5%。

1.2.2 CCK-8細胞增殖毒性檢測試驗分析細胞存活率 取生長良好的MC3T3-E1細胞，按2×104個/孔接種至96孔板中，分為對照組(Control組，不作任何處理)，醋酸鉛組(Pb組，加入醋酸鉛溶液，使培養(yǎng)液中醋酸鉛最終濃度分別為0、1、10、100 μmol/L)，每組分別設置5個復孔，分組后，將細胞置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后加入含10 μL CCK-8的培養(yǎng)液100 μL，孵育1 h，450 nm波長測量OD值進而計算細胞存活率。

1.2.3 細胞提取液制備 取生長良好的MC3T3-E1細胞按106個/瓶接種至100 mL培養(yǎng)瓶，分組與1.2.2項下相同，細胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液吸取備用。細胞經(jīng)過胰酶消化后收集至吸取的培養(yǎng)液中。經(jīng)過600 g 4 ℃ 5 min離心后收集細胞，去上清，用PBS洗滌1次，再去上清，按照100 μL裂解液每200萬細胞的比例加裂解液，經(jīng)重懸沉淀后，冰浴裂解15 min，經(jīng)4 ℃ 16 000～20 000 g 15 min離心后，吸取上清部分，BCA方法測得蛋白濃度后于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細胞線粒體膜電位的檢測 取生長良好的MC3T3-E1細胞(細胞密度8×104個/mL)收集于6孔板中，培養(yǎng)過夜細胞貼壁后，按照1.2.2項下實驗分組分別進行加藥。實驗期滿后，加入JC-1探針，共同孵育20 min后用JC-1緩沖液洗滌2次。當線粒體膜電位處于較高水平時，JC-1熒光探針主要聚集在線粒體的基質(zhì)當中，形成聚合物，從而產(chǎn)生紅色熒光；當線粒體膜電位處于較低水平時，JC-1熒光探針大部分不能聚集在基質(zhì)中，難以形成聚合物，因而JC-1單體產(chǎn)生綠色熒光。因此，可以使用TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡通過檢測紅色與綠色熒光比例的增減來反映線粒體膜電位的變化。具體操作步驟按試劑盒(碧云天)說明書執(zhí)行。

1.2.5 細胞ATP含量測定 ATP含量的測定通過ATP含量試劑盒(碧云天)完成，利用Tecan熒光酶標儀對結(jié)果進行檢測，具體操作步驟按試劑盒(碧云天)說明書執(zhí)行。

1.2.6 細胞色素c含量測定 首先通過細胞線粒體分離試劑盒(碧云天)分離出線粒體和漿蛋白。然后將線粒體和漿蛋白分別溶解于裂解緩沖液之中，用BCA方法分別測定對應的蛋白濃度。利用ELISA試劑盒(碧云天)，分別檢測線粒體和漿蛋白中細胞色素c的含量，具體操作步驟按試劑盒(碧云天)說明書執(zhí)行。

1.2.7 Caspases-3活性檢測 Caspases-3的活性通過Caspase-3活性檢測試劑盒完成。與前述方法相同，先制備各組的細胞裂解液，并通過BCA方法測定對應的蛋白濃度。催化底物Ac-DEVD-ρNA產(chǎn)生黃色的ρNA，之后用酶標儀通過測量405 nm處的吸光度，反映Caspases-3的活性。

1.2.8 透射電鏡觀察線粒體形態(tài) 取生長良好的MC3T3-E1細胞按2×105個/孔接種于100 mL培養(yǎng)皿中，采用與1.2.2相同分組，細胞于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，分別將細胞移入離心管中300 g離心5 min，棄上清，4 ℃預冷PBS漂洗1次。樣品經(jīng)固定、脫水、浸透、包埋、切片、染色等步驟后通過透射電鏡觀察線粒體形態(tài)的改變。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 鉛暴露對線粒體膜電位及ATP合成的影響

如圖1所示，MC3T3-E1細胞暴露于(0、1、10 μmol/L)醋酸鉛溶液24 h后，與對照組(Control)相比，各暴露組[Pb(1)，Pb(10)，Pb(100)]線粒體膜電位去極化程度顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明線粒體膜電位降低，且體現(xiàn)出明顯的劑量依賴性；同樣，ATP含量測量顯示，與對照組相比，各暴露組[Pb(1)、Pb(10)、Pb(100)]的ATP合成顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且隨著醋酸鉛濃度增高，ATP合成量下降更為顯著。本結(jié)果表明鉛暴露24 h后引起MC3T3-E1細胞線粒體膜電位的降低，ATP合成減少。

a:JC-1探針標記后，綠色熒光與紅色熒光的比例來反映線粒體膜電位去極化的程度(n=5)；b:利用ATP含量測定試劑盒(碧云天)進行ATP含量測定(n=5) *:與對照組相比，P<0.05

圖1鉛暴露對線粒體膜電位及ATP合成的影響

2.2 鉛暴露對線粒體細胞色素c含量的影響

分離細胞胞漿和線粒體，分別檢測胞漿和線粒體內(nèi)細胞色素c的含量。如圖2所示，MC3T3-E1細胞暴露于各濃度醋酸鉛溶液24 h后，與對照組相比，各暴露組[Pb(1)，Pb(10)，Pb(100)]的胞漿內(nèi)細胞色素c含量顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而線粒體內(nèi)細胞色素c含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明鉛暴露24 h后引起MC3T3-E1細胞內(nèi)細胞色素c從線粒體到胞漿的釋放增加。

a:胞漿內(nèi)細胞色素c的含量(n=5)；b:線粒體內(nèi)細胞色素c的含量(n=5) *:與對照組相比，P<0.05

圖2鉛暴露對線粒體細胞色素c含量的影響

2.3 鉛暴露對線粒體形態(tài)及Caspase-3活性的影響

透射電鏡結(jié)果顯示，MC3T3-E1細胞暴露于100 μmol/L醋酸鉛溶液[Pb(100)]24 h后，與對照組相比，線粒體明顯腫脹，細胞核邊集，細胞出現(xiàn)凋亡，見圖3。

圖3 鉛暴露對細胞線粒體形態(tài)的影響

利用對應試劑盒(碧云天)進行Caspase-3活性測量結(jié)果顯示，MC3T3-E1細胞暴露于各濃度醋酸鉛溶液24 h后，與對照組相比，各暴露組[Pb(1)，Pb(10)，Pb(100)]的Caspase-3活性顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，說明鉛暴露24 h后引起MC3T3-E1細胞凋亡增加，且隨著劑量的增大，凋亡程度增加，見圖4。

*：與對照組相比，P<0.05

3 討論

鉛是一種廣泛應用于工業(yè)與生活的的重金屬毒物，鉛暴露對骨骼的毒性一直以來沒有得到確切的證實。近年來，越來越多的研究顯示，骨骼也是鉛發(fā)揮其毒性作用的重要靶器官,鉛暴露可直接地或間接地改變骨骼各細胞功能[8-9]。目前，一般認為細胞凋亡途徑主要包括線粒體介導的細胞內(nèi)途徑、死亡受體介導的細胞外途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑。有研究認為，鉛可通過激活c-JUN氨基末端活化蛋白激酶(JNK)信號通路與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路誘導大鼠肝內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和氧化應激，也可引起星形膠質(zhì)細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[10-12]；鉛暴露可引起PC12細胞發(fā)生凋亡，其凋亡機制可能與死亡受體介導的細胞外途徑有關(guān)；關(guān)于造血干細胞和睪丸支持細胞的研究則證明了醋酸鉛暴露可導致線粒體的結(jié)構(gòu)與功能損傷，表明鉛具有明顯的線粒體毒性[13]。但在成骨細胞上，鉛暴露引起線粒體損傷從而導致細胞凋亡的研究鮮有報道。

線粒體作為細胞能量與代謝的中心，控制著細胞內(nèi)呼吸鏈和氧化磷酸化，也在細胞凋亡與信號轉(zhuǎn)導的過程中發(fā)揮著重要的作用。許多關(guān)于細胞凋亡調(diào)控機制的研究認為，線粒體的結(jié)構(gòu)與功能障礙是多種刺激因素誘導細胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵事件，線粒體內(nèi)的凋亡誘發(fā)因子因此釋放，從而對細胞凋亡進行調(diào)控[14]。本研究通過研究MC3T3-E1細胞暴露于各濃度醋酸鉛溶液后線粒體相關(guān)功能及細胞狀態(tài)的變化，進一步在細胞水平上證實了鉛暴露對成骨細胞的毒性。后續(xù)通過測量線粒體膜電位去極化程度與ATP合成量，胞漿與線粒體內(nèi)細胞色素c含量以及Caspase-3活性，并結(jié)合透射電鏡觀察細胞線粒體形態(tài)變化，探究了鉛對成骨細胞損傷的一種可能機制。

本研究通過線粒體膜電位與ATP合成量檢測證明了鉛暴露可致成骨細胞MC3T3-E1線粒體膜電位降低，ATP合成減少。線粒體作為細胞凋亡的控制中心，線粒體功能障礙可誘導細胞凋亡級聯(lián)反應的發(fā)生。大量研究表明，線粒體膜的去極化是細胞凋亡早期的重要事件[15-16]。線粒體膜上的凋亡相關(guān)蛋白通過控制線粒體膜的通透性，從而可以調(diào)控線粒體內(nèi)的促凋亡因子如細胞色素c等的釋放，進而可通過激活Caspase途徑誘導細胞凋亡。本研究通過測得胞漿內(nèi)細胞色素c的含量顯著上升而線粒體內(nèi)細胞色素c的含量顯著下降，證明細胞內(nèi)細胞色素c從線粒體到胞漿的釋放增加。線粒體跨膜電位的去極化、ATP合成減少、線粒體腫脹及線粒體內(nèi)膜的嵴減少或消失都會誘導細胞色素c以及相關(guān)凋亡因子從線粒體釋放至細胞漿，本研究的超微病理結(jié)果顯示，高濃度鉛暴露組線粒體出現(xiàn)明顯腫脹，也進一步證明了此結(jié)論。目前的研究普遍認為，細胞色素c是線粒體在細胞凋亡過程中釋放的重要凋亡因子，線粒體釋放到膜外的細胞色素c，在ATP/dATP的參與下可以和Apaf-1結(jié)合，從而使Apaf-1的構(gòu)象發(fā)生改變，繼而使Apaf-1寡聚化[17]；Apaf-1氨基端和Caspase-9前體結(jié)合，可形成分子量為700～1 400 kD的“凋亡小體”，并在胞漿中的dATP的作用下進一步使Caspase-9復合體發(fā)生自發(fā)激活?；罨蟮腃aspase-9能繼續(xù)激活作為細胞凋亡執(zhí)行者的Caspase-3，Caspase-3進而通過級聯(lián)反應，裂解特異性底物從而導致細胞凋亡。Caspase-3執(zhí)行細胞凋亡信號，介導執(zhí)行觸發(fā)細胞凋亡的多種因素。同時，Caspase-3與細胞凋亡時的一些特征標志，如DNA的片段化以及染色體凝聚等，也有著直接的關(guān)系[18]。本研究中測得的Caspase-3活性結(jié)果也證實了暴露組線粒體損傷更為嚴重，細胞色素c釋放量更多，進而Caspase-3活性更高，從而導致細胞凋亡程度更為嚴重。

綜上所述，本研究探究了鉛暴露導致成骨細胞凋亡的一種可能機制——鉛暴露可導致成骨細胞線粒體膜電位降低、ATP合成減少，導致細胞色素c釋放量增加，Caspase-3活性增加，進而誘導細胞凋亡。

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