劉孝德 張鵬

膀胱癌發(fā)病率高居我國(guó)泌尿系統(tǒng)腫瘤第一位。2015年我國(guó)膀胱癌新發(fā)病例8.05萬(wàn)，死亡病例3.29萬(wàn)[1]。膀胱癌的病因復(fù)雜，既涉及外在環(huán)境因素，例如飲食、吸煙及接觸致癌物質(zhì)等[2-3]，又涉及內(nèi)在遺傳因素，例如基因多態(tài)性。基因多態(tài)性是指隨機(jī)婚配的群體中，不同個(gè)體間同一基因位點(diǎn)存在兩種或多種不連續(xù)的基因型。按照被關(guān)注的前后順序，通常分為三大類：DNA重復(fù)序列多態(tài)性、長(zhǎng)度多態(tài)性和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)。SNP是指基因組序列中單堿基變異造成的序列多態(tài)性，在人類基因組中廣泛存在。SNP在不同人群和不同疾病狀態(tài)中分布不同，其對(duì)研究疾病病因、病理進(jìn)程和預(yù)后等具有重要的指導(dǎo)意義。

microRNA(miRNA)是長(zhǎng)度約為18～24個(gè)核苷酸的微小RNA，本身不編碼蛋白質(zhì)，但是可通過(guò)靶向mRNA發(fā)揮基因調(diào)控功能，參與多種腫瘤包括膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)研究證實(shí)，膀胱癌中miR-143和miR-145呈顯著低表達(dá)[4-6]。人類miR-143和miR-145以簇的形式存在，具有共同的啟動(dòng)子區(qū)。最近有報(bào)道稱，miR-143/145啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)rs4705341與中國(guó)人群結(jié)直腸癌的發(fā)病相關(guān)[7]。本研究選取青海地區(qū)漢族人群作為研究對(duì)象，運(yùn)用病例-對(duì)照方法探討rs4705341多態(tài)性與膀胱癌易感性的關(guān)系。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

病例組由我院泌尿外科收治的106例膀胱癌患者組成，入組病例術(shù)前未接受放化療，術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為膀胱癌。對(duì)照組為162例同時(shí)期于我院行健康體檢者，經(jīng)B超檢查證實(shí)膀胱無(wú)異常。所有研究對(duì)象均為漢族，均否認(rèn)腫瘤家族史，無(wú)生物學(xué)親緣關(guān)系。使用乙二胺四乙酸鈉抗凝管采集所有研究對(duì)象外周靜脈血2～3 ml，-20 ℃保存。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

病例組和對(duì)照組研究對(duì)象平均年齡分別為(58.8 ±9.7)歲和(57.1±10.0)歲。兩組男女性別比一致，約為3∶2。年齡和性別分布上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.16和0.21)。病例組中，40.6%患者為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，45.3%患者為低分級(jí)膀胱癌。病例組和對(duì)照組研究對(duì)象一般情況見(jiàn)表1。

表1 病例組和對(duì)照組研究對(duì)象一般情況比較 [均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n(%)]

項(xiàng)目對(duì)照組病例組P值年齡 (歲)57.1±10.058.8±9.70.16性別 男93(57.4)69(65.1)0.21 女69(42.6)37(34.9)膀胱癌浸潤(rùn)程度 非肌層浸潤(rùn)性43(40.6) 肌層浸潤(rùn)性63(59.4)膀胱癌惡性程度 低分級(jí)48(45.3) 高分級(jí)58(54.7)

二、基因分型

應(yīng)用北京百泰克公司DNA抽提試劑盒提取全血基因組DNA。運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性檢測(cè) rs4705341 基因型，參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]合成引物(上海生工生物工程有限公司)：上游：5’-CCTCGGCTTCCCAAAGTGATC-3’,下游：5’- TCCCAGCCAGATAACTGCTTTCC-3’。反應(yīng)體系如下：2×PCR反應(yīng)混合物5 μl，上、下游引物混合物10 μmol/L，DNA模板1 μl，加超純水至10 μl。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由限制性內(nèi)切酶 Bcl Ⅰ(NEB公司，美國(guó))于50 ℃水浴孵育過(guò)夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。rs4705341 A等位基因有一個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生2個(gè)片段，分別為106 bp和17 bp；rs4705341 G等位基因無(wú)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，酶切后僅有1個(gè)123 bp片段。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。病例組和對(duì)照組年齡分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異比較采用t檢驗(yàn)。哈迪-溫伯格平衡和rs4705341多態(tài)性相關(guān)性比較采用χ2檢驗(yàn)。非條件logistic回歸模型計(jì)算調(diào)整年齡和性別后優(yōu)勢(shì)比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

檢測(cè)到miR-143/145啟動(dòng)子區(qū) rs4705341 三種基因型，分別為AA、AG和GG(圖1)，其在病例組和對(duì)照組中的分布頻率均符合哈迪-溫伯格平衡，P值分別為0.81和0.14。rs4705341 GG基因型在病例組中的頻率(8.5%)明顯低于對(duì)照組(19.1%)，經(jīng)年齡和性別調(diào)整后，OR值為0.34，95%CI：0.15～0.78，P值為0.007。等位基因?qū)Ρ戎幸嘤^察到rs4705341降低膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)(G與A對(duì)比：OR=0.60，95%CI：0.41～0.87，P=0.007)。見(jiàn)表2。分層分析顯示，rs4705341與膀胱癌浸潤(rùn)程度和惡性程度不存在相關(guān)性。

圖1 rs4705341電泳圖

表2 miR-143/145啟動(dòng)子區(qū)rs4705341與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系 [n(%)]

討 論

膀胱癌的發(fā)生發(fā)展不僅與編碼基因的激活或失活有關(guān)，而且與非編碼RNA的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。miRNA是一類長(zhǎng)約18～24個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，在膀胱癌中存在差異性表達(dá)，例如miR-143和miR-145可通過(guò)調(diào)控多條細(xì)胞信號(hào)途徑抑制膀胱癌的發(fā)生[4-6]。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均顯示，過(guò)表達(dá)miR-143或miR-145可靶向結(jié)合多個(gè)靶基因抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)裸鼠生存時(shí)間，并增加細(xì)胞對(duì)順鉑和吉西他濱等化療藥物的敏感性[8-13]。由此認(rèn)為，miR-143和miR-145有望成為膀胱癌新的治療靶點(diǎn)。

然而，并非所有低表達(dá)miR-143和/或miR-145的個(gè)體均能罹患膀胱癌，提示miR-143/145相關(guān)的SNP可能是不同個(gè)體不同易感性的原因之一。以往研究顯示，SNP不僅與膀胱癌的易感性、藥物的敏感性有關(guān)，而且與膀胱癌的分期分級(jí)等臨床特征相關(guān)[14-15]，已成為種群遺傳分析、疾病易感性和藥物研發(fā)等研究領(lǐng)域中的重要遺傳標(biāo)志。最近有報(bào)道顯示，位于miR-143/145啟動(dòng)子區(qū)的SNP rs4705341 GG基因型攜帶者患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)下降0.66倍，并且預(yù)示有更長(zhǎng)的總體生存期[7]。與該研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs4705341 GG基因型的個(gè)體患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)降低了0.34倍，等位基因?qū)Ρ戎幸喟l(fā)現(xiàn)該保護(hù)效應(yīng)，提示rs4705341 GG基因型可能是膀胱癌發(fā)病的一個(gè)保護(hù)因素。

對(duì)于其可能的機(jī)制，有研究應(yīng)用TRANSFAC軟件預(yù)測(cè)rs4705341與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)rs4705341 G等位基因可與轉(zhuǎn)錄因子GAL4結(jié)合，而A等位基因則不能。GAL4與抑癌基因p53具有相似的酸性結(jié)構(gòu)域，兩者重組為融合蛋白可激活p53第20～40密碼子，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[16]。由此推測(cè)，rs4705341 GG基因型降低膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的可能機(jī)制是G等位基因結(jié)合了轉(zhuǎn)錄因子GAL4，促進(jìn)miR-143和/或miR-145的轉(zhuǎn)錄，使得miR-143和/或miR-145表達(dá)量增加，發(fā)揮抑癌作用。其準(zhǔn)確機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究初步證實(shí)miR-143/145啟動(dòng)子區(qū)rs4705341 GG基因型攜帶者具有更低的膀胱癌患病風(fēng)險(xiǎn)。但是，由于本研究樣本量較小，研究對(duì)象均為漢族個(gè)體，且地域來(lái)源單一等，可能存在一定偏倚，有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量減少偏倚，以驗(yàn)證本研究結(jié)果。

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