張凱，徐東平，陳容娟，趙麗，劉璐潔，林亞云，李奇，思蘭蘭，李曉東，李進(jìn)，藺淑梅，劉妍

我國約有9 300萬慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者，每年有近30萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化(LC)和肝細(xì)胞癌(HCC)[1-2]。乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是診斷HBV感染、判斷抗HBV療效的重要指標(biāo)，但有部分HBV感染者血清HBsAg陰性，而血清和(或)肝組織中可以檢測到HBV DNA，被稱為隱匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)[3]。OBI與HBV漏診、輸血傳播、乙肝再激活等密切相關(guān)。既往研究顯示HBV S基因突變與一部分OBI發(fā)生密切相關(guān)[4-5]。HBsAg由HBV S基因編碼，其主要親水區(qū)(major hydrophilic region，MHR)是中和抗體作用的主要靶區(qū)域，對HBsAg抗原性具有重要意義，已發(fā)現(xiàn)的OBI相關(guān)免疫逃逸突變多位于MHR[6-7]，目前國內(nèi)外已報道的主要OBI相關(guān)MHR免疫逃逸突變達(dá)數(shù)10種。本課題組前期從1例OBI患者、3例OBI獻(xiàn)血員血清中鑒定了9種代表性MHR免疫逃逸突變株，體外實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)這9種突變HBsAg的抗原性較野生型HBsAg的抗原性明顯降低，是引起OBI表現(xiàn)的主要原因之一，并證實(shí)突變HBsAg影響當(dāng)前HBsAg臨床診斷試劑的檢出能力[8-9]。OBI呈全球性分布，目前已報道的OBI主要見于獻(xiàn)血員、HCV或HIV等共感染、免疫受抑制者及健康人群等，大樣本研究主要集中于獻(xiàn)血員，關(guān)于大樣本臨床肝病患者中OBI檢出率少見報道。本研究回顧性分析11 650例肝病患者，探討肝病患者OBI的檢出率以及其HBV S基因MHR免疫逃逸突變特點(diǎn)，并與低滴度、中高滴度HBsAg的慢性乙型肝炎(CHB)患者中檢出的MHR免疫逃逸突變進(jìn)行對比分析。

1 資料與方法

1.1 研究對象 借助本課題組建立的涵蓋多種肝臟疾病的HBV基因數(shù)據(jù)庫，回顧性分析于2007年7月－2011年8月在解放軍302醫(yī)院就診并進(jìn)行HBV DNA直接測序的11 650例肝病患者樣本，調(diào)取所有樣本對應(yīng)的臨床診療資料及HBV直接測序信息。OBI診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2008年歐洲肝臟研究學(xué)會(EASL)在意大利發(fā)布的專家共識[3]，即指通過現(xiàn)有技術(shù)檢測血清HBsAg陰性，但血清和(或)肝組織HBV DNA陽性，由于缺乏肝組織HBV DNA檢測，該回顧性研究只分析了血清HBsAg陰性、血清HBV DNA陽性的OBI患者。CHB、HCV感染、LC、HCC等診斷按照我國相關(guān)最新指南和診療規(guī)范的診斷標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[2,10-11]。

1.2 篩選方法 本研究從HBV基因數(shù)據(jù)庫篩選有血清HBsAg檢測結(jié)果的患者，調(diào)取血清HBsAg陰性、HBV DNA陽性人群即OBI患者的基本臨床資料以及HBV血清學(xué)檢測結(jié)果，并查找已成功測序的HBV S基因序列，鑒定基因型；同時篩選具有低滴度(5IU/ml≤HBsAg≤50IU/ml)、中高滴度(HBsAg ≥400IU/ml)HBsAg并已成功測序的患者，排除合并LC、HCC、HCV感染等疾病的患者，鑒定基因型，選擇年齡、性別、基因型與OBI組相匹配的CHB患者作為對照組，對比OBI組與兩組不同HBsAg滴度的CHB患者M(jìn)HR突變檢出情況。

1.3 基因型鑒定 根據(jù)所測定的HBV S基因序列，應(yīng)用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行遺傳距離分析，鑒定基因型。

1.4 HBV S基因MHR序列分析 用MegAlign軟件分析直接測序獲得的HBV S基因核酸序列，比對并鑒定MHR免疫逃逸突變，目前國內(nèi)外已報道的主要OBI相關(guān)MHR免疫逃逸突變見表1。HBV標(biāo)準(zhǔn)序列(序列號：AY217378C1、AF458664C2、X75656C3、AB048704C4、D00329B1、AB073823B2、AB033554B3、AB073835B4)來自于NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpagex.cgi)。

表1 文獻(xiàn)報道的主要OBI相關(guān)HBV S基因MHR免疫逃逸突變[8,12]Tab.1 Previously reported major HBV S-gene MHR immune-escape mutations associated with OBI[8,12]

1.5 血清HBV標(biāo)志物定性及HBsAg與HBV DNA定量檢測 均送往我院檢驗科完成。采用Roche公司Elecsys定性試劑檢測血清HBV標(biāo)志物，采用HBsAg Elecsys定量試劑檢測血清HBsAg(檢測下限為0.05IU/ml)；采用實(shí)時熒光定量PCR檢測血清HBV DNA(檢測下限為40IU/ml)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床大樣本肝病患者中OBI的檢出率 11 650例肝病患者中共計6996例患者進(jìn)行血清HBsAg定量檢測，其中5752例血清HBV DNA陽性，從中篩出血清HBsAg陰性且HBV DNA陽性的OBI患者12例，因此OBI檢出率為0.172%(12/6996)。同時分別篩選出年齡、性別、基因型與OBI組相匹配的低滴度和中高滴度HBsAg并有直接測序結(jié)果的CHB患者32例和50例作為對照組。詳細(xì)篩選流程見圖1。

2.2 OBI患者基本特征 12例OBI患者的血清抗-HBc均為陽性，其中8例伴抗-HBs陽性，3例伴抗-HBe陽性。有1例患者(P9)為HCV感染相關(guān)LC患者，該患者于30年前患急性乙肝；11例既往為CHB患者。有7例患者既往服用包括阿德福韋酯和拉米夫定在內(nèi)的NAs進(jìn)行抗病毒治療。12例OBI患者基本資料見表2。

圖1 OBI患者篩選流程圖Fig.1 Flow chart of OBI patient selection

表2 12例OBI患者基本資料Tab.2 Basic information of 12 OBI patients

2.3 OBI患者與CHB患者M(jìn)HR免疫逃逸突變對比

12例OBI患者中有8例直接測序成功，且此8例既往均被診斷為CHB，其中6例檢出存在HBV S基因MHR免疫逃逸突變(75%，6/8)；低滴度HBsAg組共有8例檢測出MHR突變(25%，8/32)，結(jié)合表1顯示包括經(jīng)典突變sG145R在內(nèi)的9種是已報道的OBI相關(guān)MHR突變；中高滴度HBsAg組共有20例存在MHR突變(40%，20/50)，主要突變包括sL110I、sT113S、sS143T、sR160K和sF161Y，除sS143T外均不是已報道且公認(rèn)的OBI相關(guān)突變。將8例(P2-P8、P12)已成功測序的OBI患者與低滴度HBsAg組和中高滴度HBsAg組的CHB患者臨床資料及MHR突變信息進(jìn)行對比分析，OBI組均為C基因型，低滴度HBsAg組B、C基因型分別為4例(4/32)和28例(28/32)，中高滴度HBsAg組B、C基因型分別為9例(9/50)和41例(41/50)。3組患者服用NAs抗HBV治療人數(shù)比例分別為62.50%、56.25%和70.00%(P=0.453)，MHR突變率分別為75.00%、25.00%和40.00%(P=0.029，表3)。

表3 OBI與不同滴度HBsAg的CHB患者M(jìn)HR免疫逃逸突變檢出情況Tab.3 Detection of MHR immune-escape mutations in OBI and CHB patients with different HBsAg levels

3 討 論

OBI呈全球性分布[4,7,13]，截至目前HBV高、低流行區(qū)域均報道有OBI檢出，但其流行情況報道差異較大，這與HBV流行地區(qū)、檢測方法、調(diào)查人群及調(diào)查時間段等有關(guān)。有研究報道OBI檢出率在獻(xiàn)血員中為0.002%～18.670%[7,14-18]，在HCV感染人群中為8.6%～39.2%[19-21]，還有HIV共感染、血液透析、接受經(jīng)免疫抑制劑或化療藥物治療及健康人群等也多檢出OBI。但目前缺乏關(guān)于肝病人群中OBI流行情況及與HBV S基因MHR免疫逃逸突變相關(guān)性等方面的臨床大樣本研究。

本研究在6996例肝病患者中檢出12例OBI患者，檢出率(0.172%，12/6996)明顯高于我國2015年以來獻(xiàn)血員人群的OBI發(fā)生率(0.015%～0.097%)[17,22-24]。如表2所示，本研究篩選出的OBI患者均與HBV感染相關(guān)。研究結(jié)果顯示數(shù)據(jù)庫中大樣本篩選出的OBI患者多數(shù)(7例，58.33%)是接受NAs藥物抗病毒治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰或發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者，病毒多呈低、中水平復(fù)制。從結(jié)果可以看出肝病患者OBI與獻(xiàn)血員OBI具有不同的特點(diǎn)，本研究中OBI患者的血清抗-HBc均為陽性，HBV DNA復(fù)制水平高于獻(xiàn)血員OBI，具有明確的HBV感染史，且多數(shù)經(jīng)歷過抗病毒等干預(yù)治療。需要注意的是，本研究納入的均為血清HBV DNA陽性樣本，已知血清HBV DNA呈間歇性出現(xiàn)，并且臨床上還存在一部分血清HBV DNA陰性但肝組織中HBV DNA陽性的OBI，因此整體肝病人群中的OBI檢出率可能會高于本研究結(jié)果。

近年來HBsAg清除或消失成為判斷HBV臨床治愈的主要指標(biāo)之一，HBV臨床治愈指持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答且HBsAg陰轉(zhuǎn)或伴有抗-HBs陽轉(zhuǎn)、ALT正常、肝組織學(xué)病變輕微或無病變[2]。本研究提示一部分“臨床治愈”的患者血清HBsAg陰性或低于檢測下限是一種假象，可能處于OBI狀態(tài)，病毒繼續(xù)復(fù)制，肝臟炎癥活動仍繼續(xù)，有不斷進(jìn)展甚至發(fā)生HCC的風(fēng)險，另外如果接受免疫抑制劑等治療或罹患其他疾病使免疫系統(tǒng)受到強(qiáng)烈抑制，HBV可再次被激活，因此建議對于治療后血清HBsAg陰性患者仍應(yīng)定期復(fù)查病毒學(xué)及肝臟炎癥活動相關(guān)指標(biāo)。

本研究中8例OBI患者HBV DNA測序成功，其中有6例發(fā)生MHR突變，涉及10個氨基酸(aa)位點(diǎn)，包括經(jīng)典免疫逃逸突變sG145R，由于該組樣本例數(shù)少，不能據(jù)此判定哪些突變與OBI相關(guān)，但結(jié)合表1匯總的已報道的主要OBI相關(guān)HBV S基因突變，認(rèn)為MHR突變sQ101R/H、sL109R、sG112K、sK122R、sI/T126S、sA128V、sM133I/T、sG145R和sE164D均可能與OBI發(fā)生相關(guān)。低滴度HBsAg組CHB患者中有8例檢出MHR突變，其中sL110I、sT113S、sS143T、sR160K和sF161Y最為多見；中高滴度HBsAg組CHB患者中有20例檢出MHR突變，主要的突變?yōu)榕c低滴度HBsAg組突變檢出情況一致，除sS143T突變外，其余4種突變均不是目前已報道的主要OBI相關(guān)MHR免疫逃逸突變，提示并非所有MHR突變均與OBI發(fā)生相關(guān)，推測不同MHR突變的機(jī)制及作用方向不同。

我國傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心對38 499例HBsAg陰性獻(xiàn)血員進(jìn)行的大樣本回顧性分析研究顯示，在OBI組、低滴度HBsAg組(0.05～100IU/ml)、高滴度HBsAg組(＞100IU/ml)MHR突變率分別為55.7%(34/61)、34.0%(52/153)和13.0%(7/54)，即隨著HBsAg滴度越高，突變率越低[7]。本研究中OBI與低滴度、中高滴度HBsAg的CHB患者M(jìn)HR突變率分別為75.00%、25.00%和40.00%，OBI組的MHR突變率明顯高于其他兩組(P=0.029)，而中高滴度HBsAg組MHR突變檢出率反而高于低滴度HBsAg組，與上述研究結(jié)果不完全一致。分析兩項研究結(jié)果不一致的原因除研究人群、HBsAg分層方法及樣本數(shù)量等因素外，其中一個重要的原因可能在于NAs抗病毒藥物的使用。

本研究中3組NAs藥物服用率分別為62.50%、56.25%、70.00%(P=0.453)，即3組中多數(shù)患者均進(jìn)行抗病毒治療。HBV S基因突變主要在自然條件、預(yù)防接種或抗病毒治療等條件下產(chǎn)生[4]。近期一項研究顯示NAs治療組免疫逃逸突變率明顯高于未治療組(24.4% vs. 10.9%，P＜0.05)，且11種聯(lián)合突變僅出現(xiàn)在NAs治療組，其中9種不伴隨耐藥突變，即免疫逃逸突變的出現(xiàn)不是因為耐藥突變所引起[25]。Lacombe等[26]學(xué)者在抗HBV治療隨訪過程中發(fā)現(xiàn)，HBV S基因相關(guān)疫苗逃逸突變株隨時間不斷穩(wěn)定增加。結(jié)合諸多學(xué)者的研究結(jié)論，我們考慮本研究中的HBV S基因MHR突變應(yīng)該主要是在NAs治療壓力條件下產(chǎn)生，因此CHB患者組也有較高的MHR突變檢出率。目前強(qiáng)效、高耐藥基因屏障的NAs仍是抗HBV的一線用藥，所以在抗病毒治療過程中尤其進(jìn)行長期NAs治療時應(yīng)關(guān)注HBV S基因突變及OBI的發(fā)生。

值得注意的是，OBI組的血清抗-HBs陽性率高達(dá)75.00%，明顯高于其他兩組CHB患者。這可能與突變HBsAg誘導(dǎo)產(chǎn)生低結(jié)合力的抗-HBs抗體，進(jìn)而產(chǎn)生位阻效應(yīng)干擾HBsAg檢測試劑檢測有關(guān)。近期我國一項研究納入兩組CHB患者，組Ⅰ為145例抗-HBs陽性的患者，組Ⅱ為141例血清抗-HBs陰性的患者，研究顯示組Ⅰ的“a”決定簇突變率明顯高于組Ⅱ(4.05% vs. 1.22%，P＜0.05)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)組Ⅰ中包括sG145R在內(nèi)的突變削弱了源于疫苗接種人群的抗-HBs抗體的中和能力[27]。

綜上所述，本研究中肝病患者OBI發(fā)生率高于近幾年報道的我國獻(xiàn)血人員的OBI發(fā)生率；多數(shù)OBI中檢出的MHR突變是已報道的OBI相關(guān)MHR免疫逃逸突變，其產(chǎn)生與NAs抗病毒藥物治療壓力關(guān)系密切，應(yīng)引起重視；OBI中檢出的MHR突變是已報道的OBI相關(guān)MHR免疫逃逸突變，而在不同HBsAg滴度的CHB患者中檢出的MHR突變大多不是已報道且公認(rèn)的OBI相關(guān)突變，提示并非所有的MHR突變均能引起OBI表現(xiàn)。

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