吳維峰，王瑾曄

（上海交通大學生物醫(yī)學工程學院，上海 200240）

0 引言

腫瘤治療一直是醫(yī)學領(lǐng)域關(guān)注的重點話題。隨著醫(yī)學技術(shù)的不斷發(fā)展，腫瘤治療方法不斷革新，從最初的手術(shù)切除發(fā)展到20世紀興起的放射療法和化學藥物治療。盡管這些都是腫瘤患者可以訴求的治療手段，但其自身的局限性也給患者帶來不少負面影響。比如，手術(shù)切除需要在病人身上打開大的“操作窗口”；放療和化療 “一視同仁”的特性會給人體正常組織帶來同等損傷。因此，發(fā)展一種無創(chuàng)、毒副作用小的治療手段成為一種迫切需求。

20世紀，納米技術(shù)和材料的興起極大地豐富和拓寬了人們對微觀領(lǐng)域的認識。人們不斷發(fā)展和構(gòu)建將納米科技用于腫瘤治療的新思路，開創(chuàng)出腫瘤治療的新技術(shù)或新方法，而光熱治療就是其中的一種[1-4]。

光熱治療以光響應(yīng)材料作為載體，在外源光的照射下，材料實現(xiàn)光能與熱能的相互轉(zhuǎn)化，能夠起到對機體組織“加熱”的作用。鑒于腫瘤細胞的熱耐受能力較正常組織差[5]，這樣可實現(xiàn)既殺死腫瘤細胞又不損傷正常組織的治療目的?？紤]到近紅外波段的光（650-950 nm）對生物組織有良好的穿透能力且損傷小[6]，利用近紅外光及其對應(yīng)的光響應(yīng)材料是目前光熱療法的主要實現(xiàn)方式。本文利用聚苯胺在近紅外區(qū)域的光吸收特性，以瘤內(nèi)注射的方式將水分散性聚苯胺顆粒注射到小鼠瘤內(nèi)，在808nm近紅外激光器照射下，實施腫瘤光熱治療。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

苯胺（99%，Alfa），聚乙烯吡咯烷酮 K-30（PVP-K30，GR，國藥集團化學試劑有限公司），二氯甲烷（AR，上海凌峰化學試劑有限公司），過硫酸銨（AR，國藥集團化學試劑有限公司），檸檬酸（AG，國藥集團化學試劑有限公司）,磷酸鹽緩沖液（PBS，實驗室自配）,細胞培養(yǎng)液RPMI-1640（Gibco）。

1.2 聚苯胺顆粒制備

A液：稱量PVP-K304g，加入35mL 超純水，置于恒溫磁力攪拌器（HJ-3，常州國華電器有限公司）攪拌。待其完全溶解后加入苯胺0.73mL，繼續(xù)攪拌使其充分混勻。

B液：稱量檸檬酸5.25g，過硫酸銨0.9128g，加入超純水25mL，超聲振蕩溶解。然后加入25mL二氯甲烷，在冰水浴中預冷1h。

以一定速度攪拌B液，將A液溫度控制在20℃后逐滴加入B液中，冰水浴下反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后靜置2h，經(jīng)超純水洗滌兩次后即得到所需樣品。

1.3 材料表征

激光散射粒度分析儀表征：將聚苯胺溶液用超純水稀釋50倍，利用Zetasizer 3000測試粒徑，掃描角度為90°，激光波長633nm，溫度25℃。

透射電子顯微鏡表征：將聚苯胺溶液用超純水稀釋50倍，滴在有碳膜支持的銅網(wǎng)上，用超純水洗兩次，除去鹽分，干燥后于Tecnai G2 Spirit Biotwin透射電子顯微鏡下觀察。

1.4 聚苯胺材料光熱效應(yīng)

分別取PBS，聚苯胺溶液（1mg/mL，2mg/mL）3 mL，置于808 nm激光器（2W/cm2，北京鐳志威光電技術(shù)有限公司）下光照8min，每隔1min用熱像儀（Testo 875-1，德國）記錄對應(yīng)溫度數(shù)值。

1.5 聚苯胺材料細胞毒性及其光熱殺傷細胞能力

將腫瘤細胞BEL-7402（中科院上海細胞庫）按1x105個/mL密度接種到96孔板中，每孔100 μL。在細胞培養(yǎng)箱中過夜孵育后，分別加入不同濃度的聚苯胺溶液（0，0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL）100μL，作用24h后加入終濃度為1mg/mL的MTT，然后孵育4h。結(jié)束后每孔加入200μL DMSO，充分震蕩后用酶標儀（ENSPIRE 2300）分別在490nm和630nm處檢測光吸收值。

為了評價聚苯胺在近紅外光照射下對腫瘤細胞殺傷能力，將腫瘤細胞BEL-7402以1x105個/mL密度接種到96孔板中，每孔100μL。過夜孵育后，加入1mg/mL聚苯胺溶液100μL 孵育24h，然后在808 nm激光器下照射8min（空白組和單一激光組分別作為對照）。結(jié)束后更換培養(yǎng)液，孵育24h后用MTT法鑒定細胞活力。

1.6 KM小鼠腫瘤模型構(gòu)建

1.6.1 腫瘤細胞選取

雌性KM小鼠（18-20g，4-6周齡）購于上海杰思捷實驗動物有限公司。待小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后，分別選取小鼠腹水瘤細胞s180和人肝癌細胞BEL-7402（中科院上海細胞庫）約100μL接種到小鼠右前肢腋下（2x106個/mL，每組n=4），跟蹤觀察小鼠成瘤情況。

1.6.2 接種密度的選擇

選取小鼠腹水瘤細胞s180作為接種細胞，分別接種3x106個/mL，2x106個/mL和1x106個/mL s180細胞100μL至雌性KM小鼠右前肢腋下（每組n=4），跟蹤觀察小鼠成瘤情況。

1.7 KM小鼠腫瘤光熱治療

雌性KM小鼠（18-20g，4-6周齡），每只小鼠于右前肢腋下接種小鼠腹水瘤細胞s180（2.5x106個/mL）100μL。待腫瘤尺寸達到4-5mm后，瘤內(nèi)注射50μL（1 mg/mL）聚苯胺，然后在808nm激光器下照射8min，結(jié)束后每天進行跟蹤觀察，未進行任何處理的荷瘤小鼠作為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚苯胺表征結(jié)果

圖1 聚苯胺顆粒表征結(jié)果

（A）TEM 圖片，（B）TEM圖片放大，（C）DLS測試曲線。

圖1反應(yīng)了聚苯胺顆粒的微觀形貌。圖1（A）和（B）展示出聚苯胺顆粒的兩種狀態(tài)，一種是分散性好的小顆粒，另一種是較大的聚集體。兩種形貌顆粒并存可能是以下兩方面作用的綜合結(jié)果。一方面，表面活性劑PVP-K30的羰基O原子與苯胺的N原子發(fā)生氫鍵作用而被包繞在聚苯胺顆粒表面[7]，形成空間位阻，有效避免顆粒之間相互碰撞、融合，因而處于小尺寸狀態(tài)；另一方面，小顆粒擁有更高的表面能，表現(xiàn)出很強的活躍性[8]，彼此間碰撞的幾率增加，易形成大的聚集體。DLS測試結(jié)果對大顆粒極為敏感，反映出的信號強度數(shù)量級倍（106）高于小顆粒，所以圖1（C）的粒徑測試結(jié)果以聚集狀態(tài)的聚苯胺為主導，尺寸分布集中在600 nm附近（PDI=0.321）。

2.2 聚苯胺光熱效應(yīng)

圖2 不同溶液光照后溫度-時間曲線

從圖2可以很清楚地看到，聚苯胺溶液在808nm激光照射下溶液溫度迅速升高，從最初的25℃上升至接近50℃，溫度變化值ΔT超過20℃，這已足夠用于光熱療法消融腫瘤組織[9]。此外，圖2也反映出溶液溫度與聚苯胺濃度存在依賴關(guān)系：隨著濃度升高，溫度也呈上升趨勢。但溶液溫度對聚苯胺濃度的敏感性不強：在相同時間點，1mg/mL和2mg/mL 聚苯胺溶液的溫度差值在2℃之內(nèi)。相比之下，PBS缺乏光熱升溫能力，8min之內(nèi)引起的溫度變化ΔT小于1℃。由此說明，聚苯胺能作為一種有效的光熱轉(zhuǎn)換材料，應(yīng)用于腫瘤光熱治療。

2.3 聚苯胺細胞毒性及其光熱殺傷細胞能力

從圖3反應(yīng)的細胞毒性看，隨著聚苯胺濃度升高，材料對BEL-7420細胞的毒性增強，細胞活力逐漸下降。當濃度達到1mg/mL時，細胞活力為56.4%。我們推測導致聚苯胺細胞毒性源于兩方面。一是小尺寸顆粒被細胞攝取后使細胞致死；二是分散性不好的聚集體在與腫瘤細胞作用時無法被攝取，這種情況下理應(yīng)表現(xiàn)出弱的毒性，因為材料未能進入細胞內(nèi)部[10]。但是，受重力作用的影響，聚集體在培養(yǎng)液中逐漸沉降并最終覆蓋在細胞表面，阻礙了細胞與培養(yǎng)液間正常的物質(zhì)交換，致使細胞缺乏養(yǎng)分死亡。

圖3 與不同濃度聚苯胺溶液作用后BEL-7402細胞的相對活力

圖4 與聚苯胺溶液作用后再經(jīng)近紅外光照射后腫瘤細胞BEL-7402細胞活力

為了證實聚苯胺顆粒有光熱殺死腫瘤細胞的能力，將材料與BEL-7402孵育后給光，結(jié)果如圖4所示。單純的激光照射對細胞沒有造成顯著性損傷（121.8%），但在加入材料并給光后則引起細胞大批量死亡，細胞活力僅為16%。細胞活力的下降一方面來自材料自身毒性，另一方面是因為材料光照后使溶液溫度短時間內(nèi)急劇升高，導致細胞受熱死亡。以上實驗結(jié)果充分證明聚苯胺可以作為一種合適的光響應(yīng)材料用于腫瘤的光熱治療。

2.4 KM小鼠腫瘤模型

2.4.1 腫瘤細胞選取

通過對KM小鼠接種后一段時間的觀察，我們發(fā)現(xiàn)肝癌細胞BEL-7402無法在KM小鼠體內(nèi)成瘤，推測原因在于KM小鼠自身健全的免疫系統(tǒng)。人肝癌細胞BEL-7402作為一種“異源”物質(zhì)，進入小鼠體內(nèi)后會引起強烈的免疫排斥反應(yīng)，進而被免疫系統(tǒng)攻擊和清除，最終無法成瘤。相比之下，鼠源s180細胞在小鼠體內(nèi)引發(fā)的免疫排斥反應(yīng)要弱，因而可在KM小鼠皮下成瘤，接種8天后，小鼠成瘤率可達50%。這說明KM小鼠腫瘤模型對接種細胞具有選擇性。因鼠源s180細胞在KM小鼠體內(nèi)能夠表現(xiàn)出良好的成瘤性，我們選其作為KM小鼠腫瘤模型構(gòu)建的細胞株。

2.4.2 接種密度的選擇為了合理地掌握和控制動物實驗周期和有效的成瘤率，我們探究了腫瘤細胞接種密度和腫瘤形成的關(guān)系。接種8天后，高密度組（3x106個/mL）成瘤率達到100%，中等密度組（2x106個/mL）和低密度組（1x106個/mL）成瘤率分別為50%和25%。這說明成瘤率隨接種密度的升高而升高。此外，在一定范圍內(nèi)，接種密度和出瘤時間呈負相關(guān)關(guān)系，上述三組小鼠的出瘤時間在4-6天不等。綜合考慮成瘤率和出瘤時間，我們選取2.5x106個/mL這一接種密度用于后續(xù)實驗。

2.5 KM小鼠體內(nèi)光熱治療

圖5 光照后12天小鼠圖片

由圖5可見，實驗組和對照組在光照后12天差異明顯。對照組小鼠腋下腫瘤沒有表現(xiàn)出任何受損跡象，腫瘤持續(xù)增大。而實驗組小鼠經(jīng)過光照處理后，腫瘤組織出現(xiàn)壞死、結(jié)痂，12天后腫瘤表面結(jié)痂脫落，留下明顯疤痕。這說明了聚苯胺腫瘤光熱療法的有效性。關(guān)于腫瘤萎縮、壞死的原因，我們分析認為：一方面是因為聚苯胺顆粒自身的毒性引發(fā)了腫瘤細胞的死亡；另一方面，聚苯胺吸收近紅外光后產(chǎn)生的熱量使腫瘤組織內(nèi)部溫度升高[6]，超過了腫瘤細胞的溫度耐受范圍，引起腫瘤細胞死亡。在這兩方面的協(xié)同作用下，小鼠腋下腫瘤得以抑制，出現(xiàn)結(jié)痂、萎縮。

但是，實驗組小鼠腋下腫瘤并沒有得到完全根除，在疤痕周邊還存在“殘留”的腫瘤組織。分析原因，推斷是光熱治療過程中腫瘤組織內(nèi)部溫度分布不均造成的。由于合成的聚苯胺顆粒存在一定程度聚集，瘤內(nèi)注射后未能在腫瘤組織內(nèi)部充分擴散，而是局限以注射位點為中心的周邊部分區(qū)域，致使光照后局部溫度顯著升高，達到殺死腫瘤細胞要求[11]。距離注射位點偏遠的組織盡管因熱交換溫度得到升高，但上升幅度受限，未能達到殺死腫瘤細胞的溫度條件。

通過以上實驗結(jié)果，我們充分說明了聚苯胺光熱療法抑制腫瘤的可行性，但囿于顆粒自身的分散性，未能取得理想化的結(jié)果。

3 小結(jié)

本文構(gòu)建了聚苯胺腫瘤光熱療法實驗體系。采用氧化聚合法，我們制備出水分散性聚苯胺納米顆粒。體內(nèi)外實驗結(jié)果反映出聚苯胺具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效率和顯著性抑瘤效果，這充分說明了聚苯胺可作為一種應(yīng)用于腫瘤光熱治療的理想材料。但受限于材料自身的分散性問題，聚苯胺光熱療法未能達到根除腫瘤的目的，這還需要在材料的合成制備上予以改進和優(yōu)化。

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