李秀榮

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所），天津 300020)

0 引言

在科研工作中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括模式動(dòng)物是我們研究人員的重要工具，大家對(duì)使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求也從普通級(jí)別（conventional animal,CV）上升到SPF級(jí)別（specific pathogen free animals），即無(wú)特定病原體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1]。這些SPF級(jí)別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不含人畜共患的病原體，而且同樣不攜帶其它病毒、細(xì)菌以及支原體和衣原體等各種微生物和寄生蟲(chóng)，遺傳背景清楚。但是在實(shí)際的繁殖、飼養(yǎng)和運(yùn)輸中過(guò)程中，可能會(huì)接觸到各種病原微生物和寄生蟲(chóng)，這些微生物和寄生蟲(chóng)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身的健康產(chǎn)生威脅，也同樣會(huì)對(duì)科研數(shù)據(jù)產(chǎn)生意想不到的干擾。所以通過(guò)各種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行微生物的凈化顯得尤為重要[2]。比較可行的方法有剖腹取胎技術(shù)和胚胎移植技術(shù)，兩種方法都是常用的微生物凈化技術(shù)，前者是最簡(jiǎn)單而有效的手段；后者對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的微生物凈化具有很好的優(yōu)勢(shì)[3]。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物凈化的理論基礎(chǔ)和技術(shù)可行性

凈化是將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中一些特定的病原微生物清除，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物達(dá)到一定清潔級(jí)別的方法。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的凈化首先是獲得無(wú)菌動(dòng)物，而獲得無(wú)菌動(dòng)物主要有剖腹取胎和胚胎移植兩個(gè)國(guó)際上公認(rèn)的比較理想的種群凈化方法[4]。

1.1 微生物凈化的理論基礎(chǔ)

在實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中，保持?jǐn)?shù)據(jù)的可靠性、可復(fù)制性和科學(xué)性是實(shí)驗(yàn)開(kāi)展的基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物往往會(huì)因?yàn)橐恍┎豢煽匾蛩囟a(chǎn)生“污染”，例如外在微生物的污染以及內(nèi)在遺傳漂變和遺傳污染。為防止這些的“污染”對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，必須對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行凈化，以保證在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的可靠性和安全性。這種凈化是針對(duì)所有已知的病原微生物包括一些未知的可能對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成傷害的微生物[5]。微生物的傳播可以根據(jù)方式不同，分為水平和垂直兩個(gè)方面，其中垂直傳播是指母子的方式，這種方式是先天性的；水平傳播是指外界環(huán)境的病原微生物通過(guò)各種方式影響著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這是后天帶來(lái)的威脅。在這里必須強(qiáng)調(diào)，胎生動(dòng)物的胎兒未離開(kāi)胎盤(pán)以及卵生動(dòng)物的卵未破殼，這樣的情況只有垂直傳播的可能性。胎盤(pán)屏障不僅是動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程的自我保護(hù)，也在微生物凈化中起著隔離的作用。垂直傳播還有一個(gè)重要特點(diǎn)是只有母體動(dòng)物在病毒血癥或者菌血癥等情況下，垂直傳播可以進(jìn)行下去，而且也不是每個(gè)幼體都是百分之百的感染，這是進(jìn)行凈化的重要基礎(chǔ)。

1.2 微生物凈化的技術(shù)可行性

1.2.1病原微生物的檢測(cè)水平目前的技術(shù)水平發(fā)展迅速，已經(jīng)有很多的檢測(cè)手段和方法對(duì)各種病原微生物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，有針對(duì)寄生蟲(chóng)檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光技術(shù)等；有針對(duì)細(xì)菌檢測(cè)的分離培養(yǎng)法和PCR法；有針對(duì)病毒檢測(cè)的血清ELISA法、PCR法等。現(xiàn)在隨著技術(shù)的進(jìn)步，很多種簡(jiǎn)易試劑盒也應(yīng)運(yùn)而生。只是這種監(jiān)測(cè)是與目前的科學(xué)認(rèn)知水平相接近的，以后隨著科技的發(fā)展，還會(huì)不斷得到加深[7]。

1.2.2剖腹取胎和胚胎移植的無(wú)菌手術(shù)操作。由于自然分娩的產(chǎn)道與外界相通，是污染的環(huán)境，所以胎生動(dòng)物或者卵生動(dòng)物都需要在無(wú)菌的情況下取出胎兒或者卵。目前不管是無(wú)菌的子宮切除取胎還是剖腹取胎都是可以達(dá)到的[8]。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物凈化的案例

微生物凈化主要有剖腹取胎方法和胚胎移植技術(shù)兩種，這里主要介紹剖腹取胎方法。胎盤(pán)是天然的隔離各種微生物的有效屏障，采取無(wú)菌剖腹產(chǎn)手術(shù)，可以切斷動(dòng)物母子垂直的疾病傳播，是微生物凈化最簡(jiǎn)單和最有效的手段之一[10]。該方法需要人為控制交配時(shí)間，在進(jìn)行子宮切除取胎或者剖腹取胎后要明白每種動(dòng)物不同的生理特性，根據(jù)不同動(dòng)物妊娠時(shí)間，預(yù)留無(wú)菌手續(xù)取胎和無(wú)菌孵化時(shí)間。常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物妊娠期時(shí)間長(zhǎng)短如下表1所示；還要注意每種動(dòng)物不同的哺乳期和喂養(yǎng)次數(shù)以及斷乳時(shí)間（表2所示），以期很好的喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物幼崽[11]。

表1 常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物妊娠期

下面簡(jiǎn)單介紹小鼠的剖腹產(chǎn)凈化手術(shù)以及喂養(yǎng)過(guò)程。

2.1 妊娠期和剖腹產(chǎn)時(shí)間確定

隨機(jī)選擇10只雄鼠和20只雌鼠進(jìn)行配種，檢查陰栓判斷是否配種成功，記錄陰栓時(shí)間并分籠飼養(yǎng)；根據(jù)上述表1的妊娠時(shí)間，發(fā)現(xiàn)陰道處于開(kāi)口狀態(tài)，手指觸摸到胎兒的頭和腰大小類似時(shí)候，可以進(jìn)行剖腹產(chǎn)手術(shù)[12]。

表2 常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物哺乳期以及每日哺乳次數(shù)和斷乳時(shí)間

2.2 剖腹產(chǎn)手術(shù)

剖腹產(chǎn)手術(shù)一定要保證絕對(duì)的無(wú)菌環(huán)境。手術(shù)的器械（止血鉗、剪刀等）、紗布等事先經(jīng)過(guò)高壓滅菌；手術(shù)室提前進(jìn)行紫外線照射消毒；斷頸椎處死母鼠，放在提前預(yù)熱至37度的2%過(guò)氧乙酸中進(jìn)行表面消毒，而后將小鼠置于解剖盤(pán)，剪開(kāi)腹部皮膚，將子宮暴露，先用止血鉗固定住子宮頸，剪斷子宮后放置預(yù)熱至37度的2%過(guò)氧乙酸中浸泡消毒2s，用生理鹽水沖洗干凈，最后打開(kāi)子宮取出仔鼠。采用人工乳或者提前準(zhǔn)備好的代乳喂養(yǎng)[13]。

實(shí)驗(yàn)中20只雌鼠，成功受孕分娩的小鼠有14只，它們各自的妊娠時(shí)間如下表3所示，最短時(shí)間是18天，最長(zhǎng)時(shí)間是20天。

表3 小鼠妊娠期

2.3 代乳母鼠喂養(yǎng)

在有凈化的無(wú)菌動(dòng)物的前提下，優(yōu)先選擇母乳代乳。代乳母鼠的選擇遵照品系相同、健康、產(chǎn)過(guò)一胎，有哺乳經(jīng)驗(yàn)，而且仔鼠成活率高的原則，代乳小鼠的產(chǎn)期和剖腹取胎的時(shí)間要接近，一般在剖腹產(chǎn)小鼠之前1-2天分娩，將剖腹產(chǎn)小鼠粘上代乳小鼠的糞便或者墊料進(jìn)行染味，由代乳小鼠進(jìn)行哺乳[14]。我們采用代乳方式，仔鼠的存活率為100%。

2.4 注意事項(xiàng)

第一，要保證環(huán)境以及所用的器具無(wú)菌，杜絕人為帶入污染。第二，在處死剖腹母鼠-取子宮-剝離胎兒等步驟要一氣呵成，速度要快，避免胎兒長(zhǎng)時(shí)間離開(kāi)母體，造成窒息死亡。第三，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理特征，計(jì)算好妊娠時(shí)間和剖腹的時(shí)間，并且結(jié)合手指觸診的經(jīng)驗(yàn)，確定剖腹的時(shí)間，剖腹太早可能由于仔鼠發(fā)育未成熟導(dǎo)致成活率降低；太晚剖腹又有剖腹小鼠提前自然分娩的可能。第四，在進(jìn)行剖腹手術(shù)過(guò)程中，接近室溫的溫度是保證手術(shù)成功的重要因素，過(guò)高或過(guò)低的溫度都不利于仔鼠的存活[15]。最后，對(duì)剖腹產(chǎn)的仔鼠進(jìn)行染味時(shí)候，一定要充分，避免代乳母鼠不飼喂哺乳。

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物凈化是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，上述提到的剖腹產(chǎn)凈化是其中的一個(gè)步驟，制備好的凈化動(dòng)物還需要不斷的繁殖，在這個(gè)過(guò)程中，飼養(yǎng)環(huán)境也顯得尤為重要，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施的隔離屏障系統(tǒng)是防止動(dòng)物感染的一道重要屏障，現(xiàn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都有潔凈的IVC系統(tǒng)，但是操作人員的合規(guī)操作很重要，需要嚴(yán)格按照無(wú)菌操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)，同時(shí)要定期檢查動(dòng)物飼養(yǎng)系統(tǒng)的各種指標(biāo)，以防整個(gè)系統(tǒng)出現(xiàn)故障，造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大規(guī)模的發(fā)生微生物的污染。

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