王璽，王凡，寧浩宇，白雪峰

（哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)醫(yī)學信息學院，黑龍江 大慶 163319）

0 引言

腦卒中（Stroke）又稱“中風”、“腦血管意外”（cerebralvascular accident，CVA）。是一種急性腦血管疾病，腦卒中是發(fā)達國家嚴重的長期神經功能障礙的主要原因，發(fā)病率約為0.25-4%，死亡率約為30%[1]。大量的證據表明，缺血性腦卒中伴隨著一系列的神經事件，如缺氧、氧化應激和炎癥反應[2]，最終導致了神經細胞急性壞死、細胞凋亡和自我死亡[3]。隨著分子生物技術的快速發(fā)展，人們發(fā)現lncRNA和mRNA的表達異常在腦卒中中起到了重要的作用，因此，我們通過研究來確定引起腦卒中新的發(fā)病機制,探索有效的預防和治療腦卒中手段。本文就通過表達譜分析，對lncRNA和mRNA的交互作用與腦卒中關系進行研究，初步探討了腦卒中發(fā)病機制中l(wèi)ncRNA和mRNA的作用，對lncRNA的功能進行注釋分析。

（1） mRNA與腦卒中

隨著近年來研究發(fā)現，mRNA在腦卒中疾病發(fā)生起著關鍵的角色。最新研究發(fā)現分化群（CD46）是心源性腦卒中的潛在生物標志物。并以CD46 mRNA為目標，這一結果通過熒光酶的報告分析進一步證實[4]。隨著更多的研究發(fā)現大量的mRNA與腦卒中的發(fā)生有著十分密切的聯系，如：Toll-Like受體3和干擾素βmRNA表達在缺血性卒中患者的外周血中增加，且預后良好[5]。通過以上的證明mRNA在腦卒中的各個階段都扮演著重要的角色。

（2）LncRNA與腦卒中

LncRNA(long noncoding RNA，lncRNA)指 的 是長度超過200nt。目前研究，超過一半的lncRNAs在大腦中表達[6]，它們調節(jié)了許多中樞神經系統(tǒng)[7]。研究證實，lncRNA H19通過驅動組蛋白脫乙酰酶，促進缺血性中風的神經炎癥。這表明找到一種基于H19的診斷和治療缺血性中風的可能方法[8]。目前，研究表明，通過調節(jié)特定的lncRNA，可以改變后缺血性神經元的死亡和/或再生/再生。這些研究對治療疾病很有意義,通過調節(jié)這些目標，能夠進一步防止中風后腦損傷[9]。隨著科研的進步，發(fā)現越來越多的lncRNA與腦卒中的并發(fā)有著千絲萬縷的關聯，MEG3通過激活p53介導缺血性神經元死亡腦卒中,MEG3作為缺血細胞死亡啟動子在生理和功能上與p53進行交互調解缺血性損傷[10]。對于以上的研究，我們不難發(fā)現lncRNA在腦卒中中有著非常重要的功能及作用，對lncRNA調節(jié)腦缺血性損傷的分子機制的研究提供潛在的新治療靶點。

1 腦卒中表達譜分析

1.1 數據準備

從 NCBI上下載mRNA數據(GSE16561)和，并利用GPL570平臺blast重注釋得到lncRNA，數據包括39個病人樣本和24個正常樣本，差異基因的選取通過SAM算法獲得，通過R代碼進行數據處理，選取差異表達的lncRNA和mRNA(p-value＜0.05)，得到1038個lncRNAs和6085mRNAs，采取皮爾森系數方法(cor＞0.8),構建lncRNAs-mRNAs互作網，并從HMDD數據庫下載Protein-Protein互作對進行網絡優(yōu)化，最終形成lncRNAs-mRNAs互作網絡。用Cytoscape插件對網絡進行功能模塊挖掘，獲得5個功能顯著性模塊，最后通過David進行基因的功能注釋，數據分析見圖1。

圖1 數據分析流程圖

1.2 表達譜網絡分析

對于形成lncRNA-mRNA互作網絡，結點數2223個，4431條邊。在網絡中，度越大的基因連接的邊越多，另外，還有一些結點雖然度小，但在結點間傳輸起到重要作用的橋梁作用，這些結點的關系，可能作為腦卒中的潛在的致病基因。結果見圖2。

1.3 網絡模塊挖掘

利用Cytoscape中的JActivemodule插件進行模塊挖掘。獲得5個功能性顯著模塊（module1-module5），結果見圖3。

1.4 Gene ontology(GO)分析

通過David在線平臺完成對模塊中重要結點進行功能分析，篩選出具有診斷意義的顯示lncRNA-mRNA關系對。通過以上步驟進一步對腦卒中l(wèi)ncRNAs的功能進行分析。

2 結果

圖2 網絡度分布

2.1 差異表達lncRNAs、mRNAs

對表達譜數據進行處理，得到差異表達的 mRNAs、miRNAs， 取 表 達 譜 差 異 的 mRNAs、lncRNAs前5%做熱圖，結果見圖4。

在mRNAs表達譜的熱圖中，module1中顯著表達的有 VIPR1，MEOX2；module2中含有 DDHD2；在lnc表達譜的熱圖中，顯著表達的有LINC00314。LINC00315腦卒中的發(fā)生都起到重大作用。

2.2 lncRNAs-mRNAs網絡模塊

通過模塊挖掘來研究lncRNAs、mRNAs在癌癥當中的共調控方式、以及基于局部策略來分析mRNAs的在腦卒中中的功能，見表1。

圖3 lncRNAs-mRNAs模塊圖

圖4 lncRNAs和mRNAs表達譜熱圖

表1 各模塊中邊、點數量和所含lncRNAs,mRNAs數量

在五個模塊中，PLAG1別名(PSA)同時存在于模塊一和模塊二中，可見它是一個十分重要的因子，已有研究證實PLAG1來自人類胚胎干細胞的神經前體細胞促進神經組織的完整性和腦卒中的行為表現。[11]在模塊二中，SNHG12作為lncRNA,重復出現在模塊五中。另外，一些研究通過RNA排序(RNA-seq)技術，體外模擬缺血性卒中條件，由此證明了SNHG12在大腦血管系統(tǒng)中起著重要的調控作用。模塊三和模塊四中，VIP是一種血管活性增強肽，廣泛分布在中樞神經系統(tǒng)和各種脊椎動物的外圍器官，可以保護受感染腦細胞不受損害，其機制是內源性神經保護物質的表達，證實了這些肽的極強的神經保護潛力，表明他可能為中風治療中提供新的靶點。在模塊五中，SNHG12，LINC01215，TMEM161B-AS1都是十分重要的lncRNA,它們相互連接多種基因，形成靶向關系，TERF2IP 通過調控血小板蛋白表達來間接影響腦卒中的發(fā)生[12]。

2.3 模塊功能分析

對五個模塊分別進行GO功能注釋，結果見圖5，我們可以看出有很多相同功能同時出現在多個模塊中，例如：regulation of nucleobase-containing compound metabolic process，表示腦卒中疾病與代謝密切相關。 organic cyclic compound biosynthetic process注釋到四個模塊中，這一功能與有機環(huán)狀化合物生物合成有關,可能與血管炎癥相關,血管炎癥是動脈粥樣硬化性疾病的重要發(fā)病機制,研究表明促炎基因在缺血性腦卒中起到重要作用。

圖5 模塊功能注釋

3 結語

為了明確腦卒中l(wèi)ncRNAs與mRNAs如何行使調控作用，通過對腦卒中芯片數據進行分析，得到lncRNA-mRNAs網絡，對網絡進行模塊挖掘獲得5個顯著性模塊，對模塊進行分析，最后，通過本文的研究，發(fā)現lncRNAs與mRNAs協(xié)同作用的一些結果，為今后更深入的研究腦卒中提供指導和借鑒。眾多研究已表明，lncRNA及mRNA通過多種途徑參與腦卒中的發(fā)生及發(fā)展過程，并提供新的治療靶點，對腦卒中的發(fā)生，治療，預后都有必要的作用。例如，我們發(fā)現SNHG12這個重要的lncRNA,通過去除腦內皮組織抑制缺血性中風腦血管功能障礙，可與多個mRNA相互作用，對腦卒中產生影響，VIP這種血管肽也為腦卒中的治療提供線索，與藥物靶點，而且通過功能注釋，生物體代謝存在密切的關系。由此看來，lncRNA與mRNA的相互作用對疾病發(fā)生和發(fā)展產生了不可忽視的影響,我們要對此進行進一步的研究與探索，為診斷和治療腦卒中等提供新的方向。

[1] Siniscalchi A, Gallelli L, Malferrari G, et al. Cerebral stroke injury:the role of cytokines and brain inflammation[J]. Journal of basic and clinical physiology and pharmacology, 2014, 25(2): 131-137.

[2] Mehta S L, Manhas N, Raghubir R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel the rapeutics[J]. Brain research reviews, 2007, 54(1): 34-66.

[3] Fayaz S M, Suvanish Kumar V S, Rajanikant G K. Necroptosis:who knew there were so many interesting ways to die?[J]. CNS& Neurological Disorders-Drug Targets (Formerly Current Drug Targets-CNS & Neurological Disorders), 2014, 13(1): 42-51.

[4] Tan J R, Tan K S, Yong F L, et al. MicroRNAs regulating cluster of differentiation 46 (CD46) in cardioembolic and non-cardioembolic stroke[J]. Plos One, 2017, 12(2):1-16.

[5] I??k M, Beydemir ?, Y?lmaz A, et al. Oxidative stress and mRNA expression of acetylcholinesterase in the leukocytes of ischemic patients[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017, 87: 561-567..

[6] Mercer T R, Dinger M E, Sunkin S M, et al. Specific expression of non-coding RNAs in mouse brain[J]. 2008, 105(2):716-721.

[7] Qureshi IA, Mehler MF. Emerging roles of non-coding RNAs in brain evolution, development, plasticity and disease.[J]. Nature reviews. Neuroscience, 2012, 13(8):528-541.

[8] Wang J, Zhao H, Fan Z, et al. Long Noncoding RNA H19 Promotes Neuroinflammation in Ischemic Stroke by Driving Histone Deacetylase 1–Dependent M1 Microglial Polarization[J]. Stroke,2017, 48(8): 2211-2221.

[9] Vemuganti R. All’s well that transcribes well: non-coding RNAs and post-stroke brain damage[J]. Neurochemistry international,2013, 63(5): 438-449.

[10] Yan H, Yuan J, Gao L, et al. Long noncoding RNA MEG3 activation of p53 mediates ischemic neuronal death in stroke.[J].Neuroscience, 2016, 337:191-199.

[11] Zee R Y L, Ridker P M, Chasman D I. Genetic variants in eleven telomere-associated genes and the risk of incident cardio/cerebrovascular disease: The Women’s Genome Health Study[J].Clinica Chimica Acta, 2011, 412(1–2):199-202.

[12] Tourdot B E, Conaway S, Niisuke K, et al. Mechanism of Race-Dependent Platelet Activation Through the Protease-Activated Receptor-4 and Gq Signaling AxisSignificance[J]. Arteriosclerosis,thrombosis, and vascular biology, 2014, 34(12): 2644-2650.