吳建國(guó) 董 禮 李 梅 徐小平

［1.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安625000］

生脈注射液是根據(jù)古驗(yàn)方“生脈散”研制成的中藥注射劑，由紅參、麥冬、五味子3味藥組成［1］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，生脈注射液在擴(kuò)張血管、增進(jìn)冠狀動(dòng)脈血流量方面有較好的療效，臨床上可用于治療心肌梗死、心源性休克、感染性休克、其他微循環(huán)障礙［2］。2011年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布正式執(zhí)行生脈注射液新質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［3］。該標(biāo)準(zhǔn)明確了生脈注射液制備工藝，其中五味子蒸餾液是生脈注射液的重要組分之一，但是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中并未對(duì)生脈注射液中揮發(fā)性成分進(jìn)行質(zhì)量控制，因此在控制五味子揮發(fā)性成分質(zhì)量上存在一定缺陷。五味子是生脈注射液中處方之一，具有益氣生津、收斂固澀、補(bǔ)腎寧心的功效，用于久嗽虛喘、夢(mèng)遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止等癥［4］。研究發(fā)現(xiàn)，五味子中含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、維生素、木脂素、三萜、倍半萜及多糖等多種化學(xué)成分［5］。其中，五味子揮發(fā)油主要成分為萜類(lèi)化合物［6］，其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)非特異性刺激的防御能力［7］。因此，基于對(duì)五味子藥材中揮發(fā)性成分進(jìn)行質(zhì)量控制，可有效保證生脈注射液中五味子揮發(fā)性成分質(zhì)量穩(wěn)定，為臨床療效提供保障。本研究試圖建立五味子藥材揮發(fā)性成分指紋圖譜，為五味子標(biāo)準(zhǔn)的提高以及生脈注射液企業(yè)內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 6890型氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）、Agilent 6890N/5973N型氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技公司）、XA205DU型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2.0版）軟件（國(guó)家藥典委員會(huì)頒布）。

1.2 材料 五味子藥材 10批（A150601、A150801、A151001、A151101、A151202、A160501、A160601、A160801、A161001、A161101），購(gòu)于集安市宏興參業(yè)有限公司；生脈注射液3批（16030802002、16080502003、16121205001），由雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 試藥 4-萜品醇（批號(hào)111967-201501）、α-松油醇（批號(hào)：111859-201503）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。 色譜乙腈（Merck）、色譜乙醇（Merck）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)條件 1）色譜條件。采用Agilent DB-1（30 m×250 μm，0.25 μm） 毛細(xì)管色譜柱（100%甲基聚硅氧烷）；進(jìn)樣口溫度230℃；恒流模式，流量（FID為N2，質(zhì)譜為He）1.1 mL/min；程序升溫，初始溫度50℃，保持2 min，以10℃/min升溫速率升溫至110℃，保持22min，再以40℃/min升溫速率升溫至230℃保持3min；分流比 5∶1；進(jìn)樣量 1 μL。 FID 檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)器溫度250℃；2）質(zhì)譜條件。EI離子源溫度為230℃；MS四極桿溫度150℃；電子能量為70 eV；接口溫度為280℃；溶劑延遲4.0 min。

2.2 溶液的制備 1）參照物溶液的制備。取4-萜品醇對(duì)照品、α-松油醇對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用色譜級(jí)乙腈溶解制成質(zhì)量濃度分別約為100、200、50、50 μg/mL的混合溶液，即得。2）供試品溶液的制備。（1）五味子供試品溶液制備。取五味子果實(shí)10 g于蒸餾瓶中，加入100 mL純化水，煮沸蒸餾，收集蒸餾液25 mL，冷藏（2～5 ℃）過(guò)夜；趁冷濾紙過(guò)濾；取濾液于固相萃取柱（C18，200 mg/mL）吸附，以 5 mL 純化水洗滌；將吸附后的小柱離心去除殘留水；再用乙腈洗脫至2 mL，即得。（2）注射液供試品溶液制備。取生脈注射液 20 mL，于固相萃取柱（C18，500 mg/mL）吸附富集，以5 mL純化水洗滌；將吸附后的小柱離心去除殘留水；再用乙腈洗脫至2 mL，即得。（3）陰性樣品溶液的制備。實(shí)驗(yàn)室按生脈注射液標(biāo)準(zhǔn)［3］制得缺五味子蒸餾液生脈液，按上述注射液供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 參照物成分的確定 取參照物溶液、五味子供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下GC條件進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)圖1。從圖中可以看出，與參照物溶液圖譜相應(yīng)的保留時(shí)間位置，供試品溶液圖譜中出現(xiàn)兩個(gè)顯著的特征峰。取五味子供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下GC-MS條件進(jìn)行檢測(cè)，圖譜見(jiàn)圖2。質(zhì)譜片段與對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)，確定與參照物相應(yīng)的峰分別為4-萜品醇、α-松油醇，見(jiàn)圖3。

圖1 五味子揮發(fā)性成分指紋圖譜（A）和參照物溶液圖譜（B）

圖2 五味子供試品溶液GC-MS的TIC圖譜

圖3 五味子供試品溶液GC-MS A、B峰質(zhì)譜圖

2.4 方法學(xué)考察 1）精密度試驗(yàn)。取同1份五味子供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜指紋圖譜，計(jì)算各共有色譜峰（9個(gè)）與參照峰（α-松油醇）的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD均小于4.5%，表明儀器精明度良好。2）重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批五味子藥材5份，按照“2.2”項(xiàng)下五味子供試品溶液制備方法進(jìn)行制樣，并以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜指紋圖譜，計(jì)算各共有色譜峰（9個(gè)）與參照峰（α-松油醇）的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD均小于5.2%，表明該方法重復(fù)性良好。2）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一份五味子供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行檢測(cè)， 記錄色譜指紋圖譜，計(jì)算各共有色譜峰（9個(gè)）與參照峰（α-松油醇）的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果RSD均小于4.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 對(duì)照指紋圖譜的建立 取10批五味子藥材，照“2.2”項(xiàng)下五味子供試品溶液制備方法進(jìn)行制樣，并以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜指紋圖譜，見(jiàn)圖4。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2.0版）軟件，對(duì)色譜圖中特征峰（9個(gè)）進(jìn)行匹配，并以平均值生成對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖5。

圖4 五味子藥材揮發(fā)性成分指紋圖譜

圖5 五味子藥材揮發(fā)性成分對(duì)照指紋圖譜

2.6 專(zhuān)屬性驗(yàn)證 取注射液供試品溶液、陰性樣品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，色譜圖見(jiàn)圖。對(duì)比分析陰性樣品溶液、注射液供試品溶液的指紋圖譜和五味子對(duì)照指紋圖譜。見(jiàn)圖6。從圖中可知，注射液供試品溶液存在五味子對(duì)照指紋圖譜中的色譜峰，其中4-萜品醇、α-松油醇峰顯著；陰性樣品中無(wú)五味子供試品色譜峰，提示利用五味子藥材揮發(fā)性成分指紋圖譜控制生脈注射液中五味子揮發(fā)性成分專(zhuān)屬性強(qiáng)。

圖6 陰性樣品溶液（A）、注射液供試品溶液（B：16030802002，C：16080502003，D：16121205001）的指紋圖譜和五味子對(duì)照指紋圖譜（E）

3 討 論

五味子揮發(fā)性成分的研究較多［8-10］，多采用水蒸氣蒸餾提取。生脈注射液制法中五味子揮發(fā)性成分采用水蒸氣蒸餾法提?。?］，因此本研究采用水蒸氣蒸餾法提取五味子揮發(fā)性成分，與生產(chǎn)工藝保持一致。固相萃取技術(shù)以其高效、高選擇性、高度自動(dòng)化的特點(diǎn)被廣泛用于各種生物樣品的分離和純化［11］，已有文獻(xiàn)報(bào)道采用固相萃取法富集揮發(fā)性成分［12］。本研究采用固相萃取法富集五味子蒸餾液和生脈注射液揮發(fā)性成分，能快速有效地在GC分析中避免水蒸氣對(duì)色譜柱的影響。

文獻(xiàn)報(bào)道在北五味子中發(fā)現(xiàn)50種揮發(fā)性成分［13］，4-萜品醇和α-松油醇為其主要成分。本研究采用GCMS對(duì)五味子揮發(fā)性指紋圖譜特征峰進(jìn)行定性分析，得出圖譜中最大的2個(gè)峰分別為4-萜品醇和α-松油醇。研究報(bào)道4-萜品醇和α-松油醇，具有良好的抑菌［14-15］、殺蟲(chóng)［16］活性，對(duì)人體皮膚無(wú)影響［17］。 因此以該兩種成分作為五味子藥材揮發(fā)性指紋圖譜中的特征峰，質(zhì)量控制方向明確。

采用固相萃取法富集生脈注射液揮發(fā)性成分，氣相色譜圖中存在4-萜品醇、α-松油醇以及其他色譜信息，說(shuō)明基于生脈注射液工藝制法建立的五味子藥材揮發(fā)性成分指紋圖，能從源頭上控制生脈注射液產(chǎn)品質(zhì)量，具有較好的質(zhì)量控制意義。

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