黎 萍 馮興林 鄭佩君 徐雪飛

（浙江省衢州市人民醫(yī)院，浙江 衢州 324000）

膿毒癥（Sepsis）是指宿主對感染產生的失控反應，并出現危及生命器官功能障礙的臨床綜合征，是重癥患者最常見的疾病之一，具有發(fā)病率高、死亡率高的特點［1］。目前針對膿毒癥的病理生理機制研究主要集中在早期促炎與抗炎反應的動態(tài)失衡、凝血功能障礙、免疫抑制、細胞凋亡、細菌內毒素移位等方面，其中免疫系統(tǒng)失調與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展密切相關［2-3］。目前除胸腺肽、烏司他丁等藥物外，臨床上暫未出現特異性針對膿毒癥治療的藥物。中藥復方制劑具有多成分、多療效、多靶點等特點，其在膿毒癥的治療中具有廣泛的前景［4］。 扶正解毒方由連翹、生甘草、柴胡、拳參、黃芪、黨參組成，具有解毒降濁、益氣扶正等功效。本研究擬通過盲腸結扎穿孔術模擬膿毒癥大鼠模型，探討扶正解毒方對膿毒癥大鼠免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用，以期為膿毒癥治療藥物的開發(fā)提供新的思路?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康昆明（KM）小鼠20只，雌雄各半，體質量 18～20 g，許可證編號：SCXK（京）2016-0001；成年 Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠 50只，體質量180～230 g，許可證編號：SCXK（京）2016-0017，均購于北京華阜康生物科技股份有限公司。所有實驗動物在實驗前于標準SPF環(huán)境下，采用標準飲食喂養(yǎng)以適應環(huán)境1周。

1.2 試劑及儀器 扶正解毒方由本院中藥制劑實驗室自制［扶正解毒方包括連翹、生甘草、柴胡、拳參、黃芪、黨參，常規(guī)煎制并濃縮成為100%藥液［（相當于1 mL 藥液中含生藥量 1 g），批號：20170401］；烏司他丁注射液購于廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司（規(guī)格1 mL∶5 萬 U，批號：20151104）；注射液用氧氟沙星購于安徽省先鋒制藥有限公司（規(guī)格0.2 g，批號：20150315）；ADVIA240全自動生化分析儀（德國西門子）；CytoFLEX流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特）。

1.3 分組與造模 采用隨機分組法將KM小鼠分為實驗組與對照組，每組10只。實驗組小鼠一次性灌胃給予扶正解毒方濃縮煎劑2000 mg/kg，對照組小鼠于同一時間段給予同等劑量生理鹽水。給藥后，兩組大鼠均自由活動且給予標準飲食喂養(yǎng)，密切觀察72 h內KM小鼠死亡率、精神狀態(tài)、日?；顒右约帮嬍城闆r。參考文獻［5］，制備膿毒癥大鼠模型。將SD大鼠隨機分為假手術組（n＝10）與手術組（n＝ 40）。 腹腔注射10%水合氯醛誘導和維持大鼠麻醉，將大鼠仰臥固定后，在無菌操作下沿腹中線剪開約2 cm開口，找到盲腸后并小心分離出盲腸。在距盲腸末端約1/2處采用4號線結扎，并用14號針頭在盲腸末端約0.5 cm處橫穿插孔，來回貫穿兩次，從針孔擠出少量腸內物。然后將盲腸復位，關腹。整個過程中應謹慎避免傷害腸系膜血管，以及避免腸內物感染手術切口。術前、術后均采用腹腔注射氧氟沙星25 mg/kg。術后每只大鼠皮下注射生理鹽水（50 mg/kg）以補充體液。假手術組除不進行盲腸結扎以及穿孔外，余下操作同手術組。18 h后統(tǒng)計兩組大鼠死亡率，結果手術組大鼠存活32只，假手術組大鼠存活8只。

1.4 給藥方法 以假手術組大鼠作為對照組（n＝8），手術組大鼠按隨機數字表法分為模型組（n＝11），扶正解毒方組（n＝11），烏司他丁組（n＝10）。各給藥組灌胃劑量按照動物體表面積折算成等效劑量，扶正解毒方組給藥劑量為20 mL/kg（腹腔注射），烏司他丁組給藥劑量為1萬U/kg（腹腔注射）；對照組與模型組給予等量生理鹽水。各組均每日給藥1次，連續(xù)5 d。第5天給藥前12 h所有動物均禁食不禁水，給藥后2 h采用大鼠尾靜脈取血5mL，肝素鈉抗凝以備用。

1.5 標本采集與檢測 取3 mL血樣于3500 r/min，4℃下離心5 min，分離上清液得大鼠待測血清送于本院檢驗科采用ADVIA240全自動生化分析儀檢測，檢測指標包括白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞、中性粒細胞、降鈣素原（PCT）、C 反應蛋白（CRP）。 取余下 2 mL 血樣，加入紅細胞裂解液后，于1500 r/min，4℃下離心5 min，棄其上清液，加入預冷的PBS清洗細胞2次，制備淋巴細胞懸液。采用流式細胞儀檢測外周T淋巴細胞亞群CD4+、CD8淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+的比值。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析。所有計量資料均以（±s）表示，空白組、模型組、給藥組之間炎癥因子水平、CD細胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠急性毒性實驗 實驗過程中，未觀測到小鼠中毒死亡案例。與對照組小鼠相比，實驗組小鼠在服藥24 h內，進食量以及飲水量顯著降低，日?；顒恿恳诧@著減少，精神活躍程度下降，表現為閉眼、弓背、嗜睡、部分小鼠出現拉稀便、多尿現象。24 h后，給藥組小鼠活動量逐漸增加，飲食量逐漸增多、拉稀便、多尿癥狀逐漸好轉。72 h時觀察兩組小鼠在飲食、日常活動量、精神狀態(tài)上已無明顯差異，說明本院自制扶正解毒方不存在配伍禁忌，對小鼠無毒副作用。

2.2 各組膿毒癥大鼠炎癥因子水平比較 見表1。與對照組相比，模型組大鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α含量、白細胞數以及中性粒細胞數均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，扶正解毒方組與烏司他丁組大鼠上述指標均顯著下降（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清中炎癥因子水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清中炎癥因子水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與對照組比較，△P＜0.05。 下同。

組 別 n IL-6（ng/L） IL-10（ng/L） TNF-α（ng/L）白細胞（×109/L）中性粒細胞（×109/L）對照組 8模型組 11扶正解毒方組 11 49.81±12.44* 70.39±10.67*17.42±2.11*628.44±125.85△ 147.28±20.10△ 65.40±6.07△218.88±76.63*△ 95.30±14.06*△ 28.61±5.42*△5.01±0.52* 0.24±0.08*9.32±0.91△ 1.60±0.19△5.97±0.70* 0.47±0.13*△烏司他丁組 10151.87±41.48*△ 78.16±9.03* 24.27±5.35*△5.55±0.76* 0.40±0.08*△

2.3 各組膿毒癥大鼠PCT、CRP含量比較 見表2。與對照組比較，模型組大鼠PCT、CRP含量均顯著上升（P＜0.05）。膿毒癥大鼠服用扶正解毒方與烏司他丁后，兩組大鼠血清中PCT、CRP含量均顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于對照組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清中PCT、CRP含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清中PCT、CRP含量比較（±s）

組 別 n PCT（ng/mL） CRP（μg/mL）對照組 8 73.46±11.08* 2.00±0.31*模型組 11 381.60±39.06△ 6.02±0.55△扶正解毒方組 11 297.80±26.50*△ 4.44±0.62*△烏司他丁組 10 218.73±35.20*△ 3.42±9.0.37*△

2.4 各組膿毒癥大鼠CD細胞亞群比較 見表3。與對照組比較，模型組大鼠CD4+百分比下降，CD8+百分比升高，CD4+/CD8+比值小于1；給予膿毒癥大鼠扶正解毒方與烏司他丁后，CD4+、CD8+百分比含量得到顯著逆轉，CD4+/CD8+比值大于1。

表3 各組大鼠CD4+、CD8+淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值比較（±s）

表3 各組大鼠CD4+、CD8+淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值比較（±s）

組別 n CD4+ CD8+ CD4+/CD8+對照組 8模型組 11扶正解毒方組 11 35.22±2.33* 20.63±2.26 1.71±0.42*14.75±2.93△ 23.55±2.77 0.63±.0.18△26.25±2.14*△ 19.36±3.04 1.42±0.30*烏司他丁組 10 30.36±1.50* 18.60±.3.27 1.63±0.23*

3 討 論

近年來研究表明，膿毒癥患者血液中同時存在促炎細胞因子（如IL-6、TNF-α等）以及抗炎細胞因子（如IL-1、IL-10 等）水平增加，可引起機體免疫抑制［6-7］。 在膿毒癥發(fā)生、發(fā)展過程中，患者的免疫狀態(tài)處于免疫細胞過多激活和淋巴細胞受抑制的雙向異?；蛭蓙y狀態(tài)、導致機體免疫失衡，產生大量有害因子，巨噬細胞抗原功能受損，最終患者導致多器官功能損傷［8］。因此，研究藥物對膿毒血癥患者免疫功能調節(jié)的影響以防止病情惡化，具有尤為重要的現實意義。

中醫(yī)學認為膿毒癥屬于中醫(yī)溫病、傷寒的范疇，病因多為溫熱毒邪（如感染、中毒、休克等）蘊藏于體內，毒瘀互結是其基本病機，正氣虧虛是其病理基礎［9］。因此，針對膿毒癥的治療應以清熱解毒、降濁化瘀為主，兼顧益氣扶正。本研究所采用的扶正解毒方煎劑，方中連翹、生甘草具有清熱利濕、解毒散結的功效，輔以柴胡拳參可涼血止血、降濁散瘀。另外黃芪配黨參可益氣固表、化瘀通絡，祛風養(yǎng)血。在小鼠急性毒性試驗中，可發(fā)現實驗室自制的扶正解毒方對小鼠無毒副作用，口服安全劑量可高達2000 mg/（kg·d）。根據最大安全劑量以及預實驗結果最終確定本研究中膿毒癥大鼠的給藥劑量為20 mL/kg。本研究中以烏司他丁作為陽性對照，參照已發(fā)表文獻用法用量［10-11］，確定本研究中以腹腔注射烏司他丁1萬U/kg為給藥劑量。

本研究結果顯示，模型組大鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α等炎癥因子水平以及白細胞、中性粒細胞計數均顯著高于對照組大鼠。在給予扶正解毒方煎劑以及烏司他丁注射液后，膿毒癥大鼠血清中上述指標較模型組大鼠均顯著降低（P＜0.05）。推測可能原因為扶正解毒方可有效抑制炎癥因子的釋放。王丁超等［12］在其研究中指出扶正敗毒顆粒能夠降低膿毒癥大鼠白細胞以及中性粒細胞比例，與本研究結果一致。

PCT與CRP水平是臨床中常用于評估感染嚴重程度的重要指標［13］。本研究結果顯示，模型組大鼠血清中PCT、CRP含量顯著高于對照組大鼠（P＜0.05），說明膿毒癥大鼠體內受到嚴重感染。給予扶正解毒方煎劑及烏司他丁治療后，相關指標得到顯著逆轉（P＜0.05）。正常情況下，甲狀腺細胞產生PCT后經降解幾乎不進入血液。在膿毒癥大鼠體內，PCT降解過程會受到內毒素或細胞因子抑制從而使血液中PCT含量顯著增加。同時在感染或組織損傷的機體中血漿內CRP含量將急劇上升［14］。 信淑珍等［15］對 160名膿毒癥患者炎癥因子水平與疾病嚴重程度的關系進行分析，研究結果表明膿毒癥患者PCT、CRP水平均與疾病的嚴重程度呈正相關。由此說明，扶正解毒方可有效降低膿毒癥大鼠體內PCT、CRP水平。

CD4+是T淋巴細胞亞群中發(fā)揮特異性免疫作用的主要成分，在免疫應答的全面調節(jié)中起關鍵性作用［16］。本研究結果顯示，模型組大鼠CD4+T淋巴細胞百分比低于對照組，說明膿毒癥大鼠免疫功能受到抑制，分別給予膿毒癥大鼠扶正解毒方煎劑與烏司他丁后，膿毒癥大鼠體內CD4+百分比顯著升高，說明免疫功能逐漸恢復。通常采用CD4+/CD8+比值直接反映宿主淋巴細胞的紊亂狀態(tài)。與對照組大鼠比較，模型組大鼠CD4+/CD8+比值顯著降低，可說明模型組大鼠細胞免疫功能被顯著抑制（P＜0.05）。經扶正解毒方煎劑與烏司他丁給藥后，CD4+/CD8+比值升高，且與對照組比較無顯著差異。說明扶正解毒方可有效調節(jié)膿毒癥大鼠的細胞免疫水平，有利于免疫平衡的恢復，且效果與烏司他丁類似。

綜上所述，扶正解毒方可有效抑制膿毒癥大鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α等炎癥因子水平、以及白細胞、中性粒細胞數、降低PCT、CRP含量，有效調節(jié)T淋巴細胞免疫水平，以利于免疫平衡的恢復。

［1］Fleischmann C，Scherag A，Adhikari NK，et al.Assessment of global incidence and mortality of hospital-treated Sepsis.Current Estimates and Limitations［J］.Am J Respir Crit Care Med，2016，193（3）：259.

［2］Cohen J，Vincent JL，Adhikari NKJ，et al.Sepsis： a roadmap for future research［J］.Lancet Infect Dis，2015，15（5）：581.

［3］師靈靈，韓艷秋，任慧娟，等.膿毒癥的病理生理機制研究進展［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2016，26（8）：1914-1916.

［4］郭小剛，冷建春，王衛(wèi)星，等.中藥復方治療膿毒癥患者療效觀察及對部分細胞因子和免疫學因子的影響［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2011，32（2）：13-15.

［5］荊喜中.野生型小鼠膿毒血癥模型的建立及應用研究［D］.廣州：廣東藥科大學，2016：10-30.

［6］王珂琪，張俊平.膿毒癥防治藥物研究進展［J］.國際藥學研究雜志，2015，42（4）：473-477.

［7］馬帥，郭樹彬.膿毒癥免疫麻痹與細胞免疫調理治療研究進展［J］.中華急診醫(yī)學雜志，2016，25（7）：969-973.

［8］Esposito S，De SG，Boccia G，et al.Sepsis and septic shock：New definitions，new diagnostic and therapeutic approaches［J］.J Glob Antimicrob Resist，2017，10（1）：204-212.

［9］許國振，許源.從瘀熱證論治膿毒血癥的理論及臨床研究［J］.中國中醫(yī)急癥，2016，25（11）：2069-2071.

［10］樊楚明，楊欣悅，任靖宇，等.烏司他丁對膿毒癥大鼠血管內皮細胞損傷保護作用及機制研究［J］.中國臨床藥理學雜志，2016，32（8）：723-726.

［11］曹超，柴艷芬，壽松濤，等.烏司他丁對膿毒癥小鼠調節(jié)性T細胞凋亡及細胞因子分泌的影響［J］.中華危重癥醫(yī)學雜志：電子版，2017，10（3）：149-152.

［12］王丁超，蘇秀平，高翔，等.扶正敗毒顆粒對膿毒血癥大鼠外周血白細胞及中性粒細胞比率的影響［J］.山西中醫(yī)，2011，27（9）：46-47.

［13］林玲.降鈣素原及C反應蛋白檢測在重度膿毒血癥患者預后判斷中的價值分析［J］.醫(yī)藥前沿，2016，6（18）：158-159.

［14］龍濤，白蓉蓉，李智，等.降鈣素原與C反應蛋白對術后重度膿毒血癥患者預后的影響［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2015，12（13）：2881-2883.

［15］信淑珍，王愛芹，李燕燕，等.膿毒血癥患者炎癥因子水平與疾病嚴重程度的關系分析［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2016，26（16）：3616-3618.

［16］戴凌燕，章義利，程碧環(huán).T淋巴細胞亞群變化與膿毒癥發(fā)病的關系［J］.中華全科醫(yī)學，2014，12（5）：715-716.