亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        煎煮時間對附子毒性的影響研究*

        2018-06-02 08:14:37劉福存單樂天肖魯偉黃家衛(wèi)
        中國中醫(yī)急癥 2018年5期
        關(guān)鍵詞:小鼠

        孫 婉 劉福存 袁 強 單樂天 肖魯偉 黃家衛(wèi)

        (浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州 310000)

        附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaelii Debx.)子根的加工品,味辛、甘,性大熱,有毒,歸心、腎、脾經(jīng);具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛之功效,用于亡陽虛脫、肢冷脈微、陰寒水腫、寒濕痹痛等癥[1],是四川道地藥材之一,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有附子的記載,稱其為“百藥之長”[2]?,F(xiàn)代藥理研究表明:附子具有強心、升壓、抗休克、抗血栓形成、抗腹瀉和糖皮質(zhì)激素樣作用[3]等多種藥理作用?!吨袊幍洹分猩阶觿┝渴?3~15 g[4],《中藥大辭典》中用于內(nèi)服的湯煎劑劑量為 3~9 g,回陽救逆可用 18~30 g[5]。 近年來,中醫(yī)火神派代表人物吳佩衡、范中林用方時常有劑量動輒60 g,更有甚者達到250~500 g左右,比起中國藥典規(guī)定的3~15 g用量相差甚遠。臨床報道表明,附子中毒的毒性主要表現(xiàn)在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等。如口唇、舌及肢體麻木,胸悶,呼吸困難,頭暈,心慌,咽喉、食管、胃部燒灼感,惡心嘔吐,嚴重者可出現(xiàn)休克、心律失常、昏迷,甚至死亡[6]。其中附子用量過大也是附子不良反應(yīng)較多的重要原因之一。附子的主要活性成分是烏頭類生物堿,它們既是附子的藥效成分,也是主要的毒性成分[7-8]。烏頭類生物堿尤其是雙酯二萜類生物堿,如烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等的毒性大。據(jù)文獻報道烏頭堿能夠讓人中毒的內(nèi)服劑量為0.2 mg,口服雙酯類生物堿 2~3 mg 即可致人死亡[9]。附子是一味常用中藥,然而其毒性影響了開發(fā)和使用。本實驗以不同煎煮時間的附子為樣本,采用高效液相法測定其3種毒性成分含量;對ICR小鼠進行急性毒性觀察和評價,探索不同煎煮時間對附子毒性的影響,為其臨床安全用藥提供文獻依據(jù)。

        1 材料與試劑

        1.1 實驗儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀,KQ5200B超聲機(昆山市超聲儀器有限公司),80-2電動離心機(常州奧華儀器公司),HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海江星儀器有限公司),RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)

        1.2 實驗動物 ICR小鼠,雌雄各半,18~20 g,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供,動物許可證號:SCXK(滬)2013-0016。

        1.3 藥物與試劑 附子(購于四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司,產(chǎn)地:四川江油,批號 160701)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)葛爾寧教授鑒定為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx.)子根的加工品。烏頭堿(批號:16031105)、新烏頭堿(批號:16032504)、次烏頭堿(批號:16032106),均購自成都曼思特。甲醇(色譜級,美國 TEDIA,批號:13060412),三乙胺(分析級,上?;瘜W(xué)試劑,批號:20091201),氯仿(分析級,西隴化工股份有限公司,批號:121128),二氯甲烷(分析級,天津賽浮瑞科技有限公司,批號:20120406001),娃哈哈純凈水(色譜級,杭州娃哈哈百立食品有限公司,批號:3106BL)

        1.4 附子原藥材鑒定液的制備 取附子粉末(過3號篩)約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加氨試液3 mL,精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液 50 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz,水溫<25℃)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL,40℃以下減壓回收溶劑至干,殘渣精密加入二氯甲烷4 mL溶解,濾過,取續(xù)濾液,即得。

        1.5 附子不同時間水煎液的制備 取2份生附子50 g分別置于1 L的圓底燒瓶中,加10倍的水,浸泡30 min,各加回流提取30、60 min濾過,殘渣加入8倍的水,再各加熱回流提取30、60 min;濾過,合并兩次煎液,真空減壓加熱濃縮1 g/mL,即得不同時間煎煮液,各煎煮液以5000 r/min離心10 min,取上清液即得。

        2 HPLC測定不同煎煮時間的附子水煎液中3種毒性生物堿的含量

        2.1 色譜條件 Hypersil-BDS柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);以甲醇-水-氯仿-三乙胺(100∶50∶3∶0.15)為流動相, 流速:1 mL/min,柱溫 30 ℃,進量樣 5 μL。

        2.2 對照品溶液的制備 精密稱取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿標準品各1.0、0.96、1.4 mg,加入10 mL二氯甲烷定容,充分搖勻溶解作為對照品混合溶液。

        2.3 供試品溶液的制備 供試品1溶液制備:取制備的附子原藥材鑒定液,0.45 μm微孔濾膜濾過,即得供試品1溶液。供試品2、3溶液制備:取不同煎煮時間(30、60 min)的附子水煎液各 18 mL,分別用二氯甲烷和氯仿,各萃取3次,18 mL/次,合并二氯甲烷和氯仿層萃取液,55℃減壓回收至干,加二氯甲烷定容3 mL,0.45 μm微孔濾膜濾過,即得供試品2、3溶液。

        2.4 樣品含量測定 按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進行測定,根據(jù)標準曲線,計算樣品中3個毒性成分的含量。

        3 HPLC試驗結(jié)果

        3.1 系統(tǒng)適用性試驗 按照上述色譜條件,取2.3項下所制備的供試品1、2、3溶液分別進樣,所得譜圖見圖1。

        供試品1溶液(附子水煎0 min)

        供試品2溶液(附子水煎30 min)

        圖1 不同煎煮時間附子水煎液HPLC色譜圖

        3.2 線性關(guān)系考察 分別將“2.2”項下所配制的的新烏頭堿(0.1 mg/mL)、烏頭堿(0.096 mg/mL)和次烏頭堿(0.14 mg/mL)的混合對照品溶液稀釋 2、4、6、8、10 倍。在上述色譜條件下,按稀釋液濃度由低至高順序依次進樣。以平均峰面積對進樣量進行線性回歸。回歸方程見表1,表明在上述范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        表1 3種烏頭堿的線性關(guān)系

        3.3 精密度試驗 取“2.2”項下制備的系列混合對照品溶液 5 μL,按“2.1”項下色譜條件,重復(fù)測定 6次,測定峰面積,結(jié)果表明,新烏頭頭堿、烏頭堿和次烏頭堿峰面積的RSD分別為1.2%、1.8%、2.3%。

        3.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液5μL,分別于 0、1、2、4、8、12 h進樣,測定峰面積,新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿峰面積的RSD分別為1.1%、2.0%、1.8%。表明供試品溶液在12 h穩(wěn)定性良好。

        3.5 重復(fù)性試驗 按“2.3”項下平行制備6份供試品溶液,在上述色譜條件下進樣5 μL,測定峰面積,新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的峰面積RSD分別為1.49%、2.43%、1.08%。

        3.6 加樣回收率試驗 精密稱取0.1g已知3種毒性成分含量的附子粗粉6份,分別精密加入與樣品中等量的對照品,按“2.3”項下方法制備得供試品溶液,用“2.1”項下色譜條件各進樣5 μL,測定3種烏頭堿的峰面積,新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的平均加樣回收率(n=6)為 99.2%、96.8%、99.5%,RSD 分別為 1.84%、2.4%、1.33%。

        3.7 樣品中3種毒性成分檢測 由表2可知,附子0 min水煎液中3種烏頭堿含量最高。隨著煎煮時間的延長,新烏頭堿在附子水煎30 min和附子水煎60 min含量變化不大,烏頭堿和次烏頭堿含量明顯減少,煎煮60 min時,烏頭堿幾乎檢測不到(由于樣品中3個成分含量差異較大,附子水煎0 min是經(jīng)過稀釋后測量的;而附子水煎30 min和附子水煎60 min的樣品是經(jīng)過萃取后測量的,最后統(tǒng)一折換成生藥量)。

        表2 樣品中3種烏頭堿的含量(n=3,μg/g)

        4 小鼠急性毒性試驗

        4.1 藥物制備 1)附子0min藥物制備。按“1.4”項下方法制備附子的異丙醇-乙酸乙酯混合溶液,將續(xù)濾液40℃減壓回收溶劑至干,殘渣加入蒸餾水溶解,使得藥物濃度達到5 g/mL,即得。2)附子水煎液的制備。按“1.5”項下方法制備附子水煎30 min藥液和附子水煎60 min藥液,并將水煎液濃縮到5 g/mL。

        4.2 分組及給藥 取清潔級ICR小鼠32只,按體質(zhì)量隨機分組:正常對照組、附子0 min組,附子水煎30 min組、附子水煎60 min組,每組8只,雌雄各半。實驗前小鼠禁食不禁水12 h。各組小鼠按100 kg/g灌胃給藥,每日1次,連續(xù)7 d,正常對照組每日給予蒸餾水。

        4.3 小鼠日常及行為學(xué)觀察 各組小鼠灌胃給藥后,正常飼養(yǎng),每日觀察,4 h后稱取體質(zhì)量,密切觀察各小鼠的動度進食、飲水情況及7 d內(nèi)可能出現(xiàn)的飲食異常、異常肌肉運動、對外反應(yīng)遲緩、瞳孔改變、異常分泌物、大小便異常、眼球凸出、眼瞼下垂、呼吸異常、皮膚顏色改變等毒性反應(yīng)和死亡情況。若有小鼠死亡,則將死亡小鼠解剖,肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等臟器的病理變化,7 d觀察期結(jié)束后,將每組存活的小鼠取血處死并進行解剖,按照上述同樣方法對主要臟器大體病理變化進行肉眼觀察并記錄。小鼠取血后,將所取的血樣水平靜置2 h,3000 r/min低速離心10 min,取上清液即得小鼠血清。采用相關(guān)儀器設(shè)備檢測血清中以下指標:谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)。

        4.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        5 小鼠急性毒性試驗結(jié)果

        5.1 小鼠急性毒性癥狀觀察 灌胃后,附子0 min組和附子水煎30 min組急性毒性表現(xiàn)相似,表現(xiàn)為呼吸急促,躁動不安,之后閉眼,眼球渾濁、黯淡,精神沉郁,呼吸短促,體溫偏低,懶動,協(xié)調(diào)性差等現(xiàn)象。特別是附子0 min組癥狀加重,尾巴青紫,被毛凌亂。附子水煎60 min組小鼠無顯著變化,活動量減少;正常對照組小鼠活躍,在籠中來回走動,攝食飲水均正常。死亡的小鼠被毛凌亂、無光澤,尾巴、四肢青紫,眼球塌陷。對死亡小鼠進行解剖,肝臟體積增大、色暗紅、邊緣變鈍,其他臟器無明顯異常。

        5.2 附子水煎液給藥后對存活小鼠的體質(zhì)量變化見表3。與正常對照組相比,各給藥組小鼠的體質(zhì)量明顯下降(P<0.05);通過比較體質(zhì)量差值可知不同煎煮時間的附子水煎液對小鼠的毒性有顯著差異(P<0.05);說明隨著煎煮時間的延遲,附子對小鼠的毒性降低。

        表3 不同時間附子水煎液對小鼠體質(zhì)量的影響(g,±s)

        表3 不同時間附子水煎液對小鼠體質(zhì)量的影響(g,±s)

        —表示無數(shù)據(jù),給藥1 d后即死亡。與正常對照組比較,*P<0.05。下同。

        組 別 n 體質(zhì)量差值給藥前體質(zhì)量 給藥后體質(zhì)量正常對照組 8 2.37附子0 min組 8 —附子水煎30 min組 8 -1.45*24.63±1.84 27.00±2.04 23.31±2.03 —24.85±2.65 23.40±2.29*附子水煎60 min組 8 -0.25*23.63±2.62 23.38±3.10*

        5.3 各組小鼠死亡率統(tǒng)計 見表4。附子0 min組灌胃給藥30 min后,小鼠均發(fā)生死亡現(xiàn)象,死亡率為100.00%;附子水煎30 min組第3日給藥發(fā)現(xiàn)小鼠死亡,給藥7 d后,小鼠死亡率為37.50%;而附子水煎60 min組和空白組小鼠在給藥7 d內(nèi)無死亡現(xiàn)象。

        表4 不同煎煮時間的附子對小鼠死亡率的影響

        5.4 各組小鼠血常規(guī)檢查結(jié)果 見表5。與正常對照組相比,附子水煎30 min組小鼠血液中ALT、GOT、CK和LDH含量均升高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)表明附子水煎30 min水煎液對肝臟和心臟有一定的毒性。但附子水煎 60 min水煎液中 ALT,AST,CK和LDH含量與正常對照組相比,均未見顯著差異(P>0.05)。

        表5 各組小鼠血常規(guī)檢查結(jié)果比較(±s)

        表5 各組小鼠血常規(guī)檢查結(jié)果比較(±s)

        組 別 n ALT(U/L) GOT(U/L) CK(U/L) LDH(IU/L)正常對照組 3附子水煎30 min組 3 30.27±0.61 79.60±4.40 859.67±123.46 762.72±120.38 71.13±2.60*159.50±88.96*1843.38±1364.77*1668.52±335.78*附子水煎60 min組 344.67±9.60 82.77±11.97 491.41±339.49 848.10±501.04

        3 討 論

        明代張景岳把附子稱作“良將”,《傷寒論》中涉及到附子的條文共有37條,包含附子的方藥共就有20首,并被歷代醫(yī)家廣泛應(yīng)用,可見附子在治病救人方面表現(xiàn)出的重要性,其中在萬方數(shù)據(jù)庫中檢索到,在500張習(xí)用方子中,排名第9位[10],附子的使用率為13.20%,可見其地位超然。但因附子毒性強烈,如有使用不當(dāng)又可置人于死地,所以說附子當(dāng)之無愧為“最有效亦最難用的藥”[11]。由于附子有毒性,臨床不乏不良反應(yīng)的病例報道。如何避免附子的毒性反應(yīng),是附子臨床應(yīng)用中需要足夠重視的問題。炮制既可以使中藥的療效得以提高,使藥物的不良反應(yīng)消除或降低,又可以改變藥物的性味、功能和臨床療效[12]。生附子毒性劇烈,一般需經(jīng)過炮制后使用。附子的炮制方法有著悠久的歷史,每個朝代的炮制方法各不相同,其中漢代以炮、煨、炒、燒等炮制方法為主,而到了唐代以后,在原有基礎(chǔ)上增加了一些炮制方法,例如有蜜制、黑豆制、醋制、姜制、童便制、甘草制及多種輔料浸制、煮制、蒸制[13]。附子的煎煮時間也影響其毒性與藥效。附子的毒性作用主要是其中所含的生物堿——烏頭堿類所致,其主要毒性是抑制心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)。但烏頭堿水溶性大,遇熱易被分解破壞,生附子經(jīng)鹽水浸泡、蒸熟,加工成熟附子后,不穩(wěn)定不耐熱的烏頭堿已大部分被分解破壞,不及生附子含量的20%[14]。通過煎煮以降低附子的毒性,目前常用的方法是久煎。根據(jù)HPLC結(jié)果可知,煎煮時間的延長,使得3種毒性成分含量下降;小鼠急性毒性實驗表明附子水煎時間越長,小鼠的死亡率降低,其體質(zhì)量下降得越發(fā)不明顯。但水煎60 min的附子水煎液中雙酯型生物堿(新烏頭堿和次烏頭堿)仍舊存在;且在急性毒性實驗中小鼠體質(zhì)量減輕,表明附子水煎60 min后毒性仍存在,對人的健康造成威脅。在煎煮過程中雙酯型生物堿先水解轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿和水解型單酯型生物堿,然后進一步水解成毒性可基本忽略的生物原堿(胺醇型生物堿)[15]??梢娂逯髸r間對酯型生物堿的含量有顯著影響,適度久煎可顯著降低雙酯型生物堿含量,增加單酯型生物堿含量,即解毒存效,但過度久煎可完全破壞雙酯型生物堿,也使單酯型生物堿含量下降,即藥理活性亦隨之減弱或消失[16]。本實驗專注點在于煎煮時間對附子毒性的影響,只一味得延長煎煮時間,苯甲酰類生物堿含量也會下降,其藥效也會大打折扣。應(yīng)當(dāng)在后續(xù)實驗中加入單酯這個考察因素,通過HPLC檢測其含量或者通過相關(guān)的細胞實驗來檢測藥效。

        [1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:191-193.

        [2]神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1982.

        [3]王勝林,董耀榮.附子水煎液對心梗后心力衰竭大鼠血流動力學(xué)的影響[J].陜西中醫(yī),2007,28(6):745-748.

        [4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

        [5]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,2013.

        [6]唐雪春,宋蘋,歐愛華.附子臨床應(yīng)用安全性文獻系統(tǒng)評價[J].新中醫(yī),2010,40(4):95-97.

        [7]Ma M,Yu J.Existence of multiple positive periodic solutiom for nonlinear functional difference equations[J].J Math Am,2005,305:483.

        [8]Liu Y.Periodic solutions of nonlinear functional difference equations at nonTcsonance ease[J].J Math Appl,2007,327:801.

        [9]雷波.附子減毒配伍研究的新思考[J].宜春學(xué)院學(xué)報,2008,30(2):10.

        [10]徐大樟.附子淺識[J].浙江中醫(yī)藥,1976,2(2):37.

        [11]楊明, 徐楚江, 鄒文銓.附子炮制新方法 [P].中國,CN91110997.8.1992(6):17.

        [12]孫娥,徐鳳娟,張振海,等.中藥炮制機制研究進展及研究思路探討[J].中國中藥雜志,2014,39(3):363-369.

        [13]黃勤挽,周子渝,王瑾,等.附子炮制歷史沿革研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(23):269-271.

        [14]劉玉,唐雪春.附子應(yīng)用安全性的研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,11(5):56-58.

        [15]謝曉芳,彭成,易進海,等.附子不同炮制品提取物急性毒性的比較研究[J].中藥與臨床,2012,3(3):29-33,51.

        [16]陳學(xué)習(xí),彭成.對附子毒性的再認識[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2007,9(6):7.

        猜你喜歡
        小鼠
        晚安,大大鼠!
        萌小鼠,捍衛(wèi)人類健康的“大英雄”
        視神經(jīng)節(jié)細胞再生令小鼠復(fù)明
        科學(xué)(2020年3期)2020-11-26 08:18:30
        小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
        今天不去幼兒園
        清肝二十七味丸對酒精性肝損傷小鼠的保護作用
        中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:34
        米小鼠和它的伙伴們
        高氟對C57BL/6J小鼠睪丸中AQP1、AQP4表達的影響
        Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
        加味四逆湯對Con A肝損傷小鼠細胞凋亡的保護作用
        亚洲成年国产一区二区| 国产美女高潮流白浆在线观看| 一本久道久久综合狠狠操| 国产不卡视频在线观看| 日本肥老妇色xxxxx日本老妇| 国产成人www免费人成看片| 亚洲加勒比无码一区二区在线播放| 字幕网中文字幕精品一区| 97一期涩涩97片久久久久久久 | 播放灌醉水嫩大学生国内精品 | 视频女同久久久一区二区三区 | 五月婷婷激情六月开心| 日本av亚洲中文字幕| 玩50岁四川熟女大白屁股直播| 狼人国产精品亚洲| 天堂av中文在线官网| 中国一级特黄真人片久久| 永久免费观看国产裸体美女| 亚洲中文字幕久久精品无码喷水| 国产在线观看入口| 少妇高潮太爽了免费网站| 超碰国产精品久久国产精品99| 国产精品久久久久久影视| 黑人巨大精品欧美在线观看| 在线不卡av一区二区| 99久久精品国产一区二区| 亚洲欧美日韩在线观看一区二区三区| 亚洲成av人在线观看无堂无码 | 一本久道久久综合久久| av大片网站在线观看| 国产午夜av秒播在线观看| 国产手机在线αⅴ片无码观看| 久久精品国产精品亚洲艾| 久久久天堂国产精品女人| 欧美金发尤物大战黑人| 国产成人免费高清激情明星| 久久久亚洲成年中文字幕| 国产乱码卡二卡三卡老狼| 国产v视频| 国产av精品一区二区三区不卡| 国产精品videossex久久发布|