孫 婉 劉福存 袁 強 單樂天 肖魯偉 黃家衛(wèi)

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310000）

附子為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）子根的加工品，味辛、甘，性大熱，有毒，歸心、腎、脾經(jīng)；具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛之功效，用于亡陽虛脫、肢冷脈微、陰寒水腫、寒濕痹痛等癥［1］，是四川道地藥材之一，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有附子的記載，稱其為“百藥之長”［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明：附子具有強心、升壓、抗休克、抗血栓形成、抗腹瀉和糖皮質(zhì)激素樣作用［3］等多種藥理作用?！吨袊幍洹分猩阶觿┝渴?3～15 g［4］，《中藥大辭典》中用于內(nèi)服的湯煎劑劑量為 3～9 g，回陽救逆可用 18～30 g［5］。 近年來，中醫(yī)火神派代表人物吳佩衡、范中林用方時常有劑量動輒60 g，更有甚者達到250～500 g左右，比起中國藥典規(guī)定的3～15 g用量相差甚遠。臨床報道表明，附子中毒的毒性主要表現(xiàn)在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等。如口唇、舌及肢體麻木，胸悶，呼吸困難，頭暈，心慌，咽喉、食管、胃部燒灼感，惡心嘔吐，嚴重者可出現(xiàn)休克、心律失常、昏迷，甚至死亡［6］。其中附子用量過大也是附子不良反應(yīng)較多的重要原因之一。附子的主要活性成分是烏頭類生物堿，它們既是附子的藥效成分，也是主要的毒性成分［7-8］。烏頭類生物堿尤其是雙酯二萜類生物堿，如烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等的毒性大。據(jù)文獻報道烏頭堿能夠讓人中毒的內(nèi)服劑量為0.2 mg，口服雙酯類生物堿 2～3 mg 即可致人死亡［9］。附子是一味常用中藥，然而其毒性影響了開發(fā)和使用。本實驗以不同煎煮時間的附子為樣本，采用高效液相法測定其3種毒性成分含量；對ICR小鼠進行急性毒性觀察和評價，探索不同煎煮時間對附子毒性的影響，為其臨床安全用藥提供文獻依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 實驗儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀，KQ5200B超聲機（昆山市超聲儀器有限公司），80-2電動離心機（常州奧華儀器公司），HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司），RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）

1.2 實驗動物 ICR小鼠，雌雄各半，18～20 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供，動物許可證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.3 藥物與試劑 附子（購于四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)地：四川江油，批號 160701）經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)葛爾寧教授鑒定為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli Debx.）子根的加工品。烏頭堿（批號：16031105）、新烏頭堿（批號：16032504）、次烏頭堿（批號：16032106），均購自成都曼思特。甲醇（色譜級，美國 TEDIA，批號：13060412），三乙胺（分析級，上?；瘜W(xué)試劑，批號：20091201），氯仿（分析級，西隴化工股份有限公司，批號：121128），二氯甲烷（分析級，天津賽浮瑞科技有限公司，批號：20120406001），娃哈哈純凈水（色譜級，杭州娃哈哈百立食品有限公司，批號：3106BL）

1.4 附子原藥材鑒定液的制備 取附子粉末（過3號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液 50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，水溫＜25℃）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入二氯甲烷4 mL溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.5 附子不同時間水煎液的制備 取2份生附子50 g分別置于1 L的圓底燒瓶中，加10倍的水，浸泡30 min，各加回流提取30、60 min濾過，殘渣加入8倍的水，再各加熱回流提取30、60 min；濾過，合并兩次煎液，真空減壓加熱濃縮1 g/mL，即得不同時間煎煮液，各煎煮液以5000 r/min離心10 min，取上清液即得。

2 HPLC測定不同煎煮時間的附子水煎液中3種毒性生物堿的含量

2.1 色譜條件 Hypersil-BDS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-水-氯仿-三乙胺（100∶50∶3∶0.15）為流動相， 流速：1 mL/min，柱溫 30 ℃，進量樣 5 μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿標準品各1.0、0.96、1.4 mg，加入10 mL二氯甲烷定容，充分搖勻溶解作為對照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備 供試品1溶液制備：取制備的附子原藥材鑒定液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品1溶液。供試品2、3溶液制備：取不同煎煮時間（30、60 min）的附子水煎液各 18 mL，分別用二氯甲烷和氯仿，各萃取3次，18 mL/次，合并二氯甲烷和氯仿層萃取液，55℃減壓回收至干，加二氯甲烷定容3 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品2、3溶液。

2.4 樣品含量測定 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，根據(jù)標準曲線，計算樣品中3個毒性成分的含量。

3 HPLC試驗結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗 按照上述色譜條件，取2.3項下所制備的供試品1、2、3溶液分別進樣，所得譜圖見圖1。

供試品1溶液（附子水煎0 min）

供試品2溶液（附子水煎30 min）

圖1 不同煎煮時間附子水煎液HPLC色譜圖

3.2 線性關(guān)系考察 分別將“2.2”項下所配制的的新烏頭堿（0.1 mg/mL）、烏頭堿（0.096 mg/mL）和次烏頭堿（0.14 mg/mL）的混合對照品溶液稀釋 2、4、6、8、10 倍。在上述色譜條件下，按稀釋液濃度由低至高順序依次進樣。以平均峰面積對進樣量進行線性回歸。回歸方程見表1，表明在上述范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 3種烏頭堿的線性關(guān)系

3.3 精密度試驗 取“2.2”項下制備的系列混合對照品溶液 5 μL，按“2.1”項下色譜條件，重復(fù)測定 6次，測定峰面積，結(jié)果表明，新烏頭頭堿、烏頭堿和次烏頭堿峰面積的RSD分別為1.2%、1.8%、2.3%。

3.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液5μL，分別于 0、1、2、4、8、12 h進樣，測定峰面積，新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿峰面積的RSD分別為1.1%、2.0%、1.8%。表明供試品溶液在12 h穩(wěn)定性良好。

3.5 重復(fù)性試驗 按“2.3”項下平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進樣5 μL，測定峰面積，新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的峰面積RSD分別為1.49%、2.43%、1.08%。

3.6 加樣回收率試驗 精密稱取0.1g已知3種毒性成分含量的附子粗粉6份，分別精密加入與樣品中等量的對照品，按“2.3”項下方法制備得供試品溶液，用“2.1”項下色譜條件各進樣5 μL，測定3種烏頭堿的峰面積，新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的平均加樣回收率（n=6）為 99.2%、96.8%、99.5%，RSD 分別為 1.84%、2.4%、1.33%。

3.7 樣品中3種毒性成分檢測 由表2可知，附子0 min水煎液中3種烏頭堿含量最高。隨著煎煮時間的延長，新烏頭堿在附子水煎30 min和附子水煎60 min含量變化不大，烏頭堿和次烏頭堿含量明顯減少，煎煮60 min時，烏頭堿幾乎檢測不到（由于樣品中3個成分含量差異較大，附子水煎0 min是經(jīng)過稀釋后測量的；而附子水煎30 min和附子水煎60 min的樣品是經(jīng)過萃取后測量的，最后統(tǒng)一折換成生藥量）。

表2 樣品中3種烏頭堿的含量（n＝3，μg/g）

4 小鼠急性毒性試驗

4.1 藥物制備 1）附子0min藥物制備。按“1.4”項下方法制備附子的異丙醇-乙酸乙酯混合溶液，將續(xù)濾液40℃減壓回收溶劑至干，殘渣加入蒸餾水溶解，使得藥物濃度達到5 g/mL，即得。2）附子水煎液的制備。按“1.5”項下方法制備附子水煎30 min藥液和附子水煎60 min藥液，并將水煎液濃縮到5 g/mL。

4.2 分組及給藥 取清潔級ICR小鼠32只，按體質(zhì)量隨機分組：正常對照組、附子0 min組，附子水煎30 min組、附子水煎60 min組，每組8只，雌雄各半。實驗前小鼠禁食不禁水12 h。各組小鼠按100 kg/g灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d，正常對照組每日給予蒸餾水。

4.3 小鼠日常及行為學(xué)觀察 各組小鼠灌胃給藥后，正常飼養(yǎng)，每日觀察，4 h后稱取體質(zhì)量，密切觀察各小鼠的動度進食、飲水情況及7 d內(nèi)可能出現(xiàn)的飲食異常、異常肌肉運動、對外反應(yīng)遲緩、瞳孔改變、異常分泌物、大小便異常、眼球凸出、眼瞼下垂、呼吸異常、皮膚顏色改變等毒性反應(yīng)和死亡情況。若有小鼠死亡，則將死亡小鼠解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎等臟器的病理變化，7 d觀察期結(jié)束后，將每組存活的小鼠取血處死并進行解剖，按照上述同樣方法對主要臟器大體病理變化進行肉眼觀察并記錄。小鼠取血后，將所取的血樣水平靜置2 h，3000 r/min低速離心10 min，取上清液即得小鼠血清。采用相關(guān)儀器設(shè)備檢測血清中以下指標：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）。

4.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

5 小鼠急性毒性試驗結(jié)果

5.1 小鼠急性毒性癥狀觀察 灌胃后，附子0 min組和附子水煎30 min組急性毒性表現(xiàn)相似，表現(xiàn)為呼吸急促，躁動不安，之后閉眼，眼球渾濁、黯淡，精神沉郁，呼吸短促，體溫偏低，懶動，協(xié)調(diào)性差等現(xiàn)象。特別是附子0 min組癥狀加重，尾巴青紫，被毛凌亂。附子水煎60 min組小鼠無顯著變化，活動量減少；正常對照組小鼠活躍，在籠中來回走動，攝食飲水均正常。死亡的小鼠被毛凌亂、無光澤，尾巴、四肢青紫，眼球塌陷。對死亡小鼠進行解剖，肝臟體積增大、色暗紅、邊緣變鈍，其他臟器無明顯異常。

5.2 附子水煎液給藥后對存活小鼠的體質(zhì)量變化見表3。與正常對照組相比，各給藥組小鼠的體質(zhì)量明顯下降（P＜0.05）；通過比較體質(zhì)量差值可知不同煎煮時間的附子水煎液對小鼠的毒性有顯著差異（P＜0.05）；說明隨著煎煮時間的延遲，附子對小鼠的毒性降低。

表3 不同時間附子水煎液對小鼠體質(zhì)量的影響（g，±s）

表3 不同時間附子水煎液對小鼠體質(zhì)量的影響（g，±s）

—表示無數(shù)據(jù)，給藥1 d后即死亡。與正常對照組比較，*P＜0.05。下同。

組 別 n 體質(zhì)量差值給藥前體質(zhì)量 給藥后體質(zhì)量正常對照組 8 2.37附子0 min組 8 —附子水煎30 min組 8 -1.45*24.63±1.84 27.00±2.04 23.31±2.03 —24.85±2.65 23.40±2.29*附子水煎60 min組 8 -0.25*23.63±2.62 23.38±3.10*

5.3 各組小鼠死亡率統(tǒng)計 見表4。附子0 min組灌胃給藥30 min后，小鼠均發(fā)生死亡現(xiàn)象，死亡率為100.00%；附子水煎30 min組第3日給藥發(fā)現(xiàn)小鼠死亡，給藥7 d后，小鼠死亡率為37.50%；而附子水煎60 min組和空白組小鼠在給藥7 d內(nèi)無死亡現(xiàn)象。

表4 不同煎煮時間的附子對小鼠死亡率的影響

5.4 各組小鼠血常規(guī)檢查結(jié)果 見表5。與正常對照組相比，附子水煎30 min組小鼠血液中ALT、GOT、CK和LDH含量均升高且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）表明附子水煎30 min水煎液對肝臟和心臟有一定的毒性。但附子水煎 60 min水煎液中 ALT，AST，CK和LDH含量與正常對照組相比，均未見顯著差異（P＞0.05）。

表5 各組小鼠血常規(guī)檢查結(jié)果比較（±s）

表5 各組小鼠血常規(guī)檢查結(jié)果比較（±s）

組 別 n ALT（U/L） GOT（U/L） CK（U/L） LDH（IU/L）正常對照組 3附子水煎30 min組 3 30.27±0.61 79.60±4.40 859.67±123.46 762.72±120.38 71.13±2.60*159.50±88.96*1843.38±1364.77*1668.52±335.78*附子水煎60 min組 344.67±9.60 82.77±11.97 491.41±339.49 848.10±501.04

3 討 論

明代張景岳把附子稱作“良將”，《傷寒論》中涉及到附子的條文共有37條，包含附子的方藥共就有20首，并被歷代醫(yī)家廣泛應(yīng)用，可見附子在治病救人方面表現(xiàn)出的重要性，其中在萬方數(shù)據(jù)庫中檢索到，在500張習(xí)用方子中，排名第9位［10］，附子的使用率為13.20%，可見其地位超然。但因附子毒性強烈，如有使用不當(dāng)又可置人于死地，所以說附子當(dāng)之無愧為“最有效亦最難用的藥”［11］。由于附子有毒性，臨床不乏不良反應(yīng)的病例報道。如何避免附子的毒性反應(yīng)，是附子臨床應(yīng)用中需要足夠重視的問題。炮制既可以使中藥的療效得以提高，使藥物的不良反應(yīng)消除或降低，又可以改變藥物的性味、功能和臨床療效［12］。生附子毒性劇烈，一般需經(jīng)過炮制后使用。附子的炮制方法有著悠久的歷史，每個朝代的炮制方法各不相同，其中漢代以炮、煨、炒、燒等炮制方法為主，而到了唐代以后，在原有基礎(chǔ)上增加了一些炮制方法，例如有蜜制、黑豆制、醋制、姜制、童便制、甘草制及多種輔料浸制、煮制、蒸制［13］。附子的煎煮時間也影響其毒性與藥效。附子的毒性作用主要是其中所含的生物堿——烏頭堿類所致，其主要毒性是抑制心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)。但烏頭堿水溶性大，遇熱易被分解破壞，生附子經(jīng)鹽水浸泡、蒸熟，加工成熟附子后，不穩(wěn)定不耐熱的烏頭堿已大部分被分解破壞，不及生附子含量的20%［14］。通過煎煮以降低附子的毒性，目前常用的方法是久煎。根據(jù)HPLC結(jié)果可知，煎煮時間的延長，使得3種毒性成分含量下降；小鼠急性毒性實驗表明附子水煎時間越長，小鼠的死亡率降低，其體質(zhì)量下降得越發(fā)不明顯。但水煎60 min的附子水煎液中雙酯型生物堿（新烏頭堿和次烏頭堿）仍舊存在；且在急性毒性實驗中小鼠體質(zhì)量減輕，表明附子水煎60 min后毒性仍存在，對人的健康造成威脅。在煎煮過程中雙酯型生物堿先水解轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿和水解型單酯型生物堿，然后進一步水解成毒性可基本忽略的生物原堿（胺醇型生物堿）［15］?？梢娂逯髸r間對酯型生物堿的含量有顯著影響，適度久煎可顯著降低雙酯型生物堿含量，增加單酯型生物堿含量，即解毒存效，但過度久煎可完全破壞雙酯型生物堿，也使單酯型生物堿含量下降，即藥理活性亦隨之減弱或消失［16］。本實驗專注點在于煎煮時間對附子毒性的影響，只一味得延長煎煮時間，苯甲酰類生物堿含量也會下降，其藥效也會大打折扣。應(yīng)當(dāng)在后續(xù)實驗中加入單酯這個考察因素，通過HPLC檢測其含量或者通過相關(guān)的細胞實驗來檢測藥效。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：191-193.

［2］神農(nóng)本草經(jīng)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982.

［3］王勝林，董耀榮.附子水煎液對心梗后心力衰竭大鼠血流動力學(xué)的影響［J］.陜西中醫(yī)，2007，28（6）：745-748.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

［5］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2013.

［6］唐雪春，宋蘋，歐愛華.附子臨床應(yīng)用安全性文獻系統(tǒng)評價［J］.新中醫(yī)，2010，40（4）：95-97.

［7］Ma M，Yu J.Existence of multiple positive periodic solutiom for nonlinear functional difference equations［J］.J Math Am，2005，305：483.

［8］Liu Y.Periodic solutions of nonlinear functional difference equations at nonTcsonance ease［J］.J Math Appl，2007，327：801.

［9］雷波.附子減毒配伍研究的新思考［J］.宜春學(xué)院學(xué)報，2008，30（2）：10.

［10］徐大樟.附子淺識［J］.浙江中醫(yī)藥，1976，2（2）：37.

［11］楊明， 徐楚江， 鄒文銓.附子炮制新方法 ［P］.中國，CN91110997.8.1992（6）：17.

［12］孫娥，徐鳳娟，張振海，等.中藥炮制機制研究進展及研究思路探討［J］.中國中藥雜志，2014，39（3）：363-369.

［13］黃勤挽，周子渝，王瑾，等.附子炮制歷史沿革研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（23）：269-271.

［14］劉玉，唐雪春.附子應(yīng)用安全性的研究進展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，11（5）：56-58.

［15］謝曉芳，彭成，易進海，等.附子不同炮制品提取物急性毒性的比較研究［J］.中藥與臨床，2012，3（3）：29-33，51.

［16］陳學(xué)習(xí)，彭成.對附子毒性的再認識［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，9（6）：7.