劉遠(yuǎn)志 周吉銀 張祚 李和教 黃毅嵐

1西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（四川瀘州 646000）；2陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院國家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)（重慶 400037）；3西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部（四川瀘州 646000）

Neuritin（又名：Nrn1或CPG15）是在研究可塑性相關(guān)基因時(shí)被發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有促進(jìn)軸突、樹突生長和皮層神經(jīng)細(xì)胞的存活、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞回路形成等作用，對(duì)受損神經(jīng)有著明顯修復(fù)的功效［1-2］。目前，隨著糖尿病的病患率急劇上升，在糖尿病診斷5年后其外周神經(jīng)病變的發(fā)病率大于50%；且在糖尿病周圍神經(jīng)病變后期，患者會(huì)發(fā)生糖尿病足等嚴(yán)重并發(fā)癥。研究表明當(dāng)糖尿病發(fā)生后，骨髓神經(jīng)受損情況對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變密切相關(guān)，但是具體作用機(jī)制尚不十分清楚，需進(jìn)一步研究［3］。因此，建立骨髓特異性高表達(dá)neuritin小鼠模型，可作為研究neuritin對(duì)骨髓神經(jīng)損傷修復(fù)作用的良好平臺(tái)，將為進(jìn)一步研究骨髓神經(jīng)病變與糖尿病周圍神經(jīng)病變提供基礎(chǔ)。本研究使用CMV-Loxp-STOPLoxp系統(tǒng)高表達(dá)neuritin轉(zhuǎn)基因小鼠和骨髓特異性Lyz2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行繁殖、交配，篩選出骨髓特異性高表達(dá)neuritin的轉(zhuǎn)基因小鼠作為動(dòng)物模型，并對(duì)模型鼠進(jìn)行骨髓鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委托廣州賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建CMV-loxp-stop-loxp系統(tǒng)高表達(dá)neuritin（loxpstop-loxp-neuritin）轉(zhuǎn)基因小鼠，骨髓特異性Lyz2-Cre小鼠購至美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室。小鼠在陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物室飼養(yǎng)和繁殖。

1.2 主要器材與試劑器材：PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad）；DYCP-31D型電泳槽（北京六一儀器廠）；恒溫金屬浴（杭州博日公司）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad CFX96 Touch）；小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司）；雙光速微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國Thermo公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國萊卡公司）。試劑：PCR引物（北京擎科生物技術(shù)有限公司），序列均由美國Jackson實(shí)驗(yàn)室提供；蛋白酶K（美國Sigma公司）；2×Taq Mix（北京天根公司）；DNAmarker（上海生工生物技術(shù)工程有限公司）；瓊脂糖（Invitrogen公司）；溴化乙錠（EB）（美國Sigma公司）；鼠抗Nueritun單抗（Santa Cruz公司）；Alexa Fluor?647羊抗鼠二抗（碧云天公司）；封閉用正常山羊血（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；TritonX-100（上海生工生物技術(shù)工程有限公司）。其他常用試劑均屬于國產(chǎn)或進(jìn)口的分析純?cè)噭?/p>

1.3 小鼠的飼養(yǎng)和繁殖采用CMV-loxp-stop-loxp系統(tǒng)得到的全身高表達(dá)neuritin（Loxp基因）轉(zhuǎn)基因小鼠（F0），與骨髓特異性Lyz-cre小鼠進(jìn)行雜交，獲取表達(dá)兩種基因型（Loxp基因、Lyz-Cre基因）的陽性小鼠（F1），即骨髓特異性高表達(dá)neuritin的轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.4 小鼠的基因型鑒定

1.4.1 小鼠DNA的提取用酒精擦拭待測(cè)小鼠鼠尾后，剪取尾尖約0.5～1 cm的組織，置于1.5 mL的Eppendorf（EP）管中，操作參照DNA提取試劑盒（北京天根生物），進(jìn)行基因組DNA的提取，以雙光速微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度后，置于-20℃保存。

1.4.2 Neuritin基因的鑒定使用neuritin引物擴(kuò)增鼠尾基因組DNA，鑒定其是否含有l(wèi)oxp位點(diǎn)。Loxp 位點(diǎn)引物：Loxp-F：5′-TCCCCATCAAGCTGATCCGG-3′，Loxp-R：5′-TCACACTTGCCC-GCTGCTCT-3′；Actin 內(nèi)參引物：Actin-F：5′-ACTCCAAGGCACT-TATCACCAT-3′，Actin-R：5′-AT-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′。PCR 條件：（1）94 ℃預(yù)變性3 min，（2）94℃變性30 s，（3）62℃退火35 s，（4）72 ℃延伸35 s，（5）94 ℃變性30 s，（6）60 ℃退火35 s，（7）72 ℃延伸35 s，（8）最后72℃延伸3 min；（2）～（4）重復(fù)10個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃），（5）～（7）重復(fù)25個(gè)循環(huán)。以1.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，含有l(wèi)oxp位點(diǎn)的neuritin基因擴(kuò)增產(chǎn)物具有234 bp陽性條帶和413 bp內(nèi)參條帶，而野生型neuritin基因擴(kuò)增產(chǎn)物只含有413 bp內(nèi)參條帶。

1.4.3 Lyz-cre重組酶轉(zhuǎn)基因的鑒定使用Lyz-cre重組酶基因擴(kuò)增鼠尾基因組DNA，鑒定其是否含有Lyz-cre重組酶基因。Lyz-cre引物：Lyz-Cre-Mutant：5′-CCCAGAAATGC-CAGA-TTACG-3′，Lyz-Cre-Common：5′-CTTGGGCTGCCAGAATTTCTC-3′，Lyz-Cre-Wild type：5′-TTACA-GTCGGCCAGGCTGAC-3′。PCR 條件：（1）94 ℃預(yù)變性3 min，（2）94 ℃變性30 s，（3）65 ℃退火15 s，（4）68 ℃延伸10 s，（5）94 ℃變性15 s，（6）60 ℃退火 15 s，（7）72 ℃延伸10 s，（8）最后72 ℃延伸2 min；（2）～（4）重復(fù)10個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃），（5）～（7）重復(fù)25個(gè)循環(huán)。以1.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，含有Lyz-Cre基因擴(kuò)增產(chǎn)物的雜合子具有700 bp、350 bp陽性條帶，而野生型突變基因小鼠只含有350 bp條帶。

1.4.4 組織免疫熒光檢測(cè)小鼠骨髓neuritin的表達(dá)（1）取組織：用4%的多聚甲醛對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行灌注固定，分離股骨；（2）組織固定與脫鈣：將取得的股骨用4%的多聚甲醛淹沒放于4℃冰箱固定過夜，于第二日將股骨取出放于10%EDTA脫鈣1周；（3）組織切片：首先在樣品托上涂一層OCT包埋膠，將脫鈣后的股骨置于其上，4℃冰箱預(yù)冷5～10 min讓OCT膠浸透組織，然后在其上再添一層OCT膠，置于速凍架上30 min；修片，切片：股骨切片厚度8 μm，切片室溫放置晾干后，用0.01 mol/L PBS液浸泡3遍，每遍5 min；（4）封閉：將切片放于封閉液（含0.3%Triton X-100和5%BSA）中孵育30 min；（5）孵育一抗：傾去血清，加入一抗：鼠抗Nueritun單抗1∶100，4℃孵育過夜；陰性對(duì)照用PBS代替；（6）0.01 mol/L PBS液浸泡4遍，每遍5 min；（7）Alexa Fluor?647（1∶400）二抗，37 ℃避光孵育1 h；（8）0.01 mol/L PBS液浸泡4遍，每遍5 min；（9）復(fù)染核：滴加DAPI，避光孵育13 min；（10）0.01 mol/L PBS液浸泡4遍，每遍5 min；（11）用吸水紙吸干多余的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片并在熒光顯微鏡下拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；多組組間對(duì)比采用Two-way ANOVA（雙尾方差分析），以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠繁殖情況親代loxp-stop-loxp-neuritin與轉(zhuǎn)基因小鼠lyz-Cre/+交配，產(chǎn)生的F1代小鼠經(jīng)PCR鑒定共有4種基因型，即neuritinloxp/+_lyz-Cre/+、neuritinloxp/-_lyz-Cre/+、neuritinloxp/+_lyz-Cre/-、neuritinloxp/-_lyz-Cre/-；各占約 25%。neuritinloxp/+_lyz-Cre/+即為骨髓特異性高表達(dá)neuritin小鼠。以上繁殖結(jié)果遵循孟德爾遺傳定律。

2.2 小鼠基因鑒定親代loxp-stop-loxp-neuritin與lyz-Cre/+雜交后產(chǎn)生的F1代通過2組特異性引物對(duì)其DNA進(jìn)行鑒定，PCR鑒定F1代小鼠基因型的部分結(jié)果如圖1。編號(hào)6、8、9、10、12小鼠經(jīng)loxp引物擴(kuò)增后表現(xiàn)出2條413 bp和234 bp擴(kuò)增條帶，為 neuritinloxp/+；編號(hào) 7、11、13小鼠表現(xiàn)出 1條234 bp擴(kuò)增條帶，為neuritinloxp/-；編號(hào) 7、8、9、11小鼠經(jīng)Cre引物擴(kuò)增后表現(xiàn)出2條700 bp和350 bp的擴(kuò)增條帶，為Lyz-Cre/+，編號(hào)6、10、12、13小鼠表現(xiàn)出1條350 bp擴(kuò)增條帶，為Lyz-Cre/-。結(jié)果顯示13號(hào)小鼠的基因型為neuritinloxp/-_lyz-Cre/-，為野生型小鼠；6、10、12號(hào)小鼠的基因型為neuritinloxp/+_lyz-Cre/-，為雜合子小鼠；7、11號(hào)小鼠的基因型為neuritinloxp/-_lyz-Cre/+，為雜合子小鼠；8、9號(hào)小鼠的基因型為neuritinloxp/+_lyz-Cre/+，即為骨髓特異性高表達(dá)neuritin小鼠（圖1）。

圖1 基因型鑒定PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR genotyping results of the genotype of transgenic mice

2.3 組織免疫熒光檢測(cè)neuritin的表達(dá)量共聚焦顯微鏡觀察8周齡neuritinloxp/+_lyz-Cre/+小鼠與野生型小鼠骨髓neuritin表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證neuritinloxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓中是否高表達(dá)neuritin。結(jié)果如圖2所示，通過Image J 1.50軟件分析，與野生型小鼠相比，neuritin-loxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓的neuritin表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），結(jié)果證實(shí)PCR方法鑒定neuritinloxp/+_lyz-Cre/+小鼠可靠（圖3）。

圖2 免疫熒光技術(shù)顯示骨髓neuritin的表達(dá)Fig.2 Photomicrographs showing the immunofluorescence expression of neuritin in bone marrow

圖3 neuritin在野生型和高表達(dá)小鼠骨髓中的表達(dá)量比較Fig.3 A comparison of the neuritin expression level of the neuritinloxp/+_lyz-Cre/+mice and the wild type mic mice

3 討論

本研究構(gòu)建的模型鼠采用的是Loxp-Cre轉(zhuǎn)基因重組酶系統(tǒng)，其包含Cre重組酶和loxp序列。Cre重組酶能特異性的識(shí)別loxp序列，使反向loxp序列間的DNA被顛倒，同向loxp序列間的DNA被切除，實(shí)現(xiàn)基因特異性敲除［4］。在骨髓特異性高表達(dá)neuritin轉(zhuǎn)基因小鼠中，于啟動(dòng)子和靶基因序列之間插入了一段“l(fā)oxp-stop-loxp”結(jié)構(gòu)，即把構(gòu)建的“啟動(dòng)子-loxp-stop-loxp-neuritin”結(jié)構(gòu)導(dǎo)入小鼠中，使小鼠全身細(xì)胞均含有neuritin的高表達(dá)基因，而此時(shí)靶基因的表達(dá)處于抑制狀態(tài)（此過程由廣州賽業(yè)生物科技有限公司完成）［5］。將該鼠與Lyz-Cre酶轉(zhuǎn)基因小鼠（美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）雜交，若其雜交后代的基因型中有既含Lyz-Cre基因又含“啟動(dòng)子-loxp-stop-loxp-neuritin”的基因，則Lyz-Cre基因會(huì)表達(dá)骨髓細(xì)胞特異性Cre重組酶，催化骨髓細(xì)胞loxp間的序列位點(diǎn)進(jìn)行特異性重組，最終將“stop”轉(zhuǎn)錄終止結(jié)構(gòu)從基因序列中切除，使小鼠骨髓的neuritin高表達(dá)基因得以表達(dá)。此外，將不同特性的Cre酶轉(zhuǎn)基因小鼠與“啟動(dòng)子-loxp-stop-loxp-靶基因”的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，可實(shí)現(xiàn)靶基因不同部位的表達(dá)［6-7］。

因此，為確定小鼠骨髓高表達(dá)neuritin蛋白，需驗(yàn)證雜交后代鼠同時(shí)具有Lyz-Cre基因和“啟動(dòng)子-loxp-stop-loxp-neuritin”基因，本課題組采用DNA的PCR鑒定判斷其基因型。此外，由于轉(zhuǎn)基因小鼠全身基因組DNA均兼有l(wèi)oxp和Lyz-Cre酶基因，因此對(duì)小鼠基因型鑒定時(shí)可采用小鼠尾組織DNA提取物［8］。研究結(jié)果顯示，兩種轉(zhuǎn)基因小鼠通過雜交可將各自的基因位點(diǎn)遺傳給后代，且可并存在于一個(gè)后代鼠中，獲取我們所需的骨髓特異性高表達(dá)neuritin模型鼠（圖1）。同時(shí)，利用組織免疫熒光對(duì)其骨髓的neuritin蛋白的表達(dá)量進(jìn)行半定量分析，結(jié)果表明neuritin-loxp/+_lyz-Cre/+小鼠骨髓的neuritin蛋白表達(dá)量明顯高于野生型小鼠（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明小鼠模型構(gòu)建成功。

本研究構(gòu)建的骨髓特異性高表達(dá)neuritin轉(zhuǎn)基因小鼠，其骨髓會(huì)高表達(dá)neuritin蛋白，當(dāng)小鼠骨髓神經(jīng)受損后，neuritin作為神經(jīng)營養(yǎng)因子，對(duì)受損神經(jīng)具有顯著的修復(fù)作用。骨髓發(fā)生神經(jīng)病變可嚴(yán)重影響骨髓中干細(xì)胞的功能，如造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞［9-10］。造血干細(xì)胞主要源于是各種血細(xì)胞與免疫細(xì)胞的初始細(xì)胞，統(tǒng)領(lǐng)著全身造血功能；間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的分化性和自我更新能力，能歸巢到損傷組織發(fā)揮修復(fù)作用［11-12］。而骨髓神經(jīng)病變后，神經(jīng)末梢的數(shù)量會(huì)急劇減少，骨髓交感神經(jīng)通過骨髓細(xì)胞上β-腎上腺素能受體調(diào)控造血干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放入血；骨髓自主神經(jīng)數(shù)量減少也可降低骨髓雪旺細(xì)胞數(shù)量并快速造成骨髓造血干細(xì)胞丟失［13-14］。因此，骨髓神經(jīng)病變是骨髓功能障礙的一個(gè)關(guān)鍵因素，而骨髓特異性高表達(dá)neuritin轉(zhuǎn)基因小鼠可作為研究外周神經(jīng)病變修復(fù)的模型鼠，如糖尿病外周神經(jīng)病變。

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