，

(青島大學(xué)，山東 青島 266021 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系； 2 附屬醫(yī)院病理科)

胃癌是世界上消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其較高的發(fā)病率和死亡率嚴(yán)重威脅人類的健康[1]，盡管胃鏡活檢健康篩查逐漸普及，但是由于早期癥狀不明顯，多數(shù)病人就診時(shí)往往處于中晚期，預(yù)后較差。胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程涉及一系列遺傳學(xué)改變，如眾多抑癌基因的失活和癌基因的激活，但其具體的分子機(jī)制目前尚不十分清楚。目前，胃腺癌是胃惡性腫瘤中最常見的組織學(xué)類型[2]。三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤相關(guān)分子。已有研究顯示，ATAD2在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，并與多種腫瘤的生存預(yù)后不良相關(guān)[3-6]。目前，有關(guān)ATAD2在不同病變胃組織中表達(dá)情況的研究相對(duì)較少。本文旨在通過檢測ATAD2在新鮮胃腺癌組織中mRNA水平的表達(dá)，以及ATAD2在不同病變胃組織中的表達(dá)情況，初步探討其表達(dá)與胃腺癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院2017年經(jīng)手術(shù)切除的新鮮胃腺癌及相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織12例，2011—2012年行手術(shù)切除的胃腺癌與相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織(其中相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織距腫瘤>5 cm)121例；另收集121例非瘤變胃組織(78例慢性淺表性胃炎、43例慢性萎縮性胃炎)，16例低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，13例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織。所有胃腺癌病人術(shù)前均未行放射、化學(xué)藥物治療，病人年齡38～85歲，平均62.7歲。所有切片均經(jīng)2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生閱片復(fù)診。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 試劑

濃縮型鼠抗人單克隆抗體ATAD2(1∶100，英國Abcam公司)；PV6000免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測ATAD2在胃腺癌組織中的表達(dá) 用Trizol提取12例新鮮胃腺癌及相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織總RNA，Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連Takara公司生產(chǎn))合成第一鏈cDNA，以cDNA為模板，應(yīng)用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器以及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒(大連Takara公司)對(duì)ATAD2和β-actin的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。ATAD2引物序列為：5′-GGAATCCCAAACCACTGGACA-3′(正義鏈)，5′-GGTAGCGTCGTCGTAAAGCACA-3′(反義鏈)；β-actin的引物序列為：5′-CGCAAAGACCT-GTATGCCAA-3′(正義鏈)；5′-CACACAGAGTAC-TTGCGCTC-3′(反義鏈)。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s；隨后95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。使用2-△△Ct方法計(jì)算ATAD2在胃腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2組織微陣列構(gòu)建 對(duì)121例胃腺癌及相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生診斷閱片，并對(duì)典型的區(qū)域進(jìn)行確認(rèn)及標(biāo)記，用孔徑為1.5 mm細(xì)針對(duì)蠟塊進(jìn)行打孔，并矩形排陣于空白受體蠟塊，受體蠟塊經(jīng)53 ℃陣列融合，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色以后，對(duì)每一個(gè)組織樣本行復(fù)診質(zhì)檢。

1.3.3免疫組化染色 所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、4 μm厚連續(xù)切片、脫蠟、水化后，采用PV6000法進(jìn)行免疫組化染色。以體積分?jǐn)?shù)0.03 H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓熱抗原(1 mmol/L EDTA，pH 8.0)修復(fù)，室溫冷卻，PBS沖洗2次以后，滴加一抗于4 ℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，滴加DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。用已知陽性表達(dá)ATAD2的正常睪丸組織作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判讀

以在細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色和棕褐色的顆粒為ATAD2陽性表達(dá)，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考相關(guān)的文獻(xiàn)[7-8]。按照陽性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行評(píng)分。0分：陽性細(xì)胞百分比<5%，1分：陽性細(xì)胞百分比占5%～25%，2分：陽性細(xì)胞百分比26%～50%，3分：陽性細(xì)胞百分比占51%～75%，4分：陽性細(xì)胞百分比占76%～100%；按照染色強(qiáng)度評(píng)分。0分：無著色，1分：淺黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色。ATAD2免疫組化染色得分=陽性細(xì)胞所占百分比得分×染色強(qiáng)度得分，ATAD2免疫組化染色得分≤4分為低表達(dá)，>4分為高表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 新鮮胃腺癌與相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織中的ATAD2 mRNA表達(dá)

ATAD2在胃腺癌與相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織中的平均相對(duì)表達(dá)量分別為-2.36±1.21、-2.90±1.15，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.664，P<0.01)。

2.2 胃腺癌與相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織中ATAD2蛋白的表達(dá)

ATAD2在121例胃腺癌組織中有23例(23/121)呈高表達(dá)，而在相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織中均不表達(dá)，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(z=-12.588，P<0.01)。

2.3 不同病變胃組織中ATAD2蛋白的表達(dá)

ATAD2在121例非瘤變的胃組織中均不表達(dá)(圖1A、B)，在16例低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中8例低表達(dá)，8例不表達(dá)(圖1C)，在13例高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中11例低表達(dá)，2例不表達(dá)(圖1D)，在121例胃腺癌中有23例高表達(dá)，98例低表達(dá)(20例不表達(dá))(圖1E)。高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及胃腺癌組織中ATAD2蛋白表達(dá)與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織比較明顯升高(z=-2.531、-2.285，P<0.05)；與低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變相比，非瘤變胃組織中ATAD2蛋白無表達(dá)(z=-7.984，P<0.01)。ATAD2在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變與胃腺癌組織中表達(dá)無差異(P>0.05)。

A：慢性淺表性胃炎；B：慢性萎縮性胃炎；C：低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；D：高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；E：胃腺癌。PV6000法，200倍。

2.4 ATAD2蛋白在胃腺癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

ATAD2蛋白在胃腺癌中的表達(dá)水平與腫瘤大小、分化程度相關(guān)(χ2=5.506、8.412，P<0.05)，而與病人年齡、性別、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、TNM分期、浸潤深度均無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1ATAD2蛋白在胃腺癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系(例(χ/%))

臨床病理特征n低表達(dá)高表達(dá)χ2P性別 男9171(78.02)20(21.98) 女3027(90.00)3(10.00)2.1030.147年齡(歲) <635649(87.50)7(12.50) ≥636549(75.38)16(24.62)2.8680.090分化程度 高中分化4138(92.68)3(7.32) 低分化8060(75.00)20(25.00)5.5060.019腫瘤大小(d/cm) <54845(93.75)3(6.25) ≥57353(72.60)20(27.40)8.4120.004TNM分期 Ⅰ～Ⅱ5145(88.24)6(11.76) Ⅲ～Ⅳ7053(75.71)17(24.29)3.0050.083浸潤深度 T11716(94.12)1(5.88) T2～T410482(78.85)22(21.15)2.2130.137淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況 未轉(zhuǎn)移4439(88.64)5(11.36) 轉(zhuǎn)移7759(76.62)18(23.38)2.6250.105

3 討 論

ATAD2的編碼基因位于染色體8q24.13，其表達(dá)產(chǎn)物ATAD2又稱為PRO2000或ANCCA，主要包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)與細(xì)胞活性相關(guān)的ATP酶結(jié)構(gòu)域[9-10]，另一個(gè)為參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾相關(guān)的溴結(jié)構(gòu)域[11]。有研究顯示，ATAD2參與調(diào)控腫瘤相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如ATAD2可以與E2F以及Myc相互作用，從而導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生[12]；ATAD2可以與ACTR啟動(dòng)子結(jié)合，參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[12]。已有研究顯示，ATAD2在卵巢癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌以及肝癌等多種惡性腫瘤中呈過表達(dá)[6,7,13]，并且參與了多種腫瘤的DNA的復(fù)制過程[14]。有研究證明ATAD2與肺癌、子宮內(nèi)膜癌、腎細(xì)胞癌等惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[15]。

目前，關(guān)于ATAD2在胃腺癌中的研究相對(duì)較少，有研究通過免疫組化法僅檢測其在胃癌與鄰近非腫瘤組織中的表達(dá)[16]，而胃癌的發(fā)生是一個(gè)多階段演進(jìn)的過程，該研究并未檢測ATAD2在不同病變胃組織中的表達(dá)。本文通過RT-qPCR、免疫組化法檢測顯示，ATAD2在胃腺癌中mRNA及蛋白水平均高于相應(yīng)癌旁相對(duì)正常組織，這與黃國全等[16]在胃癌中的研究結(jié)果相一致。另外，本文通過檢測不同病變胃組織中ATAD2的表達(dá)水平，結(jié)果顯示ATAD2在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、胃腺癌中的表達(dá)高于低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，在低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)高于慢性淺表性及慢性萎縮性胃炎，而ATAD2在胃腺癌與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、慢性淺表性胃炎與慢性萎縮性胃炎之間的表達(dá)卻沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。已有研究顯示，ATAD2在宮頸癌、高級(jí)別上皮內(nèi)病變中的表達(dá)升高，高于在宮頸正常上皮及宮頸低級(jí)別上皮內(nèi)病變組織中的表達(dá)，高表達(dá)的ATAD2可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[17]。本文的研究結(jié)果顯示，ATAD2在胃腺癌mRNA及蛋白水平表達(dá)均升高，提示ATAD2參與了胃腺癌的發(fā)生過程，ATAD2蛋白在非瘤變胃組織中不表達(dá)，在低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中出現(xiàn)了少量表達(dá)，而在高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變及胃腺癌組織中的表達(dá)明顯增多，提示ATAD2是胃腺癌發(fā)生過程中的一個(gè)早期事件，對(duì)某些胃黏膜病變性質(zhì)的判定具有重要的參考價(jià)值。

本文通過分析ATAD2與胃腺癌臨床病理特征的關(guān)系顯示，ATAD2的表達(dá)與腫瘤的大小、分化程度相關(guān)。在低分化胃腺癌組中ATAD2的表達(dá)明顯升高，高于在高中分化胃腺癌組中的表達(dá)，這與KRAKSTAD等[18]在子宮內(nèi)膜癌中的研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)ATAD2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的分級(jí)相關(guān)；在腫瘤直徑大于5 cm的病人組中ATAD2的表達(dá)升高，高于腫瘤直徑小于5 cm的病人組中的表達(dá)，這提示ATAD2參與了胃腺癌的發(fā)展過程。目前研究表明，ATAD2可以促進(jìn)多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖[7,19]，這提示在胃腺癌中，ATAD2可能通過影響胃腺癌細(xì)胞的增殖過程，從而影響胃腺癌的進(jìn)展。本文免疫組化結(jié)果顯示ATAD2的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度無關(guān)，與黃國全等[16]的研究結(jié)果不一致，推測與樣本選取不同有關(guān)，本文的研究對(duì)象為胃腺癌，而黃國全等[16]的研究對(duì)象為胃癌；另外，臨床病理特征的分組標(biāo)準(zhǔn)也存在一定差異。目前，國內(nèi)外關(guān)于ATAD2在胃腺癌中的研究相對(duì)較少，相關(guān)結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，ATAD2可能參與了胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，是胃腺癌發(fā)生過程中的一個(gè)早期事件，對(duì)某些胃黏膜病變性質(zhì)的判定有重要的參考價(jià)值；ATAD2在胃腺癌細(xì)胞中發(fā)揮的具體生物學(xué)作用及影響癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體分子機(jī)制，需要在以后的研究中進(jìn)一步探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1] CHEN W, ZHENG R, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[2] AJANI J A, LEE J, SANO T, et al. Gastric adenocarcinoma[J]. Nat Rev Dis Primers, 2017,3:1-19.

[3] HOU M M, HUANG R, SONG Y N, et al. ATAD2 overexpression is associated with progression and prognosis in colo-rectal cancer[J]. Jan J Clin Oncol, 2016,46(3):222-227.

[4] HWANG H W, HA S Y, BANG H, et al. ATAD2 as a poor prognostic marker for hepatocellular carcinoma after curative resection[J]. Cancer Res Treat, 2015,47(4):853-861.

[5] KALASHNIKOVA E V, REVENKO A S, GEMO A T, et al. ANCCA/ATAD2 overexpression identifies breast cancer patients with poor prognosis, acting to drive proliferation and survival of triple-negative cells through control of B-Myb and EZH2[J]. Cancer Res, 2010,70(22):9402-9412.

[6] WAN W N, ZHANG Y X, WANG X M, et al. ATAD2 is highly expressed in ovarian carcinomas and indicates poor prognosis[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014,15(6):2777-2783.

[7] LUO Y, YE G Y, QIN S L, et al. ATAD2 overexpression identifies colorectal cancer patients with poor prognosis and drives proliferation of cancer cells[J]. Gastroent Res Pract, 2015, 2015(2015):1-8.

[8] ZHENG L, LI T R, ZHANG Y, et al. Oncogene ATAD2 promotes cell proliferation, invasion and migration in cervical cancer[J]. Oncology Reports, 2015,33(5):2337-2344.

[9] LU W J, CHUA M S, SO S K. Suppression of ATAD2 inhi-bits hepatocellular carcinoma progression through activation of p53-and p38-mediated apoptotic signaling[J]. Oncotarget, 2015,6(39):41722-41735.

[10] CATTANEO M, MOROZUMI Y, PERAZZA D, et al. Lessons from yeast on emerging roles of the ATAD2 protein family in gene regulation and genome organization[J]. Mol Cells, 2014,37(12):851-856.

[11] REVENKO A S, KALASHNIKOVA E V, GEMO A T, et al. Chromatin loading of E2F-MLL complex by cancer-associated coregulator ANCCA via reading a specific histone mark[J]. Mol Cell Biol, 2010,30(22):5260-5272.

[12] HSIA E Y, KALASHNIKOVA E V, REVENKO A S, et al. Deregulated E2F and the AAA+ coregulator ANCCA drive proto-oncogene ACTR/AIB1 overexpression in breast cancer[J]. Mol Cancer Res, 2010,8(2):183-193.

[13] 劉芬,王彥,李宏,等. ATAD2在不同病變肝組織中的表達(dá)及意義[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2017,32(2):158-161.

[14] MOROZUMI Y, BOUSSOUAR F, TAN M, et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells[J]. J Mol Cell Biol, 2016,8(4):349-362.

[15] WANG D, PAN Y, HAO T, et al. Clinical and prognostic significance of ANCCA in squamous cell lung carcinoma patients[J]. Arch Med Res, 2016,47(2):89-95.

[16] 黃國全,孫建華,吳泉峰. 三磷酸腺苷酶家族蛋白2過表達(dá)作為胃癌預(yù)后標(biāo)志物可行性研究[J]. 實(shí)用醫(yī)院臨床雜志, 2016,13(6):29-32.

[17] 楊薇,徐梅梅,夏鳳宇,等. 下調(diào)ATAD2表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制探討[J]. 山東醫(yī)藥, 2015,55,(8):29-30.

[18] KRAKSTAD C, TANGEN I L, HOIVIK E A, et al. ATAD2 overexpression links to enrichment of B-MYB translational signatures and development of aggressive endometrial carcinoma[J]. Oncotarget, 2015,6(29):28440-28452.

[19] WU G, LIU H, HE H, et al. miR-372 down-regulates the oncogene ATAD2 to influence hepatocellular carcinoma proliferation and metastasis[J]. BMC Cancer, 2014,14(107):1-9.