(青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 消化內科； 2 急診普外科； 3 中心實驗室； 4 感染科)

世界范圍內，食管癌的發(fā)病率位于所有惡性腫瘤發(fā)病率的第8位，死亡率的第6位，食管癌發(fā)病具有明顯的地域性，我國是食管癌高發(fā)地區(qū)[1-3]，常發(fā)生于50歲以上男性[4-5]。食管癌包括鱗癌和腺癌兩種病理類型，我國食管癌中90%以上為鱗癌[1]。當前主要還是以手術治療為主，輔以放射治療和化學治療。盡管手術治療和放射治療取得了很大的進步，但晚期病人術后5年生存率仍低于20%[2]。早期的低確診率和鱗癌細胞的低分化高增殖水平是導致腫瘤快速進展和轉移的重要原因。因此，深入研究食管鱗癌細胞增殖分化的分子生物學機制，尋找新的分子治療靶點，對食管鱗癌的靶向治療具有重要意義。Jarid1b是組蛋白3第4位賴氨酸(H3K4)去甲基化酶，屬于Jarid1亞科。大量臨床研究表明，Jaird1b在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌等多種惡性腫瘤中表達增高[6-11]。上調Jarid1b有助于某些腫瘤細胞增殖，且Jarid1b在許多細胞分化過程中也起到了重要作用，但是Jarid1b對食管腫瘤細胞增殖和分化的作用和分子機制目前研究較少，本研究旨在探討去甲基化酶Jarid1b對食管鱗癌細胞增殖及分化影響，為食管鱗癌的治療提供新靶點。

1 材料方法

1.1 細胞培養(yǎng)與慢病毒制作轉染

KYSE-150和TE-1細胞購買自上海中國科學院細胞庫。細胞培養(yǎng)液為含體積分數(shù)0.10胎牛血清的1640和F12(1∶1)混合培養(yǎng)液，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Cumate-pLenti-Jarid1b-SV40-GFP慢病毒質粒購買自美國ABM公司。此質粒為誘導型質粒，僅在cumate誘導時表達Jarid1b。按照Lipofectamin 3000說明書將20 μg Cumate-pLenti-Jarid1b-SV40-GFP、10 μg pCMV-dR8.9和5 μg pMD2.G 三種質粒共轉染于直徑為10 cm培養(yǎng)皿中生長匯合度為80%左右的293FT細胞中。48 h后收集含有病毒的培養(yǎng)液，放入特殊病毒離心管中，在4 ℃下26 000 r/min離心3 h。棄掉上清液，病毒顆粒沉淀溶于合適體積的培養(yǎng)液中。為了獲得純Jarid1b過表達細胞系，病毒轉染KYSE-150細胞24 h后使用2 mg/L的嘌呤霉素篩選細胞直至未轉染對照細胞全部死亡。篩選后細胞換無嘌呤霉素培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 Western Blot檢測細胞中各蛋白的表達

以20 g/L SDS裂解液裂解正常的KYSE-150細胞、TE-1細胞和過表達Jarid1b的KYSE-150細胞。裂解產物95 ℃煮10 min，期間每隔3 min劇烈震蕩打斷DNA。使用BCA法進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳以后以0.3 A恒定電流濕法轉膜1.5 h，以50 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h。4 ℃下一抗孵育過夜：CK10(1∶3 000，Abcam，ab76318)，Jarid1b(1∶3 000， Bethyl， A301-813A)， α-tubulin(1∶5 000， Proteintech， 66031-1-Ig)。TBST洗3次，每次10 min。二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后采用Super Signal Pico substrate (Pierce Biotechnology)顯影，從而得到上述目的蛋白的顯影條帶。

1.3 RT-qPCR檢測目的基因mRNA表達量

按照RNAiso Plus (Takara D9108)說明書分別提取對照組細胞(正常未誘導的KYSE-150細胞)以及實驗組的細胞(TE-1細胞、過表達Jarid1b的KYSE-150細胞)的總RNA，并用Nanodrop定量。以逆轉錄試劑盒(Takara RR037A)逆轉錄500 ng總RNA后，以轉錄好的cDNA為模板使用Takara SYBR green試劑盒(RR820A)和羅氏公司Lightcycler480 PCR儀進行熒光定量PCR。PCR引物由華大基因科技公司合成，序列如下：CK10上游引物5′-GGGGGAGCCTCGTGACTA-3′，下游引物5′-AGGCCGTTGATGTCAGCC-3′；CK13上游引物5′-TGCTGCTGGACATCAAGACAC-3′，下游引物5′-AACAGAGGTGCTACGGGGG-3′；GAPDH上游引物5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTT-3′，下游引物5′-GAGTTAAAAGCAGCCCTGGTG-3′。以GPADH為內參基因，采用2-△△CT方法檢測實驗組及對照組細胞中上述目的基因mRNA的相對表達量。

1.4 CCK8實驗檢測細胞增殖能力

取生長狀態(tài)良好的未轉染KYSE-150細胞(對照組)和可以誘導表達Jarid1b的KYSE-150細胞(實驗組)，每組設置5個復孔，每孔將5 000個細胞接種至96孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h以后實驗組加入200 mg/L cumate(美國Sigma公司，268402)，未誘導對照組加入相應體積無水乙醇。誘導處理后分別在0、24和48 h棄掉培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的110 μL(含10 μL CCK8檢測液)無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min左右，用酶標儀檢測細胞在450 nm波長處的吸光度(A)值。

2 結 果

2.1 Jarid1b、CK10及CK13蛋白在食管鱗癌細胞中表達比較

RT-qPCR檢測結果顯示，低分化KYSE-150細胞系中CK10和CK13的相對表達量分別為1.000±0.000和1.000±0.000，而高分化的TE-1細胞系中CK10和CK13的相對表達量分別為9.851±0.542和18.027±0.626，TE-1細胞中CK10和CK13的表達水平明顯高于KYSE-150細胞(t=22.07、38.44，P<0.05)。本研究Western Blot方法檢測結果顯示，Jarid1b在高分化TE-1中高表達(圖1)。

2.2 過表達Jarid1b對KYSE-150細胞增殖的影響

CCK8實驗結果顯示，200 mg/L cumate誘導Jarid1b表達0、24、48 h后實驗組KYSE-150細胞在450 nm波長處的吸光度值分別為0.881±0.053、0.804±0.019、0.920±0.022，而對照組KYSE-150細胞在450 nm波長處的吸光度值分別為0.858±0.061、0.998±0.029、1.171±0.028。24、48 h兩組KYSE-150細胞增殖水平比較，差異有顯著性(t=10.94、16.71，P<0.05)。

2.3 過表達Jarid1b對KYSE-150細胞分化能力的影響

RT-qPCR檢測結果顯示，以cumate試劑誘導KYSE-150細胞Jaird1b過表達以后，KYSE-150細胞中CK10以及CK13的相對表達量分別為3.770±0.404和2.355±0.366，而對照組KYSE-150細胞中CK10和CK13的相對表達量分別為1.000±0.000和1.000±0.000，提示KYSE-150細胞中過表達Jarid1b可以使其中的CK10和CK13的表達量明顯升高(t=9.70、5.23，P<0.05)。Western Blot檢測結果顯示，KYSE-150細胞中過表達Jarid1b可以使其中的CK10的蛋白表達量明顯升高(圖2)

圖1 兩種細胞中Jarid1b蛋白的表達

圖2 過表達Jarid1b對KYSE-150細胞中CK10蛋白表達水平的影響

3 討 論

Jarid1家族是具有JmjC(催化)結構域的組蛋白去甲基化酶，其中Jarid1b可以移除H3K4me3的甲基基團產生H3K4me2和H3K4me1。位于基因啟動子區(qū)的H3K4me3是基因轉錄激活的標志，被移除時基因轉錄受到抑制。雖然有研究提示Ja-rid1b在很多不同類型腫瘤中表達增高，但是Jarid1b對腫瘤的作用仍存在爭議。在某些腫瘤中Jarid1b發(fā)揮著原癌基因的作用。在乳腺癌中，基因沉默Jarid1b抑制癌細胞增殖，在動物水平導致移植瘤生長減慢[12-13]。在膀胱癌和肺癌細胞系中siRNA抑制Jarid1b表達后導致sub-G1期細胞增多，抑制了細胞增殖。這一抑制作用可能是通過下調下游基因E2F來實現(xiàn)的[14]。在某些高侵襲性的腫瘤比如三陰性乳腺癌中異常表達的KDM5B可以上調其下游的靶點MALAT1，提升了腫瘤細胞的增殖能力和侵襲性，導致三陰性乳腺癌的低生存率[15]。但是另外一些研究結果提示，Jarid1b可能作為抑癌基因在腫瘤中發(fā)揮作用。即Jarid1b可以作為抑制性復合體NuRD的一個新組分，和NuRD復合體的LSD1亞基順序協(xié)同去除H3K4高甲基化，并與其他組分一起抑制趨化因子CCL14的表達，從而抑制乳腺癌細胞轉移與血管新生[16]。黑色素瘤中可以分離出一種Jarid1b高表達的細胞亞群，和Jarid1b低表達亞群相比，這一亞群生長緩慢，但是Jarid1b高表達的細胞能產生快速增殖的子代細胞，檢測表明這種快速增殖的子代細胞Jarid1b表達明顯降低。

此外，Jarid1b在發(fā)育過程中對細胞分化具有重要作用。Jarid1b可以促進間充質干細胞向成骨細胞分化[17]。Jarid1b可以直接下調mir-17-92b表達而導致巨噬細胞的分化[18]。在胚胎干細胞中雖然Jarid1b并非增殖必需，但是其在神經細胞系分化中發(fā)揮重要作用[19-20]。在MLL相關白血病干細胞中H3K4me3處于高表達狀態(tài)。當H3K4me3下降時干細胞分化，Jarid1b是調控H3K4me3下降的主要分子[21]。KIDDER等[22]在胚胎干細胞功能實驗中發(fā)現(xiàn)，在KDM5B基因缺失的胚胎干細胞的分化和自我更新過程中，存在某些基因體以及增強子區(qū)H3K4的廣泛甲基化，進而影響這些基因體以及增強子的功能。說明KDM5B在胚胎干細胞的分化過程中起到了重要的作用。

CK主要分布于上皮細胞，其中CK13和CK10的表達程度與上皮細胞的分化水平有良好的相關性[23]。本研究結果顯示，相對于低分化食管鱗癌細胞(KYSE-150)，高分化的食管鱗癌細胞(TE-1)中CK10、CK13和Jarid1b的表達水平明顯上升，這提示Jarid1b可能是調控食管鱗癌細胞分化的一個重要的因子。我們課題組研究顯示，在下咽癌FaDU細胞中上調Jarid1b的表達可以下調其下游靶基因Ship1，繼而調控它下游的PI3K/AKT通路活性，抑制該細胞的增殖，并且可以促進其分化[24]。本實驗結果顯示，過表達Jarid1b使KYSE-150細胞增殖能力明顯下降，并且使該細胞中CK10和CK13的表達水平明顯上升，提示Jarid1b的過表達可以抑制KYSE-150細胞的增殖并且可以促進該細胞的分化，發(fā)揮抑癌基因的作用。這種作用可能是通過Ship1-PI3K/AKT信號網絡來實現(xiàn)的，但仍需要更多的實驗和臨床研究進一步證實。

綜上，本研究主要通過誘導Jarid1b過表達的研究方法，證明了Jarid1b過表達抑制了低分化食管鱗癌細胞KYSE-150增殖并且促進其分化，為食管鱗癌甚至其他鱗癌的治療提供了可能的靶點。

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