(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003 1 消化內(nèi)科； 2 急診普外科； 3 中心實(shí)驗(yàn)室； 4 感染科)

世界范圍內(nèi)，食管癌的發(fā)病率位于所有惡性腫瘤發(fā)病率的第8位，死亡率的第6位，食管癌發(fā)病具有明顯的地域性，我國(guó)是食管癌高發(fā)地區(qū)[1-3]，常發(fā)生于50歲以上男性[4-5]。食管癌包括鱗癌和腺癌兩種病理類型，我國(guó)食管癌中90%以上為鱗癌[1]。當(dāng)前主要還是以手術(shù)治療為主，輔以放射治療和化學(xué)治療。盡管手術(shù)治療和放射治療取得了很大的進(jìn)步，但晚期病人術(shù)后5年生存率仍低于20%[2]。早期的低確診率和鱗癌細(xì)胞的低分化高增殖水平是導(dǎo)致腫瘤快速進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要原因。因此，深入研究食管鱗癌細(xì)胞增殖分化的分子生物學(xué)機(jī)制，尋找新的分子治療靶點(diǎn)，對(duì)食管鱗癌的靶向治療具有重要意義。Jarid1b是組蛋白3第4位賴氨酸(H3K4)去甲基化酶，屬于Jarid1亞科。大量臨床研究表明，Jaird1b在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)增高[6-11]。上調(diào)Jarid1b有助于某些腫瘤細(xì)胞增殖，且Jarid1b在許多細(xì)胞分化過(guò)程中也起到了重要作用，但是Jarid1b對(duì)食管腫瘤細(xì)胞增殖和分化的作用和分子機(jī)制目前研究較少，本研究旨在探討去甲基化酶Jarid1b對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖及分化影響，為食管鱗癌的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與慢病毒制作轉(zhuǎn)染

KYSE-150和TE-1細(xì)胞購(gòu)買自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)液為含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的1640和F12(1∶1)混合培養(yǎng)液，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Cumate-pLenti-Jarid1b-SV40-GFP慢病毒質(zhì)粒購(gòu)買自美國(guó)ABM公司。此質(zhì)粒為誘導(dǎo)型質(zhì)粒，僅在cumate誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)Jarid1b。按照Lipofectamin 3000說(shuō)明書將20 μg Cumate-pLenti-Jarid1b-SV40-GFP、10 μg pCMV-dR8.9和5 μg pMD2.G 三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于直徑為10 cm培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)匯合度為80%左右的293FT細(xì)胞中。48 h后收集含有病毒的培養(yǎng)液，放入特殊病毒離心管中，在4 ℃下26 000 r/min離心3 h。棄掉上清液，病毒顆粒沉淀溶于合適體積的培養(yǎng)液中。為了獲得純Jarid1b過(guò)表達(dá)細(xì)胞系，病毒轉(zhuǎn)染KYSE-150細(xì)胞24 h后使用2 mg/L的嘌呤霉素篩選細(xì)胞直至未轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞全部死亡。篩選后細(xì)胞換無(wú)嘌呤霉素培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)

以20 g/L SDS裂解液裂解正常的KYSE-150細(xì)胞、TE-1細(xì)胞和過(guò)表達(dá)Jarid1b的KYSE-150細(xì)胞。裂解產(chǎn)物95 ℃煮10 min，期間每隔3 min劇烈震蕩打斷DNA。使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳以后以0.3 A恒定電流濕法轉(zhuǎn)膜1.5 h，以50 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h。4 ℃下一抗孵育過(guò)夜：CK10(1∶3 000，Abcam，ab76318)，Jarid1b(1∶3 000， Bethyl， A301-813A)， α-tubulin(1∶5 000， Proteintech， 66031-1-Ig)。TBST洗3次，每次10 min。二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后采用Super Signal Pico substrate (Pierce Biotechnology)顯影，從而得到上述目的蛋白的顯影條帶。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)量

按照RNAiso Plus (Takara D9108)說(shuō)明書分別提取對(duì)照組細(xì)胞(正常未誘導(dǎo)的KYSE-150細(xì)胞)以及實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞(TE-1細(xì)胞、過(guò)表達(dá)Jarid1b的KYSE-150細(xì)胞)的總RNA，并用Nanodrop定量。以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara RR037A)逆轉(zhuǎn)錄500 ng總RNA后，以轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板使用Takara SYBR green試劑盒(RR820A)和羅氏公司Lightcycler480 PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。PCR引物由華大基因科技公司合成，序列如下：CK10上游引物5′-GGGGGAGCCTCGTGACTA-3′，下游引物5′-AGGCCGTTGATGTCAGCC-3′；CK13上游引物5′-TGCTGCTGGACATCAAGACAC-3′，下游引物5′-AACAGAGGTGCTACGGGGG-3′；GAPDH上游引物5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTT-3′，下游引物5′-GAGTTAAAAGCAGCCCTGGTG-3′。以GPADH為內(nèi)參基因，采用2-△△CT方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞中上述目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的未轉(zhuǎn)染KYSE-150細(xì)胞(對(duì)照組)和可以誘導(dǎo)表達(dá)Jarid1b的KYSE-150細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔將5 000個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h以后實(shí)驗(yàn)組加入200 mg/L cumate(美國(guó)Sigma公司，268402)，未誘導(dǎo)對(duì)照組加入相應(yīng)體積無(wú)水乙醇。誘導(dǎo)處理后分別在0、24和48 h棄掉培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的110 μL(含10 μL CCK8檢測(cè)液)無(wú)血清培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min左右，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。

2 結(jié) 果

2.1 Jarid1b、CK10及CK13蛋白在食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)比較

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，低分化KYSE-150細(xì)胞系中CK10和CK13的相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000和1.000±0.000，而高分化的TE-1細(xì)胞系中CK10和CK13的相對(duì)表達(dá)量分別為9.851±0.542和18.027±0.626，TE-1細(xì)胞中CK10和CK13的表達(dá)水平明顯高于KYSE-150細(xì)胞(t=22.07、38.44，P<0.05)。本研究Western Blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示，Jarid1b在高分化TE-1中高表達(dá)(圖1)。

2.2 過(guò)表達(dá)Jarid1b對(duì)KYSE-150細(xì)胞增殖的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，200 mg/L cumate誘導(dǎo)Jarid1b表達(dá)0、24、48 h后實(shí)驗(yàn)組KYSE-150細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值分別為0.881±0.053、0.804±0.019、0.920±0.022，而對(duì)照組KYSE-150細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值分別為0.858±0.061、0.998±0.029、1.171±0.028。24、48 h兩組KYSE-150細(xì)胞增殖水平比較，差異有顯著性(t=10.94、16.71，P<0.05)。

2.3 過(guò)表達(dá)Jarid1b對(duì)KYSE-150細(xì)胞分化能力的影響

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，以cumate試劑誘導(dǎo)KYSE-150細(xì)胞Jaird1b過(guò)表達(dá)以后，KYSE-150細(xì)胞中CK10以及CK13的相對(duì)表達(dá)量分別為3.770±0.404和2.355±0.366，而對(duì)照組KYSE-150細(xì)胞中CK10和CK13的相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.000和1.000±0.000，提示KYSE-150細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Jarid1b可以使其中的CK10和CK13的表達(dá)量明顯升高(t=9.70、5.23，P<0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，KYSE-150細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Jarid1b可以使其中的CK10的蛋白表達(dá)量明顯升高(圖2)

圖1 兩種細(xì)胞中Jarid1b蛋白的表達(dá)

圖2 過(guò)表達(dá)Jarid1b對(duì)KYSE-150細(xì)胞中CK10蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

Jarid1家族是具有JmjC(催化)結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶，其中Jarid1b可以移除H3K4me3的甲基基團(tuán)產(chǎn)生H3K4me2和H3K4me1。位于基因啟動(dòng)子區(qū)的H3K4me3是基因轉(zhuǎn)錄激活的標(biāo)志，被移除時(shí)基因轉(zhuǎn)錄受到抑制。雖然有研究提示Ja-rid1b在很多不同類型腫瘤中表達(dá)增高，但是Jarid1b對(duì)腫瘤的作用仍存在爭(zhēng)議。在某些腫瘤中Jarid1b發(fā)揮著原癌基因的作用。在乳腺癌中，基因沉默Jarid1b抑制癌細(xì)胞增殖，在動(dòng)物水平導(dǎo)致移植瘤生長(zhǎng)減慢[12-13]。在膀胱癌和肺癌細(xì)胞系中siRNA抑制Jarid1b表達(dá)后導(dǎo)致sub-G1期細(xì)胞增多，抑制了細(xì)胞增殖。這一抑制作用可能是通過(guò)下調(diào)下游基因E2F來(lái)實(shí)現(xiàn)的[14]。在某些高侵襲性的腫瘤比如三陰性乳腺癌中異常表達(dá)的KDM5B可以上調(diào)其下游的靶點(diǎn)MALAT1，提升了腫瘤細(xì)胞的增殖能力和侵襲性，導(dǎo)致三陰性乳腺癌的低生存率[15]。但是另外一些研究結(jié)果提示，Jarid1b可能作為抑癌基因在腫瘤中發(fā)揮作用。即Jarid1b可以作為抑制性復(fù)合體NuRD的一個(gè)新組分，和NuRD復(fù)合體的LSD1亞基順序協(xié)同去除H3K4高甲基化，并與其他組分一起抑制趨化因子CCL14的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與血管新生[16]。黑色素瘤中可以分離出一種Jarid1b高表達(dá)的細(xì)胞亞群，和Jarid1b低表達(dá)亞群相比，這一亞群生長(zhǎng)緩慢，但是Jarid1b高表達(dá)的細(xì)胞能產(chǎn)生快速增殖的子代細(xì)胞，檢測(cè)表明這種快速增殖的子代細(xì)胞Jarid1b表達(dá)明顯降低。

此外，Jarid1b在發(fā)育過(guò)程中對(duì)細(xì)胞分化具有重要作用。Jarid1b可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[17]。Jarid1b可以直接下調(diào)mir-17-92b表達(dá)而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的分化[18]。在胚胎干細(xì)胞中雖然Jarid1b并非增殖必需，但是其在神經(jīng)細(xì)胞系分化中發(fā)揮重要作用[19-20]。在MLL相關(guān)白血病干細(xì)胞中H3K4me3處于高表達(dá)狀態(tài)。當(dāng)H3K4me3下降時(shí)干細(xì)胞分化，Jarid1b是調(diào)控H3K4me3下降的主要分子[21]。KIDDER等[22]在胚胎干細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在KDM5B基因缺失的胚胎干細(xì)胞的分化和自我更新過(guò)程中，存在某些基因體以及增強(qiáng)子區(qū)H3K4的廣泛甲基化，進(jìn)而影響這些基因體以及增強(qiáng)子的功能。說(shuō)明KDM5B在胚胎干細(xì)胞的分化過(guò)程中起到了重要的作用。

CK主要分布于上皮細(xì)胞，其中CK13和CK10的表達(dá)程度與上皮細(xì)胞的分化水平有良好的相關(guān)性[23]。本研究結(jié)果顯示，相對(duì)于低分化食管鱗癌細(xì)胞(KYSE-150)，高分化的食管鱗癌細(xì)胞(TE-1)中CK10、CK13和Jarid1b的表達(dá)水平明顯上升，這提示Jarid1b可能是調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞分化的一個(gè)重要的因子。我們課題組研究顯示，在下咽癌FaDU細(xì)胞中上調(diào)Jarid1b的表達(dá)可以下調(diào)其下游靶基因Ship1，繼而調(diào)控它下游的PI3K/AKT通路活性，抑制該細(xì)胞的增殖，并且可以促進(jìn)其分化[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Jarid1b使KYSE-150細(xì)胞增殖能力明顯下降，并且使該細(xì)胞中CK10和CK13的表達(dá)水平明顯上升，提示Jarid1b的過(guò)表達(dá)可以抑制KYSE-150細(xì)胞的增殖并且可以促進(jìn)該細(xì)胞的分化，發(fā)揮抑癌基因的作用。這種作用可能是通過(guò)Ship1-PI3K/AKT信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但仍需要更多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，本研究主要通過(guò)誘導(dǎo)Jarid1b過(guò)表達(dá)的研究方法，證明了Jarid1b過(guò)表達(dá)抑制了低分化食管鱗癌細(xì)胞KYSE-150增殖并且促進(jìn)其分化，為食管鱗癌甚至其他鱗癌的治療提供了可能的靶點(diǎn)。

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