李 靜，花鎮(zhèn)東，王優(yōu)美

（公安部禁毒情報技術中心，北京100193）

合成大麻素最初為研究其對體內大麻素系統(tǒng)的影響及潛在治療價值而被合成，但之后并未成功進入臨床應用[1]。據聯(lián)合國毒品與犯罪辦公室（UNODC）早期預警咨詢處（EWA）2008—2015年的數據顯示，合成大麻素類為最主要的新精神活性物質（NPS）類型，占比約35%[2]，且比例逐年增加，以2012年和2013年增幅最為顯著，分別為72.9%和90.4%[3]。生物樣品中合成大麻素及其代謝物的檢測與定量分析對濫用的認定及毒理研究至關重要。血液、唾液、毛發(fā)中均可檢測到合成大麻素的母藥原體，然而其代謝物卻主要存在于尿液中[4]。THJ-018（1-戊基-3-（1-萘甲?；┻胚?，圖 1）是一種吲唑類合成大麻素類新精神活性物質，多次在全球毒品繳獲物中被鑒定發(fā)現。然而，因國內缺乏其藥理學、毒理學、安全性及代謝的相關數據信息，檢測吸食者尿液中的標志物較為困難。受到人體體內實驗的限制，開展體外代謝從成本及便捷性方面來講均更有利于其代謝物及代謝途徑的評價。本研究旨在通過體外人肝微粒體模型以確定THJ-018的I相代謝物，從而為進一步的尿液代謝物分析奠定基礎。

圖1 THJ-018分子結構式

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

待分析物 THJ-018（C23H22N2O:m/z 342.17321，由國家毒品實驗室繳獲物純化）。D-葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽水合物、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）鈉鹽水合物和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）（德國Sigma Aldrich）?；旌夏行愿挝⒘ｓw（pHLM;蛋白濃度，20mg/mL，iPhase 生物科技（北京）有限公司）。微粒體送達后于37℃解凍、分裝、儲存于-80℃直至使用。

圖2 THJ-018的代謝輪廓TIC色譜圖

圖 3 THJ-018（a）和其代謝產物（b~m）的質譜圖、推測結構和斷裂模式

HPLC級乙腈（CH3CN）、甲醇（CH3OH）和甲酸（HCOOH，Formic Acid）（德國 Merck）；超純水（德國 Merck 公司的Milli-Q Advantage A10自動蒸餾水機制備）。其他試劑和溶劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜、質譜條件

超高壓液相系統(tǒng)（Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC）串聯(lián)帶有熱電離噴霧離子化源（HESI）的 Q Exactive Plus質譜（美國）。 色譜柱為ACQUITY UPLCR○HSST3（100×2.1mm，1.8μm），柱溫為35℃；流動相為乙腈（B）-0.1%（v/v）甲酸水溶液（A），梯度洗脫程序如下:0.0～1.0min 95%A，1.0～2.5min 95%A～70%A，2.5～12.0min 70%A～1%A，12.0～13.5min 1%A，13.6～14.5min 95%A，流速為0.3mL/min。儀器在使用前進行正離子模式下的質量校準。離子源條件如下：離子傳輸毛細管溫度，350℃；輔氣加熱溫度，350℃；鞘氣流速，35 AUs；輔氣流速，10AUs；噴霧電壓，3.50 kV，S-透鏡 RF 水平，60.0。MS采用正離子全掃描模式，并選取特定質荷比的離子進行二級掃描。代謝物的精確分子量通過軟件Thermo MetWorks 1.3 SP4.200版本計算得出。全掃描數據采集參數設置如下：分辨率，70000；自動增益控制 （AGC），1e6；最大注射時間 （IT），100ms；掃描范圍，m/z70～1 050。二級質譜掃描參數設置如下：分辨率，17 500；目標物 AGC，5e5；最大IT，50ms；分離窗，m/z4.0；正態(tài)碰撞能量，20%、40%、60%。

1.2.2 體外人肝微粒體代謝模型的制備與代謝物分析

將THJ-018溶于甲醇制備成5mM的溶液，吸取1μL與新鮮配制的NADPH再生系統(tǒng)溶液（終體積：200μL，由 100mmol/L 磷酸鹽緩沖 （pH7.4），1.3mmol/LNADP+， 3.3mmol/LG-6-P， 0.4 U/m l G-6-PDH，3.3mmol/lMg2+，1mg/mL微粒蛋白組成）混合。反應由預孵育的再生系統(tǒng)（3.3mmol/LMg2+，1.3mmol/L NADP+，3.3mmol/LG-6-P， 0.4U/mlG-6-PDH）的加入啟動，混合物在37℃孵育60 min。然后，加入200μL乙腈，以離心半徑8.2 cm，14 000 r/min,離心10min。吸取100μL上清將其轉移入玻璃進樣瓶中，進樣量5μL。利用 TF軟件 Xcalibur Qual Browser 4.0.27.10版本進行系統(tǒng)控制和數據采集。

將空白NADPH再生系統(tǒng)溶液（未加微粒蛋白及母藥）溶液和未加母藥的孵育反應系統(tǒng)溶液作為對照同樣進行分析。同樣進行合成大麻素THJ-018在未加入微粒體的孵育體系中的穩(wěn)定性研究（37℃，1h），以確證代謝物由微粒體的引入而生成。

2 結果與討論

2.1 THJ-018及其代謝物的尋找與分析

共檢測出THJ-018的12種代謝產物，檢測質量誤差均在2.0 ppm以內（表1），分別是脫氫代謝物1種，加氫還原代謝物1種，合并脫氫和加氧反應代謝物1種，加氧反應代謝物9種。氧化發(fā)生在烷基鏈的代謝物共5種，發(fā)生在吲唑環(huán)的代謝物共3種，發(fā)生在萘環(huán)的代謝物共計1種。由代謝發(fā)生的位點及數目上來說，代謝優(yōu)先發(fā)生在烷基側鏈，其次是吲唑環(huán)，再次是萘環(huán)，氧化的目的是使分子極性增大，更有利于體內代謝后排出體外。圖2為母藥THJ-018及其代謝物的提取離子色譜圖。圖3闡釋了所有化合物的特征碎片離子及斷裂位點。根據提取離子色譜峰的峰面積，主要代謝物為加氫還原、脫氫和加氧、加氧反應產物。表1總結了孵育1h后所有代謝物的代謝反應類型、保留時間、分子離子的精確質量數[M+H]+（m/z）、理論質量數[M+H]+（m/z）、質量誤差、分子式、碎片離子和峰面積。代謝物被標記為“M”，代謝反應途徑由圖 4所示。

圖4 THJ-018在人肝微粒體中的代謝途徑

表1 THJ-018在人肝微粒體孵育1h后的推測代謝產物

續(xù)表1

2.2 討論

THJ-018的代謝產物以烷基鏈加氧氧化、萘環(huán)加氧氧化、羰基加氫還原及烷基鏈脫氫氧化和加氧氧化反應組合為主，這些代謝產物與肝細胞模型的代謝產物部分一致（即烷基鏈加氧反應、烷基鏈脫氫和加氧反應），肝微粒體代謝模型中發(fā)現了未在肝細胞代謝模型中出現的吲哚環(huán)加氧氧化反應，但并未在該實驗中發(fā)現如國外肝細胞模型中發(fā)現的二相代謝產物即結合葡萄糖醛酸的代謝產物[5]，且代謝產物的含量和種類上存在明顯差異。本研究建立了有效的肝微粒體模型，以及新型毒品THJ-018及代謝物的LC-MS檢測方法。該方法簡便快捷，為公安機關對生物檢材中新型毒品THJ-018的代謝物檢測提供了基礎與依據。

[1]CASTANETO M S，GORELICK D A，DESROSIERSN A，et al.Synthetic Cannabinoids:Epidemiology，Pharmacodynamics， and Clinical Implications[J].Drug&AlcoholDepend，2014（144）：12-41.

[2]United Nations on Drugs and Crime.World Drug Report 2016[DB/OL].（2016-00-00）[2017-01-03].http://www.unodc.org/wdr2016/.

[3]United Nations Office on Drugs and Crime.Global Smart Update Post-UNGASS 2016:NPS Trends，Challenges and Recommendations， Volume 16.Setember[DB/OL].（2016-03-15）[2017-01-03].http://www.unodc.org/ungass2016/en/documentation.htm l.

[4]GURNEY S M R， SCOTT K S， KACINKO S L， et al.Pharmacology， Toxicology， and Adverse Effects of Synthetic Cannabinoid Drugs[J].Forensic Sci Rev， 2014，26（1）:53-78.

[5]DIAO X X，WOHLFARTH A，PANG SK，etal.High-Resolution Mass Spectrometry for Characterizing the Metabolism of Synthetic Cannabinoid THJ-018 and Its 5-Fluoro Analog THJ-2201 after Incubation in Human Hepatocytes[J].Clincal Chemistry， 2016，62（1）:157-169.