沈 楊＊，張 琦＊，趙佳奇，田雅娟，李欽青，楚世峰，賀文彬

（1.山西省中醫(yī)藥研究院，山西太原 030012；2.山西中醫(yī)藥大學中醫(yī)腦病學山西省重點實驗室&腦藏象學山西省高等學校重點實驗室，山西太原 030619；3.中國醫(yī)學科學院藥物研究所，北京 100050）

丹參（Radix Salviae Miltiorrhizae）屬于唇形科鼠尾草屬植物，又名大紅袍、紅根赤參、血丹參等，是我國常用的中藥之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性苦，微寒，歸心、肝經(jīng)［1］。研究表明，丹參具有較強的清除氧自由基抗氧化的作用［2］，對于因缺糖缺氧所致的神經(jīng)元細胞損傷具有一定的保護功效［3］，其延緩衰老及改善記憶的作用也得到相應實驗的證實［4］。我們的前期研究表明，脂溶性丹參酮類成分丹參總酚酸（total salvianolic acids，Tsa）可通過抑制缺血側(cè)腦區(qū)的免疫炎癥反應和免疫細胞浸潤，改善外周免疫抑制，從而減輕腦卒中后繼發(fā)性炎癥反應，提高腦卒中患者的生活質(zhì)量［5］，對于調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及營養(yǎng)神經(jīng)元具有一定的意義。

PC12細胞是目前廣泛用于研究神經(jīng)細胞分化及凋亡的細胞模型［6-7］，研究藥物對PC12細胞的促分化作用是神經(jīng)藥理學中證明藥物具有神經(jīng)可塑性的有力證據(jù)。有研究表明，神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）可促進PC12細胞增殖分化［8］，并且其分化作用是通過激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）蛋白所產(chǎn)生的［9］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinas，MAPK）是研究細胞分化及損傷的常涉及的信號通路，其中ERK1/2與細胞增殖分化關(guān)系最密切［10］。但是，對于具有延緩衰老及改善記憶作用的丹參及其有效成分Tsa能否影響PC12細胞的增殖和分化，及其是否與ERK1/2蛋白相關(guān)，至今未見報道。

許多中草藥，如人參［11］、靈芝［12］和菟絲子［13］等提取物均有類NGF的作用，能促進PC12細胞分化。因此，本實驗以Tsa處理PC12細胞，探討Tsa對PC12細胞的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、細胞株、試劑和主要儀器

Tsa由中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供；未分化的PC12細胞由中國醫(yī)學科學院藥物研究所陳乃宏教授惠贈；DMEM與N2培養(yǎng)基購自于美國Gib?co；NGF（蘇肽生，舒泰神北京生物制藥公司）；馬血清、胎牛血清（Hyclone，美國）；胰蛋白酶（武漢博士德公司）；兔抗鼠微管相關(guān)蛋白質(zhì)2（microtubuleassociated protein2，MAP-2）多克隆抗體（Protein?tech，武漢三鷹）；兔抗鼠ERK1/2、磷酸化ERK1/2（phosphorylated ERK1/2，p-ERK1/2）、兔抗鼠MAPK激酶1/2（MEK1/2）和p-MEK1/2單克隆抗體（Cell Signaling，美國）；羊抗兔IgG二抗（武漢博士德）；ECL Western蛋白印跡化學發(fā)光檢測試劑盒、免疫印跡檢測試劑盒（江蘇康維公司）；U0126（Sigma，美國），其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

Cytation5細胞成像微孔板檢測儀（BioTek，美國）；CKX31SF、IX73顯微鏡（Olympus，日本）；Thermo371培養(yǎng)箱，X1R低溫高速離心機（Thermo，美國）；HHS-11-6電熱恒溫水浴鍋（上海博迅）。

1.2 PC12細胞的培養(yǎng)

PC12細胞于DMEM高糖培養(yǎng)基（含5%胎牛血清，5%馬血清，青霉素100 U ·L-1，鏈霉素100 mg ·L-1）37℃，5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，待單層培養(yǎng)細胞生長至80%以上后傳代培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測PC12細胞存活

取對數(shù)生長期的PC12細胞，以5×107L-1接種于96孔板，每孔100 μL置于37℃、CO2培養(yǎng)箱。細胞貼壁后，分為4組，每組3個復孔，分別為正常對照組、Tsa 0.01，0.1和1.0 μg·L-1，按分組加藥后置于培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)，24 h后，去上清液，分別加入10 μL MTT標記液（50 g·L-1），置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，再加入120 μL的DMSO，37℃振蕩15 min，使藍紫色甲臜充分溶解，于酶標儀測定570 nm條件下吸光度A570nm值。實驗重復3次。細胞存活率（%）=實驗組A570nm/正常對照組A570nm×100%。

1.4 氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）損傷模型的建立和分組

取對數(shù)生長期的PC12細胞，以5×107L-1接種于96孔板，每孔100 μL實驗分為正常對照組、OGD 模型組、OGD+Tsa 0.01，0.1和1.0 μg ·L-1組。按預實驗用含Na2S2O415 mmol·L-1的無糖Earle′s液建立PC12細胞的OGD損傷模型，即每孔用PBS沖洗3次后加入200 μL的Na2S2O4無糖Earle′s液，置于培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)2 h，即OGD損傷模型。Tsa處理組于OGD損傷2 h后加入終濃度為0.01，0.1和1.0 μg ·L-1的Tsa，作用24 h后，進行MTT實驗，檢測細胞存活率。

1.5 顯微鏡下觀察PC12細胞分化

為排除血清促進PC12細胞分化的影響，實驗采用無血清的N2培養(yǎng)基進行實驗。以5×107L-1細胞接種96孔板，每孔100 μL實驗分為N2培養(yǎng)基對照組、Tsa 0.01，0.1和1.0 μg·L-1組、NGF 50 μg·L-1（陽性對照）組。每2 d換液1次，加入Tsa 24 h后，分析每組細胞突起生長情況，并做統(tǒng)計分析。在顯微鏡下隨機選擇每孔的3個視野，觀察細胞突起的生長情況，若細胞出現(xiàn)1個或多個突起，即視為細胞分化。細胞分化率（%）=每視野分化細胞數(shù)/該視野總細胞數(shù)×100%。實驗重復3次。

1.6 Western蛋白印跡檢測MAP-2，p-ERK1/2，ERK1/2，p-MEK1/2和MEK1/2蛋白表達

收集經(jīng)Tsa或NGF處理24 h的PC12細胞，并用PBS洗滌3次，加入200 μL裂解液，冰浴30 min（每10 min混勻一次），4℃下24476×g離心30 min，收集上清，貯于-20℃?zhèn)溆?。再加入上樣緩沖液，100℃煮沸10 min后取出。樣品的蛋白定量使用BCA Protein Assay Kit（武漢博士德公司）。聚丙烯酰胺凝膠電泳，選擇與相對分子質(zhì)量相符的分離膠濃度。蛋白轉(zhuǎn)印，應用電轉(zhuǎn)印法將電泳條帶轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用5%牛血清白蛋白封閉PVDF膜非特異性抗原，加一抗（兔抗鼠MAP-2多克隆抗體1∶1000，p-ERK1/2、ERK1/2單抗 1∶1000，p-MEK1/2、MEK1/2單抗1∶1000）孵育、洗滌、加二抗（羊抗兔HRP-IgG 1∶2000）、孵育、洗滌。ECL化學發(fā)光顯影：用ECL試劑盒按說明書方法進行顯影曝光。采用GelPro 31對目的蛋白條帶進行積分吸光度（integrated ab?sorbance，IA）分析。待測蛋白相對表達水平用IA目標蛋白/IA內(nèi)參蛋白比值表示。

1.7 Western蛋白印跡檢測MEK抑制劑U0126對ERK1/2蛋白表達的影響

將細胞組分為正常對照組，U012610 μmol· L-1組，Tsa 1.0 μg ·L-1組及U0126+Tsa組。在實驗前加入MEK抑制劑U0126，2 h后加入Tsa，收集細胞樣本，實驗步驟同1.6。

1.8 統(tǒng)計學分析

計量資料以±s表示，應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 Tsa對PC12細胞存活的影響

MTT結(jié)果顯示（圖1），Tsa 0.01，0.1和1.0 μg·L-1作用24 h后，與正常對照組相比，Tsa 1.0 μg·L-1組PC12細胞的存活率升高90%（P＜0.01），Tsa 0.01和0.1 μg·L-1組細胞的存活率與正常對照組無統(tǒng)計學差異。提示Tsa 0.01，0.1和1.0 μg ·L-1對PC12細胞均無藥物毒性，Tsa 1.0 μg·L-1可促進細胞增殖。

Fig.1 Effect of total salvianolic acids（Tsa）on survival rate of PC12 cells.PC12 cells were treated with Tsa for 24 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 Tsa對OGD損傷的PC12細胞的修復作用

與正常對照組相比，OGD模型組細胞存活率明顯降低（P＜0.01），提示造模成功。與模型組相比，Tsa 0.1和1.0 μg ·L-1組細胞存活率分別上升至（47.7±1.8）%和（63.2±13.0）%（P＜0.05，P＜0.01），Tsa 0.01 μg ·L-1組細胞存活率無明顯改變（圖2）。提示Tsa 0.1和1.0 μg ·L-1對OGD損傷的PC12細胞具有修復作用。

Fig.2 Effect of Tsa on oxygen-glucose deprivation（OGD）injured PC12 cells.OGD injured PC12 cells were cultured by using Na2S2O415 mmol·L-1in Earle′s without sugar for 2 h.Then Tsa was added and acted for 24 h，respectively.±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with normalcontrolgroup； #P＜0.05，##P＜0.01，compared with OGD model group.

2.3 Tsa對PC12細胞分化的影響

N2培養(yǎng)基對照組的PC12細胞無明顯突起生成。Tsa處理PC12細胞24 h后，Tsa各濃度組的PC12細胞有多個細長突起生長（＞1倍胞體直徑）（P＜0.01），呈現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)特征（圖3）。提示Tsa能促進PC12細胞分化；但該作用與NGF 50 μg·L-1陽性對照組相比相對較弱（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of Tsa on differentiation of PC12 cells.PC12 cells in N2 medium were untreated or treated with Tsa and NGF（positive control）for 24 h respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with N2 medium control group；##P＜0.01，compared with NGF 50 μg·L-1group.

2.4 Tsa對PC12細胞MAP-2，p-ERK1/2，ERK1/2，MEK1/2和p-MEK1/2蛋白表達的影響

Western蛋白印跡結(jié)果顯示（圖4），Tsa作用于PC12細胞24h后，與正常對照組相比，Tsa1.0μg·L-1組 MAP-2蛋白表達升高（P＜0.01）。Tsa 0.1和1.0 μg ·L-1組的p-ERK1/2蛋白表達升高（P＜0.01），但Tsa各組ERK1/2總蛋白表達無統(tǒng)計學差異。

Tsa作用PC12細胞24 h后，與正常對照組相比，Tsa各組p-MEK1/2蛋白的表達增加（P＜0.05，P＜0.01），但MEK1/2總蛋白表達無統(tǒng)計學差異。

Fig.4 Effect of Tsa on expressions of microtubuleassociated protein2（MAP-2），extracellular signal-regu?lated kinase1/2（ERK1/2），phosphorylated ERK1/2（p-ERK1/2），mitogen-activated protein kinase kinase1/2（MEK1/2）and p-MEK1/2 in PC12 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.A2，B2 and C2 were the semi-quantitative results of A1，B1 and C1，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.5 MEK抑制劑U0126對Tsa誘導的PC12細胞ERK1/2蛋白磷酸化的影響

U012610 μmol·L-1作用PC12細胞1 h 后，加入Tsa 1.0 μg ·L-1作用6 h，結(jié)果顯示（圖5），與正常對照組相比，Tsa 1.0 μg ·L-1組p-ERK1/2蛋白表達明顯升高（P＜0.01），U0126抑制劑組p-ERK1/2蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；與Tsa 1.0 μg ·L-1組相比，Tsa 1.0 μg ·L-1+U0126組p-ERK1/2蛋白表達明顯降低（P＜0.01），提示抑制劑可抑制Tsa誘導的p-ERK1/2的表達。

Fig.5 Effect of U0126 on expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2 induced by Tsa 1.0 μg ·L-1.PC12 cells were pretreated with U012610 μmol·L-1and then treated with Tsa 1.0 μg·L-1 for 6 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding normal con?trol group；##P＜0.01，compared with corresponding Tsa 1.0 μg ·L-1 group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，Tsa可促進PC12細胞的增殖，對OGD損傷細胞具有修復作用。不同濃度的Tsa均能誘導PC12細胞突起生長，Tsa處理后均能激活PC12細胞MAP-2的表達，提示Tsa具有類NGF的作用。

有研究表明，NGF能激活Raf/MEK/ERK信號通路從而導致PC12細胞分化增殖［14］。Raf/MEK/ERK通路是MAPK通路中的一條重要分支，可被各種生長因子激活，與促進細胞分化關(guān)系密切［10，15］。Western蛋白印跡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度Tsa均可激活p-ERK1/2及其上游p-MEK1/2蛋白。加入MEK抑制劑U0126后，發(fā)現(xiàn)p-ERK1/2的表達可被抑制，提示Tsa誘導PC12細胞增殖分化的作用方式可能與NGF相似，即是通過調(diào)控ERK1/2蛋白來激活MAPK信號通路。

然而，在本研究中，Tsa雖對PC12細胞具有促進增殖分化的作用，但其促進分化的效果弱于NGF。傳統(tǒng)中藥配伍理論認為，將性能功效相類似的藥物配合使用可增強其療效，稱這種作用為“相須”。有研究者提出，除了單方以外，單味中藥作為組成方劑的原料，其在不同方劑中所表達的藥效不同［16］；也有研究發(fā)現(xiàn)，Tsa與三七總皂苷配伍后，其修復缺氧缺血心肌細胞的作用有所增強［17］。推測Tsa與其他藥物相須配伍后，或可起到協(xié)同增效作用，從而在促進細胞分化作用上與NGF達到同一水平。另外，本研究未將Tsa作用于原代細胞證明其誘導細胞分化，后續(xù)研究會將2種實驗進行對比，進一步證明Tsa的促分化作用。

綜上所述，Tsa能促進PC12細胞的增殖及分化，其作用與NGF相似。

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