孟凡榮，王甲朋，范麗雪，劉梅梅，李萬(wàn)華，劉大偉，隋 昕，駱 媛，楊 軍，王永安

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850；2.濟(jì)南軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東濟(jì)南 250014；3.中國(guó)人民解放軍第32104部隊(duì)，內(nèi)蒙古阿拉善 735400；4.山東省昌邑市婦幼保健院，山東昌邑 261300）

近年來(lái)，納米技術(shù)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，在光電子領(lǐng)域和生物領(lǐng)域由于其優(yōu)異的物理、化學(xué)性能和極大的潛在應(yīng)用前景而引起了人們廣泛關(guān)注［1-6］。納米材料研究的范圍，由最初的量子點(diǎn)等0維材料，延伸至了一維材料（納米竿）和三維立體空間結(jié)構(gòu)，研究的領(lǐng)域也由最初的無(wú)機(jī)材料（硅線等）擴(kuò)展到了有機(jī)小分子和高分子領(lǐng)域?，F(xiàn)階段已經(jīng)有大量成熟的納米材料制備手段［7］，能做到對(duì)納米材料形貌和尺寸的精密控制及大量制備。在生物領(lǐng)域，納米材料因其特殊的優(yōu)異的性能，在納米藥物載體，新型藥劑等方面，正得到大規(guī)模的研究和應(yīng)用［1-2，8-11］。

鬼臼毒類化合物是作用于癌細(xì)胞DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的非嵌入型抗腫瘤藥物，其衍生物依托泊苷（etoposide，VP-16）由于具有良好的廣譜抗腫瘤活性和低毒性而應(yīng)用于臨床，對(duì)于小細(xì)胞肺癌有良好的療效［12-14］。此外，VP-16還對(duì)惡性淋巴瘤、惡性生殖細(xì)胞瘤、白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌和食管癌等有一定療效。VP-16為中性親酯類藥物，脂溶性高，在使用時(shí)存在著水溶性差的問(wèn)題，限制了其應(yīng)用［15］。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，通常會(huì)加入增溶性輔助物質(zhì)改善其溶解性［16］。但增溶性添加物往往會(huì)引起低血壓和高過(guò)敏性的癥狀。為了改善其水溶性，傳統(tǒng)的做法是從藥物分子的角度入手，在分子水平上通過(guò)化學(xué)反應(yīng)接入水溶性基團(tuán)增加其溶解性［17-19］，這樣使合成步驟復(fù)雜，周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低，且藥物分子改構(gòu)后對(duì)其藥效產(chǎn)生不可預(yù)知的影響。

本研究旨在通過(guò)納米技術(shù)，將低水溶性藥物VP-16制備為140 nm尺寸的納米顆粒（nanoparti?cles，NP）懸濁液（VP-16 NP），鑒定其形貌和尺寸等物理表征、檢測(cè)其釋藥率和對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，考察其納米化后對(duì)藥效的影響。同時(shí)，構(gòu)建體外血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）模型，評(píng)價(jià)VP-16 NP的BBB穿透性，為以后該藥物治療如腦膠質(zhì)瘤等腦部腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞、試劑和儀器

新生2周的SD大鼠7～10只，雌雄不限，購(gòu)自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0011。KB口腔上皮癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。VP-16購(gòu)于北京凱森萊公司；RPMI1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；曲拉通（Trixon X100）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMEM-HG、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；膠原酶/分散酶購(gòu)自瑞士Roche公司；纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、ECM專用培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)ScienceCell公司；D-Hank′s液購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；大鼠內(nèi)皮細(xì)胞分離液購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限公司。熒光素鈉（flu?orescein disodium salt，F(xiàn)LU）購(gòu)自美國(guó) ACROS公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；Transwell 6孔板（0.4 μm）、96孔板均購(gòu)自美國(guó)Corning公司；三氯甲烷和四氫呋喃（THF）等試劑均為分析純，使用前未經(jīng)過(guò)純化處理，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BI-9000AT動(dòng)態(tài)散光儀，美國(guó)Brookhaven公司；BI-200SM光度計(jì)，美國(guó)Coherent公司；S4300掃描電子顯微鏡，日本日立公司；UV-Vis 2550紫外分光光度計(jì)，島津公司；Millicell?ERS-2，美國(guó)Milli?pore公司；CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、550型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；H-7650透射電鏡，日本日立公司。

1.2 VP-16 NP的制備與表征觀察

配制含VP-165 mmol·L-1的三氯甲烷溶液，用微量注射器取300 μL注入5 mL濃度為2%曲拉通水溶液中，勻速攪拌形成乳白色乳濁液，敞口攪拌使三氯甲烷緩慢揮發(fā)至溶液變澄清為止。離心3次（850×g，10 min）除去表面活性劑曲拉通。然后將NP分散于去離子水中，超聲30 min后得分散良好的懸濁液；進(jìn)一步將其滴于清潔硅片上，待水干后將硅片粘于樣品臺(tái)上，用掃描電子顯微鏡觀測(cè)其形態(tài)；最后，再將該懸濁液滴于銅網(wǎng)上，待水干后將銅網(wǎng)放置于樣品竿上，用透射電鏡觀測(cè)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)；吸取部分懸濁液采用0.22 μm膜過(guò)濾后，用動(dòng)態(tài)散光儀測(cè)粒徑。

1.3 VP-16粉末及VP-16 NP釋放曲線的測(cè)定［20］

VP-16標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精密稱取6.4 mg VP-16，用H2O∶THF（1∶1）配制成0.128 g ·L-1的溶液50 mL，分別取0.2，0.5，0.8，1.1，1.4，1.7，2.0，3.0 mL置于10 mL容量瓶中，用H2O∶THF（1∶1）稀釋，得到一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)285 nm吸光度值，做出其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

VP-16 NP濃度的測(cè)定：將VP-16 NP超聲，振蕩均勻后，取1 mL溶液，加入1 mL THF，密封超聲1 h后，測(cè)285 nm處吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出濃度。以生理鹽水為釋放介質(zhì)，體積200 mL，將待測(cè)物裝入透析袋中后置于釋放介質(zhì)中。每隔一定時(shí)間取3 mL溶液，然后補(bǔ)充3 mL相應(yīng)緩沖溶液，保證透析袋外溶液體積恒定。測(cè)定溶液在285 nm處的吸光度值，通過(guò)VP-16的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出累積藥物釋放率。VP-16粉末濃度的測(cè)定方法同VP-16 NP。

1.4 MTT比色法［21-23］檢測(cè)KB細(xì)胞存活

將細(xì)胞密度調(diào)整為每孔1×104細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)組每組重復(fù)4孔，加入測(cè)試藥物分別為VP-16飽和水溶液、VP-16 DMSO溶液、VP-16 NP和VP-16粉末，初始濃度分別為0.5 g·L-1，加樣時(shí)稀釋成梯度濃度1～48 μg·L-1。以只加培養(yǎng)液的細(xì)胞孔作為對(duì)照組，另設(shè)完全只加培養(yǎng)液無(wú)細(xì)胞的組為調(diào)零組，在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT（1g·L-1）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出每孔培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)570 nm處吸光度值（A570nm），計(jì)算細(xì)胞存活率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A570nm-調(diào)零組A570nm）/對(duì)照組A570nm-調(diào)零組A570nm×100%。

1.5 VP-16 NP的BBB穿透性評(píng)價(jià)

1.5.1 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離、提取和培養(yǎng)

取新生2周齡的SD大鼠10只，頸椎脫臼處死后75%乙醇消毒1～2 min后迅速斷頭，置冰塊上盛有冷D-Hank′s液的培養(yǎng)皿中，剪開頭皮與顱骨取出鼠腦，去除軟腦膜、腦干和海馬等，只留取腦皮質(zhì)用冷D-Hank′s液清洗3次后剪碎致1 mm3大小，再將其轉(zhuǎn)移到15 mL離心管，加入0.1%濃度Ⅱ型膠原酶（含DNaseⅠ）放置到37℃水浴鍋消化，1.5 h后離心（100×g，8 min，室溫），棄上清。加入20%BSA重懸后離心（1000×g，20 min，4℃），留取底部沉淀。再加入0.1%濃度的膠原酶/分散酶（含DNaseⅠ）消化1 h后離心（100×g，8 min，室溫），棄上清［24］。加入大鼠內(nèi)皮細(xì)胞分離液制成梯度界面，離心（1000×g，10 min，4℃）。吸取環(huán)狀乳白色層的細(xì)胞，將細(xì)胞清洗后加入內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液重懸，接種到FN包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，16 h后換全液，以后2～3 d換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底約70%時(shí)，每天換1次培養(yǎng)液直至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶。

1.5.2 體外BBB模型的建立及評(píng)價(jià)

將第1～2代原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞以每孔1.0×106個(gè)的密度接種到Transwell 6孔板上室，待生長(zhǎng)2～4 d后細(xì)胞融合［25］，通過(guò)4 h滲漏實(shí)驗(yàn)、TEER實(shí)驗(yàn)和FLU穿透性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)BBB模型，確認(rèn)符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

1.5.2.1 4 h滲漏實(shí)驗(yàn)

在Transwell的上室和下室分別加入一定體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，使之形成＞0.5 cm明顯的液面差，4 h后觀察是否還能維持＞0.5 cm明顯的液面差。

1.5.2.2 TEER實(shí)驗(yàn)

使用Millicell?ERS-2對(duì)模型進(jìn)行跨內(nèi)皮電阻值測(cè)量。按照其說(shuō)明書進(jìn)行操作，計(jì)算出有效電阻值（Ω·cm2）=（細(xì)胞孔電阻值-空白孔電阻值）×膜面積（cm2）［26］。

1.5.2.3 FLU穿透性實(shí)驗(yàn)

使用酶標(biāo)儀測(cè)定濃度分別為0，0.1，1，10和100 mg ·L-1的FLU的熒光強(qiáng)度，每個(gè)樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。上室加入FLU，按15，30和60 min采集下室液體。根據(jù)文獻(xiàn)記載的方法，測(cè)定并計(jì)算FLU穿透腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的單層量。根據(jù)公式V清（mL）=（CA×VA）/C初，CA為下室液體濃度；VA為下室液體體積；C初為上室液體初使?jié)舛?。以清除體積對(duì)時(shí)間作圖，斜率表示清除率（mL·min-1），清除率=P×S，P為穿透性，S為穿透膜的面積。按本實(shí)驗(yàn)分組的設(shè)定，Pt為空白無(wú)細(xì)胞的穿透系數(shù)，Pf為體外BBB模型組的穿透系數(shù)，Pe為最終待測(cè)藥物的穿透系數(shù)，S為細(xì)胞培養(yǎng)室的膜面積，本實(shí)驗(yàn)的S為4.67cm2。根據(jù)公式1/PeS=1/PtS-1/PfS推導(dǎo)出PeS=PfS×PtS/PfS-PtS，最終計(jì)算出穿透系數(shù)Pe［27］。

1.5.3 VP-16 NP的BBB穿透性測(cè)試

將VP-16 NP充分分散后加入Transwell上室1 mL（濃度10 mg ·L-1），下室加入2 mL D-Hank′s液，按30 min時(shí)間點(diǎn)采集，從下室采集200 μL，同時(shí)補(bǔ)給200 μL D-Hank′s液。按上述FLU穿透系數(shù)的計(jì)算方法，計(jì)算出VP-16 NP跨體外BBB的穿透系數(shù)。此外，將樣品用PBS離心清洗后，滴于清潔硅片上，小心放入銅網(wǎng)，待水干后用于透射電鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用GraphPad Prism5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。濃度效應(yīng)曲線采用Sigmoidal dose-response（variable slope）方程Y=Bottom+（Top-Bottom）/｛1+10〔^（LogIC50-X）×HillSlope〕｝擬合。

2 結(jié)果

2.1 制備的VP-16 NP表征

用高濃度表面活性劑可得到粒徑分布均勻的VP-16 NP。隨三氯甲烷的全部揮發(fā)，體系由乳白色乳濁液變澄清，即可獲得大量VP-16 NP。得到的VP-16 NP能在水溶液中良好分散，形成較為穩(wěn)定的懸濁液。掃描電子顯微鏡顯示，VP-16 NP近球形（圖1）；透射電鏡可見其內(nèi)部結(jié)構(gòu)為實(shí)心結(jié)構(gòu)（圖2）；經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射向儀測(cè)其粒子直徑為140 nm（圖3）。

Fig.1 Image of etoposide nanoparticles（VP-16 NP）by scanning electron microscope.

Fig.2 Image of VP-16 NP by transmission electron mi?croscope.

Fig.3 Image of VP-16 NP by dynamic light scattering.

2.2 VP-16粉末和NP懸濁液釋放率

在H2O∶THF溶劑中，VP-16的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=6.51353c-2.83685×10-4，A為285 nm處吸收峰值，c為濃度（g ·L-1），r=0.999。利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試藥物的累計(jì)釋放率（圖4），VP-16 NP的累計(jì)釋放率為VP-16粉末狀藥物的3倍。因?yàn)閂P-16 NP直徑為140 nm，尺寸的減小使得顆粒的比表面積增大，處于表面的分子數(shù)增多。

Fig.4 Cumulative release rate of VP-16 powder and VP-16 NP.The VP-16 standard curve determined the absor?bance of VP-16 NP and VP-16 powder at 285 nm in UV，and the concentration was brought into the standard curve to calcu?late the cumulative release rate of the drug.This was the result of one experiment.

2.3 VP-16 NP對(duì)KB細(xì)胞存活的影響

MTT結(jié)果顯示（圖5），VP-16粉末對(duì)KB細(xì)胞存活無(wú)明顯抑制作用，而VP-16 NP對(duì)KB細(xì)胞存活的抑制率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同濃度的VP-16粉末和溶解分散狀態(tài)的VP-16溶液（P＜0.01）。并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，VP-16 NP對(duì)KB細(xì)胞存活的抑制率增強(qiáng)，其半數(shù)抑制濃度（IC50）明顯降低。在不加入增（助）溶劑的情況下，VP-16 NP能有效抑制KB細(xì)胞存活。

2.4 VP-16 NP的體外BBB模型穿透性

Fig.5 Effects of VP-16 solution，VP-16 NP and VP-16 powder on survival of KB cells in 24 h（A），48 h（B）and 72 h（C）.VP-16 solution，VP-16 NP，and VP-16 powder concentration（1-48 μg·L-1）were added to the cells.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with VP-16 powder group;##P＜0.01，com?pared with VP-16 solution group.

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞以每孔1×106個(gè)密度接種到Transwell上室，在培養(yǎng)至2～4 d時(shí)，4 h滲漏實(shí)驗(yàn)觀察Transwell上室與下室能夠維持＞0.5 cm的液面差；TEER有效電阻值可達(dá)到223 Ω·cm2；FLU穿透性實(shí)驗(yàn)可得知，在15，30和60 min時(shí)，穿透系數(shù)分別為（0.33±0.04）×10-3，（0.42±0.07）×10-3和（0.52±0.06）×10-3cm·min-1，與文獻(xiàn)報(bào)道的范圍接近［27］。VP-16 NP在30 min時(shí)穿透系數(shù)為（1.87±0.03）×10-3cm·min-1，較相同時(shí)間點(diǎn)的FLU顯示出較高的穿透性（P＜0.01）。TEM可清晰地觀察到VP-16 NP，說(shuō)明VP-16 NP能夠穿透體外BBB模型（圖6）。

Fig.6 Images of VP-16 NP penetrating blood-brain barrier model in vitro by transmission electron microscope.Arrows show the penetration of VP-16 NP to BBB.

本研究通過(guò)乳液溶劑交換法［28-29］，制備得到了大量140 nm粒徑，粒徑分布均勻、呈典型球形的VP-16 NP，其制備工藝簡(jiǎn)便易行。經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)研究顯示，①VP-16 NP的藥物釋放率高于其粉末形態(tài)。相對(duì)于VP-16粉末，VP-16 NP由于其處于納米尺度，體積小，比表面積大，能與溶液有更多的接觸，固體的溶解量與溶解速度都比常規(guī)尺寸下的粉末高，所以其藥物釋放效率更高。并且在相同的體積下，VP-16 NP能與水有更大的有效接觸面積，使得顆粒的溶解速率和溶解量都大大增加，很快達(dá)到藥物的飽和濃度。而且藥物在體內(nèi)是一個(gè)不斷消耗的過(guò)程，VP-16 NP相比普通的粉末，能迅速溶解釋放出藥物分子，并持續(xù)維持藥物的飽和濃度。②VP-16 NP對(duì)癌細(xì)胞的抑制效果優(yōu)于其粉末形態(tài)和在DMSO中的溶解分散狀態(tài)?？拱┧幬镆话闶且苑肿拥男问竭M(jìn)入細(xì)胞，然后殺滅細(xì)胞或阻斷細(xì)胞有絲分裂。當(dāng)藥物分子被消耗，溶液變成未飽合狀態(tài)，VP-16 NP較高的溶解速率能保證體系迅速恢復(fù)至飽和濃度，維持藥物的高濃度狀態(tài)，提供充足的藥物分子殺傷癌細(xì)胞。大量的文獻(xiàn)也已證明，由于納米材料具有合適的尺寸，能作為優(yōu)秀的藥物載體［30］。VP-16 NP尺寸為140 nm，小于細(xì)胞膜孔道（200 nm），又由于其親脂性高，粒徑小，能直接通過(guò)細(xì)胞膜上的孔道進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)釋放出藥物分子殺死癌細(xì)胞，從而使其細(xì)胞殺傷率高于溶解狀態(tài)的藥物分子。

此外，通過(guò)原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)Transwell構(gòu)建體外BBB模型，采用經(jīng)典的4 h的滲漏實(shí)驗(yàn)、TEER實(shí)驗(yàn)及FLU穿透性實(shí)驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。在建模成功的基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)VP-16 NP穿透體

3 結(jié)論

外BBB模型的穿透性。經(jīng)計(jì)算，30min時(shí)，VP-16 NP的穿透系數(shù)為（1.87±0.03）×10-3cm·min-1，相對(duì)于穿透系數(shù)為（0.42±0.07）×10-3cm·min-1的FLU，顯示出很好的穿透性。由此可見，經(jīng)過(guò)納米技術(shù)的處理，大大地拓展了傳統(tǒng)化療藥物的應(yīng)用范圍和療效，尤其針對(duì)因水溶性極差而限制其應(yīng)用的抗癌藥物具有良好的應(yīng)用前景。

［1］ Min Y，Caster JM，Eblan MJ，Wang AZ.Clinical translation of nanomedicine ［J］.ChemRev，2015，115（19）：11147-11190.

［2］ Shi J，Kantoff PW，Wooster R，F(xiàn)arokhzad OC.Cancer nanomedicine：progress，challenges and opportunities［J］.Nat Rev Cancer，2017，17（1）：20-37.

［3］ Klimov VI，Mikhailovsky AA，Xu S，Malko A，Hollingsworth JA，Leatherdale CA，et al.Optical gain and stimulated emission in nanocrystal quan?tum dots［J］.Science，2000，290（5490）：314-317.

［4］ Lao YH，Phua KK，Leong KW.Aptamer nanomedi?cine for cancer therapeutics：barriers and potential for translation［J］.ACS Nano，2015，9（3）：2235-2254.

［5］ Huang MH，Mao S，F(xiàn)eick H，Yan H，Wu Y，Kind H，et al.Room-temperature ultraviolet nanowire nano?lasers［J］.Science，2001，292（5523）：1897-1899.

［6］ Yao S，Zhu Y.Nanomaterial-enabled stretchable conductors：strategies，materials and devices［J］.Adv Mater，2015，27（9）：1480-1511.

［7］ Nalwa HS.HandbookofNanostructured Materials and Nanotechnology［M］.San Diego：Elsevier，2000：631-639.

［8］ Ajima K，Yudasaka M，Murakami T，Maigné A，Shiba K，Iijima S.Carbon nanohorns as anticancer drug carriers［J］.Mol Pharm，2005，2（6）：475-480.

［9］ Orive G，Hernández RM，Gascón AR，Pedraz JL.Micro and nano drug delivery systems in cancer therapy［J］.Therapy，2005，3：131-138.

［10］ Portney NG，Ozkan M.Nano-oncology：drug delivery，imaging，and sensing［J］.Anal Bioanal Chem，2006，384（3）：620-630.

［11］ Dahlman JE， Barnes C， Khan O， Thiriot A，Jhunjunwala S，Shaw TE，et al.In vivoendothelial siRNA delivery using polymeric nanoparticles with low molecular weight［J］.Nat Nanotechnol，2014，9（8）：648-655.

［12］ Danks MK，Yalowich JC，Beck WT.Atypical multiple drug resistance in a human leukemic cell line selected for resistance to teniposide（VM-26）［J］.Cancer Res，1987，47（5）：1297-1301.

［13］ Bugg BY， Danks MK， Beck WT， Suttle DP.Expression of a mutant DNA topoisomerase Ⅱ in CCRF-CEM human leukemic cells selected for resistance to teniposide［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88（17）：7654-7658.

［14］ Giaccone G，Splinter TA，Debruyne C，Kho GS，Lianes P，van Zandwijk N，et al.Randomized study of paclitaxel-cisplatinversuscisplatin-tenipo?side in patients with advanced non-small-cell lung cancer.The European Organization for Research and Treatment of Cancer Lung Cancer Cooperative Group［J］.J Clin Oncol，1998，16（6）：2133-2141.

［15］ Kuo YC，Chen YC.Targeting delivery of etoposide to inhibit the growth of human glioblastoma multi?forme using lactoferrin-and folic acid-grafted poly（lactide-co-glycolide）nanoparticles［J］.Int J Pharm，2015，479（1）：138-149.

［16］ Yokoyama M，Satoh A，Sakurai Y，Okano T，Matsumura Y，Kakizoe T，et al.Incorporation of water-insoluble anticancer drug into polymeric micelles and control of their particle size［J］.J Control Release，1998，55（2-3）：219-229.

［17］ Senter PD， Saulnier MG， Schreiber GJ，Hirschberg DL，Brown JP，Hellstr?m I，et al.Antitumor effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phos?phate［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1988，85（13）：4842-4846.

［18］ Budman DR， Igwemezie LN， Kaul S， Behr J，Lichtman S，Schulman P，et al.Phase I evaluation of a water-soluble etoposide prodrug，etoposide phosphate，given as a 5-minute infusion on days 1，3，and 5 in patients with solid tumors［J］.J Clin Oncol，1994，12（9）：1902-1909.

［19］ Beig A，Miller JM，Lindley D，Carr RA，Zocharski P，Agbaria R，et al.Head-to-head comparison of different solubility-enabling formulations of etopo?side and their consequent solubility-permeability interplay［J］.J Pharm Sci，2015，104（9）：2941-2947.

［20］ Ritger，PL，Peppas NA.A simple equation for description of solute release Ⅱ.Fickian and anoma?lous release from swellable devices［J］.J Control Release，1987，5（1）：37-42.

［21］ Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J Immunol Methods，1983，65（1-2）：55-63.

［22］ Gerlier D，Thomasset N.Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation［J］.J Immunol Methods，1986，94（1-2）：57-63.

［23］ Twentyman PR，Luscombe M.A study of some variables in a tetrazolium dye（MTT）based assay for cell growth and chemosensitivity［J］.Br J Cancer，1987，56（3）：279-285.

［24］ Xu XF，Li RP，Li Q，Liu WW，Lian QL，Liu Y，et al.Isolation and primary culture of rat cerebral micro?vascular endothelial cells［J］.Chin J Cell Biol（細(xì)胞生物學(xué)雜志），2005，27：84-88.

［25］ Gao XH.Overcoming the blood-brain barrier for delivering drugs into the brain（跨血腦屏障腦部遞藥策略的研究）［D］.Shanghai：Fudan University（復(fù)旦大學(xué)），2014.

［26］ Wu F.Establishment of anin vitro modelof the blood-brain barrier（離體血腦屏障模型的建立）［D］.Hangzhou：Zhejiang University of Technology（浙江工業(yè)大學(xué)），2007.

［27］ Zhang SH，Ji LF，Ma J.Transendothelial electric resistance and permeability ofin vitromodel of no-contact co-culture blood-brain barrier［J］.Chin J Pharmacol Toxicol（中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志），2012，26（6）：882-887.

［28］ Lianos P，Lang J，Strazielle C，Zana R.Fluores?cence probe study of oil-in-water microemulsions.1.Effect of pentanol and dodecane or toluene on some properties of sodium dodecyl sulfate micelles［J］.J Phys Chem，1982，86（6）：1019-1025.

［29］ Shikata T，Hirata H，Kotaka T.Micelle formation of detergent molecules in aqueous media.2.Role of free salicylate ions on viscoelastic properties of aqueous cetyltrimethylammonium bromide-sodium salicylate solutions［J］.Langmuir，1988，4（2）：354-359.

［30］ Kang B，Chang S，Dai Y，Yu D，Chen D.Cell response to carbon nanotubes：size-dependent intra?cellular uptake mechanism and subcellular fate［J］.Small，2010，6（21）：2362-2366.