程云輝G Yun-hui 毛田米 - 黃 璐 陳茂龍 - 文 李 許 宙

(長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114)

基于酶法降解食源性蛋白質(zhì)并結(jié)合分離純化技術(shù)從酶解肽混合物中獲得活性肽一直被當作篩選食源性活性肽的經(jīng)典方法[1]，本課題組[2]前期已基于蛋白質(zhì)酶解物疏水性的差異，通過DA201-C型大孔吸附樹脂從大米蛋白質(zhì)胰酶(Trypsin)酶解物中分離出具有較強免疫活性的RPHs-A3(Rice protein hydrolysates-40% ethanol fraction)組分；為進一步提高RPHs-A3組分的純度和免疫活性，擬基于RPHs-A3組分帶電性的差異，繼續(xù)采用離子交換色譜對其進行分離純化。

中壓液相色譜壓力范圍為0.5～2.0 MPa，其壓力介于低壓與高壓液相色譜之間。與低壓柱色譜相比，具有分辨率高、分離速度快、可梯度洗脫等優(yōu)勢；與高壓液相色譜相比，盡管在穩(wěn)流、精度、檢測靈敏度方面還有差距，但其制備量大、可自主填充分離柱填料而提高分離選擇性等特點，使其成為近年來備受關(guān)注的活性肽分離純化新方法[3-4]。WorkBeads 40 Q是一種以季氨基為官能團的強陰離子交換劑，具有載量高、重復性與化學穩(wěn)定性好等特點，在實驗室或工業(yè)規(guī)模分離純化蛋白質(zhì)、多肽和核酸等領(lǐng)域具有良好的應用前景。

本研究擬以小鼠巨噬細胞RAW264.7 MTT增殖試驗SI值和脂多糖(LPS)炎癥模型NO釋放量為雙考察指標，利用WorkBeads 40 Q對RPHs-A3組分進行分離純化，在考察不同分離條件對大米免疫活性肽分離效果影響的基礎(chǔ)上，確定中壓離子交換色譜分離RPHs-A3的最佳條件，并進一步提高RPHs-A3組分的純度和免疫活性，為中壓離子交換色譜技術(shù)在活性肽分離純化中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大米蛋白：堿提酸沉法提??；

胰蛋白酶：合肥博美生物科技有限公司；

二甲基亞砜(DMSO)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)：上海生物工程有限公司；

DMEM培養(yǎng)基：美國HyClone公司；

胎牛血清(FBS)：美國Gibco公司；

小鼠巨噬細胞(RAW264.7)：江蘇省原子醫(yī)學研究所；

Work Beads 40 Q：杭州開泰生物技術(shù)有限公司；

氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、Tris、鹽酸：分析純試劑，上海國藥集團有限公司；

其他試劑：分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

臺式pH計：DELTA320型，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；

可見分光光度計：22PC型，上海棱光技術(shù)有限公司；

玻璃層析柱：2.6 cm×40 cm色譜柱，利穗科技有限公司；

全自動蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：APPS MV 100D型，利穗科技有限公司；

酶標分析儀：DNM-9602型，北京普朗新技術(shù)有限公司；

恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9052型，蘇州威爾實驗用品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大米活性肽RPHs-A3組分的制備工藝流程

一定底物濃度大米蛋白懸浮液→調(diào)pH值→一定溫度下超級恒溫水浴酶反應器中溶解30 min→按不同底物濃度、加酶量、pH值、溫度進行酶解(pH-stat法使體系pH穩(wěn)定)→滅酶(85 ℃，15 min)→離心(3 500 r/min，15 min)→上清液→真空濃縮(終體積為5～10 mL)→冷凍干燥(-45 ℃，30 Pa 以下，40 h)→大米蛋白酶解物RPHs→DA201-C型大孔吸附樹脂吸附、脫鹽→40%乙醇洗脫→RPHs-A3組分[5]

1.2.2 中壓離子交換色譜分離方法

(1) 離子交換劑的選擇：采用強陰離子交換樹脂WorkBeads 40 Q對RPHs-A3組分進行分離純化。前期研究確定RPHs-A3組分的等電點范圍為pH 2.25～3.50，因此使RPHs-A3組分帶負電的pH范圍為pH>3.50，又因WorkBeads 40 Q的pH穩(wěn)定范圍為2～13，故選擇WorkBeads 40 Q對RPHs-A3組分進行分離純化。

(2) 起始緩沖液pH的選擇：采用試管小試法[6]98-99確定緩沖液起始pH。首先分別配制0.50，0.01 mol/L的不同pH的緩沖液，pH以1.0為梯度，從2.0增至11.0。取10 mL的試管，每管加入1.5 mL樹脂，然后依次在每支試管中加入0.5 mol/L的不同的緩沖液10 mL，混合一段時間后棄去上清液，如此反復洗滌10次。再換用0.01 mol/L的緩沖溶液，每次10 mL反復洗滌5次[7]。向洗滌好的樹脂中分別加入等量濃度相同的大米免疫活性肽溶液，充分混合后，放置5～10 min后，測定上清液中未被吸附的蛋白含量。

(3) 中壓離子交換色譜分離RPHs-A3組分的條件：將處理好的Work Beads 40 Q樹脂填充到2.6 cm×40 cm規(guī)格的玻璃柱中，用0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)以10 mL/min的速度平衡層析柱3～4 BV；用平衡緩沖液配制濃度為30 mg/mL的大米免疫活性肽溶液，上樣量5 mL，上樣流速0.5 mL/min；上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液以10 mL/min 的流速進行洗脫，在220 nm波長下檢測洗脫液吸光值，收集穿透峰；然后用0.0～0.5 mol/L的NaCl進行梯度洗脫，收集洗脫峰；對各組分進行脫鹽后濃縮干燥，得到不同分離組分。

1.2.3 RPHs-A3分離組分免疫活性的測定

(1) 小鼠巨噬細胞增殖試驗：采用MTT法，取對數(shù)期的RAW264.7細胞，細胞濃度為7×105個/mL、100 μL并接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h后，加入大米免疫活性肽，空白對照組加等量的無菌水，陽性對照組加等量IgG，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育20 h；在終止孵育前4 h加入20 μL MTT(5 mg/L)；棄掉每孔中的液體，向孔中加入150 μL二甲基亞砜，避光條件下輕震5 min[8]，采用酶標儀在492 nm檢測吸光度(OD值)，并按式(1)計算SI值。

(1)

式中：

SI——細胞增殖指數(shù)；

OD1——試驗組OD值；

OD2——對照組OD值。

(2) 小鼠巨噬細胞RAW264.7的NO釋放量的測定：當培養(yǎng)皿中的細胞生長至對數(shù)期時，棄去細胞培養(yǎng)基上清，用移液槍吸取無菌PBS將細胞輕輕吹下，離心收集細胞，96孔培養(yǎng)板中接種3×104個/孔的細胞，每孔200 μL細胞液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，以3復孔為一組，分為對照組、LPS炎癥模型組、RPHs-A3和RPHs-A3-B(1～5)預處理組，根據(jù)文獻[9]修改如下：

① 對照組：均加入含10% FBS的DΜEM培養(yǎng)基；

② 炎癥模型組：加入含10% FBS的DΜEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，再加入用DΜEM培養(yǎng)基稀釋的LPS溶液，培養(yǎng)24 h；

③ RPHs-A3和RPHs-A3-B(1～5)預處理組：加入用DΜEM培養(yǎng)基稀釋的RPHs-A3和RPHs-A3-B(1～5)溶液，使RPHs-A3和RPHs-A3-B(1～5)的終濃度均為50 μg/mL，陽性對照組加等量IgG，培養(yǎng)12 h，加入用DΜEM培養(yǎng)基稀釋的LPS溶液，培養(yǎng)24 h。

收集細胞培養(yǎng)基上清，于4 ℃、12 000×g低溫離心5 min 以去除細胞雜質(zhì)等。用GRIESS法檢測上清中的NO含量。并按式(2)計算NO抑制率。

(2)

式中：

IR——NO抑制率；

c1——LPS刺激產(chǎn)生NO濃度；

c2——RPHs-A3-B(1～5)預處理后產(chǎn)生NO濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 中壓離子交換色譜分離條件的優(yōu)化

2.1.1 試管小試法確定緩沖液起始pH 緩沖液起始pH值的選擇對離子交換色譜吸附特性很關(guān)鍵[10]，緩沖液起始pH決定了RPHs-A3組分及WorkBeads 40 Q的帶電狀態(tài)，確保WorkBeads 40 Q帶充足電荷的同時決定了RPHs-A3組分帶電荷的種類和數(shù)量，是RPHs-A3組分是否發(fā)生吸附的重要參數(shù)[6]86。本研究考察了在不同緩沖液起始pH下WorkBeads 40 Q對RPHs-A3組分的吸附效果，結(jié)果見表1。由表1可知，起始pH對RPHs-A3組分吸附效果影響較大，在pH為9.0的條件下，上清液中RPHs-A3組分的含量最低，為2.01 mg/mL，說明在此pH條件下RPHs-A3組分在WorkBeads 40 Q樹脂上的吸附量最大，因此確定pH 9.0為最佳起始pH。

表1不同起始pH下WorkBeads 40 Q對RPHs-A3的吸附?

Table 1 The Adsorption of RPHs-A3 by WorkBeads 40 Q at different initial pH

起始pH含量/(mg·mL-1)起始pH含量/(mg·mL-1)2.05.657.04.903.05.488.04.164.05.449.02.015.05.1710.02.716.05.4111.03.11

? 上樣濃度5 mg/mL。

2.1.2 離子強度變化方式對RPHs-A3組分分離效果的影響

WorkBeads 40 Q強陰離子層析柱的分離原理是基于溶質(zhì)分子所帶電荷性質(zhì)和電荷量的不同而使其在層析柱中移動速度不同來實現(xiàn)分離的[11]。本研究探索了不同離子強度變化方式對WorkBeads 40 Q分離純化RPHs-A3組分的影響，以確定最佳分離條件。選擇起始緩沖液為pH 9.0、0.01 mol/L 的Tris-HCl緩沖液，極限緩沖液為含0.5 mol/L NaCl的pH 9.0、0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液，通過中壓液相色譜將2種緩沖液按一定比例混合，可以得到NaCl濃度在0.0～0.5 mol/L連續(xù)變化的離子強度梯度。圖1為采用梯度洗脫方式分離RPHs-A3組分的圖譜，由圖1可知，隨著離子強度的增大，RPHs-A3組分依次被分為5個組分，選擇性差導致分辨率較低，分離效果較差；圖2為采用階段洗脫方式分離RPHs-A3組分的圖譜，由圖2可知，階段洗脫方式對RPHs-A3組分的分離效果較好，選擇性好，分辨率較高。RPHs-A3組分在不同的離子強度下依次被分為5個組分，穿透峰RPHs-A3-B1為未被吸附的部分，組分RPHs-A3-B2、RPHs-A3-B3、RPHs-A3-B4、RPHs-A3-B5依次為含0.05，0.10，0.20，0.30 mol/L NaCl的pH 9.0，0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液從離子交換劑上洗脫下來的組分。由于起始緩沖液的離子強度較低，RPHs-A3組分與WorkBeads 40 Q上季氨基之間結(jié)合能力更強，能取代緩沖液離子而吸附到WorkBeads 40 Q上。但隨著離子強度增大，緩沖液離子會與RPHs-A3組分競爭結(jié)合WorkBeads 40 Q，從而減弱了RPHs-A3組分與WorkBeads 40 Q之間的靜電作用力，首先使一些帶凈電荷較少、吸附得不太牢固的活性肽解吸而被洗脫下來；繼續(xù)增大離子強度，使結(jié)合得更為牢固的一些活性肽被洗脫，各個組分將在特定離子強度的緩沖液中被洗脫下來，從而實現(xiàn)分離[12]。比較圖1和圖2可知，階段洗脫分離RPHs-A3組分的效果要優(yōu)于梯度洗脫。由于梯度洗脫的離子強度是連續(xù)增加的，洗脫峰也連續(xù)被洗脫下來，選擇性較差導致分辨率降低；階段洗脫的離子強度是逐級增加的，各級洗脫峰相距較遠，分辨率提高。本研究后續(xù)將選擇階段洗脫方式對大米免疫活性肽RPHs-A3組分進行分離純化。

色譜柱尺寸為2.6 cm×40 cm；離子交換劑為WorkBeads 40 Q；樣品為5 mL、20 mg/mL RPHs-A3組分；平衡緩沖液A為pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；上樣流速1 mL/min；洗脫流速10 mL/min

圖1 離子強度線性洗脫分離RPHs-A3組分圖譜

Figure 1 The separation of fraction RPHs-A3 by linear elution of different ionic strength

色譜柱尺寸為2.6 cm×40 cm；離子交換劑為WorkBeads 40 Q；樣品為5 mL、30 mg/mL RPHs-A3組分；平衡緩沖液A為：pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；上樣流速1 mL/min；洗脫流速10 mL/min

圖2 離子強度階段洗脫分離RPHs-A3組分圖譜

Figure 2 The separation of fraction RPHs-A3 by stage elution of different ionic strength

2.1.3 上樣量對RPHs-A3組分分離效果的影響 本研究探索了上樣量對分離效果的影響，在不同上樣量條件下WorkBeads 40 Q對RPHs-A3組分的分離效果見圖3。由圖3可知，隨著上樣量的增加，分離效果逐漸變差，分辨率降低，其原因是上樣量過大超出了WorkBeads 40 Q的有效交換容量。兼顧考慮分離效率，在保證分離效果的前提下通常會選擇大的上樣量，故以30 mg/mL、5 mL為最佳上樣量。本研究選用WorkBeads 40 Q強陰離子交換樹脂、2.6 cm×40 cm色譜柱對RPHs-A3組分進行分離的較佳條件確定為：上樣濃度30 mg/mL，上樣量5 mL，平衡緩沖液A為pH 9.0的0.01 mol/L Tris-HCl，洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的pH 9.0、0.01 mol/L Tris-HCl，上樣、洗脫流速分別為1，10 mL/min。

色譜柱尺寸為2.6 cm×40 cm；離子交換劑為WorkBeads 40 Q；樣品為5 mL不同濃度的RPHs-A3組分；平衡緩沖液A為：pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl的pH 9.0，0.01 mol/L Tris-HCl；上樣流速1 mL/min；洗脫流速10 mL/min

圖3 不同上樣量條件下RPHs-A3組分分離圖譜

Figure 3 The separation of fraction RPHs-A3 under different loading conditions

2.2 中壓離子交換色譜分離組分免疫活性的研究

本研究分別以小鼠巨噬細胞RAW264.7 MTT增殖試驗SI值和脂多糖(LPS)炎癥模型細胞內(nèi)NO釋放量為考察指標，考察了中壓離子交換色譜各分離組分的免疫活性，結(jié)果見圖4、5。

*與對照相比，P<0.05；**與RPHs相比，P<0.01；B1、B2、B3、B4、B5分別對應RPHs-A3-B1、RPHs-A3-B2、RPHs-A3-B3、RPHs-A3-B4、RPHs-A3-B5，A3對應RPHs-A3

圖4 RPHs-A3-B(1～5)對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖活性的影響

Figure 4 The effect of fractions RPHs-A3-B(1～5) on proliferation of Murine Macrophage RAW264.7

##與對照相比，P<0.01；*與炎癥組相比，P<0.05；**與炎癥組相比，P<0.01;B1、B2、B3、B4、B5分別對應RPHs-A3-B1、RPHs-A3-B2、RPHs-A3-B3、RPHs-A3-B4、RPHs-A3-B5，A3對應RPHs-A3

圖5 RPHs-A3-B(1～5)對脂多糖(LPS)炎癥模型NO釋放的影響

Figure 5 The effect of fractions RPHs-A3-B (1～5) on intracellular NO release inlipopolysaccharide (LPS) inflammation model

從圖4可知，組分RPHs-A3-B2、RPHs-A3-B3、RPHs-A3-B5對RAW264.7細胞皆具有較好的增殖作用，其SI值分別為1.152，1.315，1.206，與RPHs-A3組分(SI值為1.273)相比，RPHs-A3-B3組分的SI值顯著提高(P<0.05)。

由圖5可知，50.00 μg/mL的各分離組分對NO釋放的抑制效果有著明顯差異，RPHs-A3-B4對NO釋放無抑制作用；RPHs-A3-B1、RPHs-A3-B2和RPHs-A3-B5 3個組分對NO釋放有抑制作用，但效果不顯著；而RPHs-A3-B3組分則對NO釋放具有顯著抑制作用(P<0.05)，NO濃度可由LPS刺激的(7.605±0.000) μmol降至(6.975±0.008) μmol(P<0.05)，抑制率為8.28%。MTT試驗活性檢測結(jié)果和炎癥模型活性檢測結(jié)果皆表明中壓離子交換色譜分離純化獲得的免疫活性最佳組分為RPHs-A3-B3，后續(xù)研究擬將采用低壓凝膠過濾色譜繼續(xù)對其進行分離純化。

3 結(jié)論

中壓色譜是對常壓色譜的延續(xù)與發(fā)展，具有分辨率高、分離速度快、可梯度洗脫、制備量大、可自主填充分離柱填料等優(yōu)點。目前多用于天然產(chǎn)物的分離純化，在生物活性肽領(lǐng)域里的應用較少，還有待進一步的研究。本研究表明中壓離子交換色譜能顯著提高大米免疫活性肽RPHs-A3組分的免疫活性，使其SI值從1.273提高到1.315(P<0.05)，且對細胞內(nèi)NO釋放的抑制率為8.28%(P<0.05)。本研究不僅得出了中壓離子交換色譜分離純化大米免疫活性肽RPHs-A3組分的最佳條件，同時也為中壓離子交換色譜技術(shù)在活性肽分離純化中的應用提供了理論依據(jù)。

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