李祥龍 Xiang-long 李曉梅 - 楊 煦 唐 磊 許靖逸,2,3 -,2,3

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院, 四川 成都 611830；2. 四川省茶業(yè)科學與工程重點實驗室, 四川 成都 611830；3. 四川省藏茶茶業(yè)工程技術研究中心, 四川 雅安 625014)

脂肪酶，又稱甘油酯水解酶，是水解脂肪的一類酶的總稱，隸屬于羧基酯水解酶類[1]。Chiesi等[2-3]的研究表明，脂肪酶與肥胖關系密切，利用脂肪酶抑制劑可有效抑制腸道中脂肪酶的活性，減少進入體內(nèi)的脂肪代謝，影響體內(nèi)脂肪的積累和合成，從而達到減肥的目的。

黑茶(Black Tea)屬于后發(fā)酵茶，是六大茶類中唯一一類有微生物參與其加工過程及品質(zhì)形成的特殊茶類，主產(chǎn)于湖南、湖北、云南、四川、廣西等省(區(qū))。黑茶是六大茶類中加工鮮葉原料最粗老的茶類，多采用四葉五葉、甚至修剪枝葉，其茶葉多糖的含量為六大茶類之首。研究發(fā)現(xiàn)，黑茶具有抗氧化[4]、抑菌和降脂減肥[5-6]等多種藥理功效，特別是其良好的降脂減肥功效已從細胞、動物和人體等多個方面得到證明，但其降脂減肥的功效成分及作用機理尚不清楚。茶褐素是黑茶中主要的色素類物質(zhì)，也是重要的功能成分，由茶黃素和茶紅素進一步氧化而成，具有良好的降脂減肥功效[7-9]。茶多糖是從茶葉中提取的活性多糖的總稱，研究[10]發(fā)現(xiàn)，茶多糖具有降低游離脂肪酸的作用。目前，茶褐素和茶多糖對脂肪酶的抑制作用還未見報道，因此本試驗擬通過研究不同地區(qū)黑茶中茶褐素和茶多糖的降脂減肥功效，為黑茶的保健功效及其進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)，為尋找天然的降脂減肥材料提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱茶(熟茶)：2014年，云南下關沱茶(集團)股份有限公司；

康磚：2014年，四川吉祥茶業(yè)有限公司；

茯磚：2014年，湖南省白沙溪茶廠股份有限公司；

六堡茶：2014年，廣西壯族自治區(qū)梧州茶廠；

脂肪酶(豬胰中提取，PPL，typeⅡ)：酶活力≥30 000 U/g，美國Sigma公司；

4-硝基苯基丁酸酯(p-NPB)、對硝基苯酚(p-NP)、二甲基亞砜(DMSO)、Tris、無水乙醇、95%乙醇、無水丙酮、無水乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇等：國產(chǎn)分析純；

水浴恒溫振蕩器：SHY-2A型，常州國宇儀器制造有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-250型，上海申賢恒溫設備廠；

高速冷凍離心機：2-16K型，美國Sigma公司；

紫外-可見分光光度計：UV-2300型，日本日立公司；

精密微量移液器：WKY III型，上海佳安分析儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE52-86A型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

(1) 脂肪酶液配制：精確稱取0.500 0 g脂肪酶于研缽中，加少許Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)研磨，定容至100 mL容量瓶中，靜置，4 ℃下12 000 r/min冷凍離心1 min，保存于-20 ℃冰箱中備用，即濃度為5 mg/mL的酶儲備液[11-12]。

(2) 底物配制：精確稱取一定量的p-NPB，用DMSO配置成濃度為0.01 mol/L的儲備液，置于-20 ℃冰箱中備用。

(3) 對硝基苯酚溶液配制：精確稱取一定量的p-NP，用DMSO配制成10 μmol/mL的溶液備用。

(4) 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)配制：精確稱取6.057 5 g Tris溶于水，定容至250 mL；取25 mL Tris溶液加到含有25 mL 0.1 mol/L HCl的100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。

1.2.2 黑茶茶褐素的制備 分別稱取黑茶茶樣各40 g，按1∶20 (g/mL)茶水比加入沸蒸餾水，浸提30 min，重復3次，合并浸提液，4層紗布過濾，所得濾液再抽濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得萃取液。萃取液用等體積正丁醇、氯仿、乙酸乙酯萃取3次，合并水相，減壓濃縮，干燥[13]。

采用系統(tǒng)比色法[14]檢測茶褐素含量。

1.2.3 黑茶茶多糖的制備 分別稱取茶樣20.0 g，粉碎，在茶水比1∶20 (g/mL)，溫度70 ℃的條件下，浸提30 min，趁熱抽濾，重復浸提3次，合并濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至原體積的20%。將濃縮后的茶湯與3倍體積95%的乙醇混合沉淀1 h，再于7 000 r/min離心5 min，得到沉淀物用無水乙醇、丙酮、乙醚交替洗滌2次，并在70 ℃下真空干燥[15]。

采用蒽酮-硫酸比色法[16]測茶多糖含量。

1.2.4 脂肪酶活性測定 取6支試管，分別加入10 μmol/mL 對硝基苯酚1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，用DMSO補充到5 mL，以未加對硝基苯酚的空白溶液作對照，在405 nm 波長處測吸光度，以吸光度值為縱坐標，對硝基苯酚濃度為橫坐標，得到對硝基苯酚的標準曲線[17-18]。

將0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0) 2 100 μL、酶液300 μL置于37 ℃恒溫箱內(nèi)預熱15 min，然后將其注入100 μL底物溶液中，搖床15 min，立即加入無水乙醇5 mL終止反應，以未加脂肪酶的空白溶液為參照，在405 nm波長處測其吸光度值。對照對硝基苯酚標準曲線，即可求得對硝基苯酚的濃度。

脂肪酶活力單位定義為：在一定條件下，每分鐘釋放出1 μmoL 對硝基苯酚的酶量定義為一個酶活力單位(U)。計算公式：

(1)

式中：

X——脂肪酶活力，U/mL；

c——對硝基苯酚的濃度，μmoL/mL；

V——反應液終體積，mL；

t——反應時間，min；

V′——酶液用量，mL。

脂肪酶抑制率的測定按照上述脂肪酶活力的測定方法，先加入定量的Tris-HCl緩沖液(pH=8.0)、茶褐素(茶多糖)和脂肪酶液，預熱，再加入底物溶液，終止反應，測定剩余酶活性，按式(2)計算抑制率。

(2)

式中：

I——抑制率，%；

X——脂肪酶活力，U/mL；

X′——抑制后酶活力，U/mL。

1.2.5 半抑制濃度的測定 測定各黑茶茶褐素(茶多糖)濃度在0.00，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00，80.00 mg/mL時對脂肪酶的抑制率，以各黑茶茶褐素(茶多糖)濃度為橫坐標，脂肪酶抑制率為縱坐標，作回歸曲線，得出半抑制濃度IC50。半抑制濃度越小，抑制能力越強。

1.2.6 脂肪酶抑制動力學的測定 在無抑制劑和適宜濃度的各黑茶茶褐素(茶多糖)條件下，加入一定量質(zhì)量濃度為0，2，3，4，5 mg/mL酶溶液，按照上述酶活測定方法測定吸光度，計算反應速率。按Dixon作圖法，以反應速率對脂肪酶濃度作圖，確定抑制類型[19-20]。

將各黑茶茶褐素(茶多糖)稀釋至一定的濃度，分別取300 μL 加入至300 μL酶液中，然后將其加入至底物濃度分別為0.001，0.002，0.003，0.004 mmol/L反應體系中，測定酶反應速度。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，將1/V對1/[S]作圖，測定各黑茶茶褐素(茶多糖)對脂肪酶的可逆抑制作用類型。

1.3 數(shù)據(jù)記錄與處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差 (SE)表示，不同組間的比較采用LSD法進行方差分析，檢驗水平a=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試茶樣主要理化成分含量及分析

由表1可知，經(jīng)過渥堆發(fā)酵的4種黑茶中，茯磚茶的多酚類含量最高，為13.96%，其次為康磚，六堡茶和普洱茶的多酚類含量相對較低。通過對茶色素含量的對比分析，表明茯磚茶的茶黃素和茶紅素含量分別為0.29%和1.02%，顯著高于其他3種；但茶褐素僅為3.17%，顯著低于普洱茶(8.17%)和六堡茶(5.91%)。根據(jù)這3個主要指標的測定結(jié)果，可得出茯磚茶渥堆發(fā)酵程度最輕，而普洱茶和六堡茶渥堆發(fā)酵程度最重。

2.2 各黑茶茶褐素與茶多糖對脂肪酶活性的影響

在不同濃度的對硝基苯酚溶液下，以不加對硝基苯酚的空白溶液作為對照，得到對硝基苯酚標準曲線為y=0.063 7x-0.018 5，R2=0.999 5。

按照1.2.5所示的脂肪酶的半抑制濃度的測定方法，分別測定普洱茶(熟茶)、六堡茶、茯磚和康磚的茶褐素與茶多糖在濃度梯度為0.00，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00，60.00，80.00 mg/mL條件下對脂肪酶抑制效果，結(jié)果見圖2。

表1 受試茶樣主要理化成分含量結(jié)果?Table 1 Results of main physical and chemical components in tea samples (n=4) %

? 同列小寫字母表示0.05顯著水平。

圖1 各黑茶不同濃度的茶褐素與茶多糖對脂肪酶活性的影響Figure 1 Effects of different concentrations of tea theabrownin and tea polysaccharide on lipase activity in different black tea

由圖1、表2可知，不同黑茶的茶褐素與茶多糖對脂肪酶活性均存在一定抑制作用，且隨茶褐素與茶多糖濃度的增加，在一定濃度范圍內(nèi)對脂肪酶的抑制作用呈上升趨勢。各黑茶茶褐素抑制脂肪酶活性以普洱茶褐素IC50最小，為25.96 mg/mL，抑制作用最強；茯磚的茶褐素IC50最大，為57.08 mg/mL，抑制作用最小。各黑茶茶多糖對脂肪酶活性抑制作用表現(xiàn)為：普洱茶茶多糖IC50最小，為47.57 mg/mL，抑制效果最好；茯磚茶多糖IC50最大，為662.44 mg/mL，抑制效果最差。

表2各黑茶茶褐素與茶多糖對抑制脂肪酶活性的IC50?

Table 2 Inhibition of lipase activity by tea theabrownin and tea polysaccharide onIC50mg/mL

? 同列小寫字母表示0.05顯著水平。

2.3 不同黑茶茶褐素與茶多糖對脂肪酶的抑制作用

由圖2可知，普洱茶、六堡茶、茯磚茶、康磚茶中存在的茶褐素對脂肪酶均有抑制作用，且抑制類型均為可逆抑制。劉睿等[21]通過在酶活測定體系中加入定量的抑制劑，以不同酶濃度測定酶活力，以酶濃度為橫坐標，反應速率為縱坐標作圖發(fā)現(xiàn)，體系中無抑制劑，該直線通過原點；當體系中存在一定量可逆抑制劑時，亦可得一條斜率相對較低且過原點的直線。各黑茶茶多糖對脂肪酶的抑制類型如圖3所示，結(jié)果表明普洱茶(熟茶)、六堡茶、茯磚茶與康磚茶中的茶多糖均對脂肪酶有抑制作用，且這種抑制作用類型均為可逆抑制。

2.4 黑茶茶褐素與茶多糖對脂肪酶的可逆性抑制類型

圖4為各黑茶茶褐素對脂肪酶的可逆抑制雙倒數(shù)Lineweaver-Burk作圖結(jié)果。在Lineweaver-Burk圖中，直線交于橫軸為非競爭性抑制，交于縱軸為競爭性抑制，交于第二象限為競爭性與非競爭性混合抑制[22]。普洱茶、六堡茶、茯磚、康磚的茶褐素濃度為2.5，5.0 mg/mL時，直線均交于第二象限，通過對比，可以看出圖4(b)、(c)的直線交點比其他2個更靠近縱軸，說明其抑制類型為競爭性與非競爭性混合抑制，接近于競爭性抑制作用；而圖4(a)、(d)直線的交點稍遠于縱軸，說明抑制類型為典型的競爭性與非競爭性混合抑制。

通過對比可以看出圖5(b)、(d)的直線均交于第二象限，表明其抑制類型為競爭性與非競爭性混合型抑制作用；圖5(a)的直線交于第二象限且直線交點靠近縱軸，說明其抑制類型為競爭性與非競爭性混合型抑制，接近于競爭性抑制類型；圖5(c)中，該組直線相交于縱軸，表明其為競爭性抑制類型。

3 結(jié)論

(1) 4種黑茶中普洱茶、六堡茶的渥堆發(fā)酵程度最重，茯磚茶的渥堆發(fā)酵程度最輕，康磚茶居中。通過各黑茶IC50的比較分析可知，普洱茶(熟茶)減肥降脂效果最好，六堡茶次之，茯磚最差，康磚介于六堡茶和茯磚之間。

圖2 黑茶茶褐素對脂肪酶的抑制作用Figure 2 Inhibitory effect of different black tea theabrownin on lipase

圖3 黑茶茶多糖對脂肪酶的抑制作用Figure 3 Inhibitory effect of different black tea polysaccharide on lipase

圖4 黑茶茶褐素對脂肪酶的可逆抑制類型Figure 4 The reversible inhibition type of the different black tea theabrownin on lipase

圖5 黑茶茶多糖對脂肪酶的可逆抑制類型Figure 5 The reversible inhibition type of the different black tea polysaccharide on lipase

(2) 4種黑茶茶褐素作用于脂肪酶的抑制類型為競爭性與非競爭性混合型，其中六堡茶接近于競爭性抑制類型。普洱茶、六堡茶與康磚茶多糖的抑制類型為競爭性與非競爭性混合型，其中普洱茶接近于競爭性抑制類型，而茯磚茶為競爭性抑制類型。

[1] 王自社, 張繼, 馬君義, 等. 脂肪酶的研究及應用進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2011, 39(7): 3 798-3 800.

[3] GARZA A L, MILAGRO F I, BOQUE N N, et al. Natural inhibitors of pancreatic lipase as new players in obesity treatment[J]. Planta Medica, 2011, 77(8): 773-785.

[4] 袁華芳. 黑茶化學成分及其抗氧化性的研究[D]. 大連: 遼寧師范大學, 2008: 4.

[5] 王麗麗. 黑茶調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用研究[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學, 2012: 16-17.

[6] 宋魯彬. 中國黑茶藥理功能評價及活性物質(zhì)研究[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學, 2008: 9-10.

[7] 王偉偉, 江和源, 張建勇, 等. 茶褐素的提取純化與生理功效研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢學報, 2015, 6(4): 1 187-1 192.

[8] 陳婷, 彭春秀, 龔加順, 等. 普洱茶茶褐素對高脂血癥大鼠血脂代謝的影響[J]. 中國食品學報, 2011, 11(1): 20-27.

[9] 郭韋韋. 普洱茶減肥功效評價與研究[D]. 昆明: 昆明醫(yī)學院, 2011: 36.

[10] 陳剛. 茶多糖對代謝綜合征大鼠糖脂代謝的干預作用及機理研究[D]. 上海: 復旦大學, 2011: 56.

[11] 紀建業(yè). 脂肪酶活力測定方法的改進[J]. 通化師范學院學報, 2005, 26(6): 51-53.

[12] 鄭成棟. 中藥中脂肪酶抑制劑的篩選[D]. 咸陽: 西北農(nóng)林科技大學, 2010: 29.

[13] 徐甜. 四川邊茶茶褐素優(yōu)化提取及降血脂活性研究[D]. 成都: 四川農(nóng)業(yè)大學, 2010: 13.

[14] 張正竹. 茶葉生物化學實驗教程[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2009: 52.

[15] 鞏發(fā)永, 齊桂年, 李靜. 四川邊茶中茶多糖提取條件的優(yōu)化研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學茶葉科學, 2005, 25(3): 229-236.

[16] 王黎明. 蒽酮硫酸法測定茶多糖含量的研究[J]. 食品科學, 2005, 26(7): 185-188.

[17] 楊龍佳. 貴州產(chǎn)紅茶對胰脂肪酶抑制作用的研究[D]. 貴陽: 貴州師范大學, 2015: 13.

[18] 江慧芳, 王雅琴, 劉春國. 三種脂肪酶活力測定方法的比較及改進[J]. 化學與生物工程, 2007, 24(8): 72-75.

[19] 劉天囡, 徐夢佳, 胡冰, 等. 茯磚茶多酚類物質(zhì)對胰脂肪酶活性的抑制作用[J]. 食品科學, 2015(21): 46-49.

[20] 王燕飛, 張暉, 郭貫新. 米胚芽中胰脂肪酶抑制劑的抑制機理研究[J]. 食品科技, 2004(6): 94-96.

[21] 劉睿, 潘思軼, 劉亮, 等. 高粱原花青素對α-淀粉酶活力抑制動力學的研究[J]. 食品科學, 2005, 26(9): 189-192.

[22] LI Shu-bai, NIE Hua-li, ZHANG Hai-tao, et al. Inhibitory activity kinetics of a trifluoromethyl-containing 1,2,3-triazole derivativeon mushroom tyrosinase[J]. Acta Physico-Chimica Sinica, 2010, 26(1): 215-220.