宋奇穎，郭鵬美，董麗娜，董苗苗，劉 宇(山西醫(yī)科大學藥理學教研室，太原 030001)

氯硝柳胺乙醇胺鹽(niclosamide ethanolamine，NEN)是氯硝柳胺的鹽形式，具有抗血吸蟲作用，是目前國內(nèi)控制血吸蟲媒介螺螄的首選藥物[1]。NEN具有線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)作用，可通過抑制細胞分裂周期37蛋白，阻斷多種信號通路，減緩肝癌細胞的生長[2]。NEN增高糖尿病大鼠AMP激活的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平而減輕肝臟脂肪變性，降低胰島素抵抗，減緩糖尿病進程[3]。最近研究表明，NEN對大鼠腸系膜動脈和主動脈具有舒張作用[4]。了解NEN對冠狀動脈的作用及其機制對其進一步應用具有重要意義。本研究采用離體微血管張力測定法探討NEN對大鼠冠狀動脈(rat coronary artery，RCA)肌張力的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠32只，8周齡，體重為220～250 g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK (晉) 2015-001]。受試動物飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學SPF級動物房[SYXK (晉) 2015-001]，溫度為22℃～25℃，濕度為50%～70%，光照12 h，期間自由飲食飲水。動物實驗操作均按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷，符合本校動物實驗倫理學標準，符合國家《實驗動物管理條例》。

1.2 主要試劑與儀器

血栓素A2受體激動藥(U46619)、4-氨基吡啶(4-AP)、氯化鋇(BaCl2)、四乙胺(TEA)、格列本脲(Gli)、PD98059、SB239063、HEPES、EGTA均購自美國Sigma公司，NEN購自上海江萊生物科技有限公司，其余為市售分析純。正常生理鹽溶液(PSS溶液)成分為：NaCl(118 mmol/L)，KCl(4.7 mmol/L)，CaCl2(2.5 mmol/L)，KH2PO4(1.2 mmol/L)，NaHCO3(25 mmol/L)，MgSO4(1.2 mmol/L)，HEPES(5 mmol/L)，葡萄糖(11 mmol/L)。NEN、PD98059、SB239063用DMSO溶解，加藥時保證浴槽中DMSO終濃度不超過1%。文中所述濃度均為各試劑在浴槽PSS溶液中的終濃度。

Multi Myograph System-610M微血管張力記錄系統(tǒng)購自丹麥DMT公司，PowerLab生物信號采集分析系統(tǒng)購自澳大利亞埃德儀器國際貿(mào)易有限公司，Nikon解剖顯微鏡購自日本Olympus公司，Sartorius BS124S精密天平購自北京賽多利斯科學儀器有限公司，Heal Force新一代超純水儀購自新儀器(上海)有限公司，PHS-3C精密pH計購自上海精科實業(yè)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 離體RCA血管環(huán)標本的制備

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉處死后，立刻取出心臟，置于盛有4℃、pH 7.4且用95% O2+ 5% CO2混合氣體飽和的PSS溶液中。將心臟置于顯微鏡下仔細分離大鼠RCA前降支，剪取直徑為200～240 μm、長度約為2 mm的血管環(huán)，用兩根直徑為40 μm的細鋼絲通過管腔將其固定于DMT浴槽內(nèi)張力換能器上，Chart 7.3生物信號采集軟件記錄其張力變化。槽內(nèi)盛有37℃、pH 7.4、95% O2+ 5% CO2混合氣體飽和PSS溶液5 mL。RCA在浴槽內(nèi)平衡穩(wěn)定1 h，期間每隔15 min更換一次預熱(37℃)的新鮮PSS溶液。在正式實驗開始前，用KCl(60 mmol/L)刺激RCA收縮，重復3次，若連續(xù)兩次RCA收縮幅度差別小于10%，且最大收縮幅度大于2 mN，認為該血管環(huán)的活性良好，肌源性功能正常，穩(wěn)定30 min后開始正式實驗。血管環(huán)詳細制備過程及活性檢測參照課題組已發(fā)表文獻[5]。

1.3.2 NEN對離體RCA的舒張作用

RCA穩(wěn)定30 min后，分別加入KCl(60 mmol/L)、U46619(0.3 μmol/L)，當收縮達到坪臺后，向浴槽內(nèi)累積加入NEN，使其終濃度依次為0.5、1、1.5、2、2.5、3 μmol/L，每次加藥需待前一個藥物濃度作用達到坪臺后再加下一個濃度，記錄RCA張力的變化。對照組則依次加入相應體積的溶劑(DMSO)以觀察溶劑對RCA張力的影響。以收縮劑引起RCA收縮的最大幅度為100%，計算不同濃度NEN的舒張百分比、最大舒張率和舒張50%時所需的藥物濃度(RC50值)。

1.3.3 相關(guān)抑制劑對NEN舒張RCA作用的影響

用U46619(0.3 μmol/L)刺激RCA收縮，待其收縮達到坪臺后，在抑制劑不存在(對照)和抑制劑預孵并存在情況下分別記錄NEN的舒張作用。在加入NEN之前10 min分別加入Kv阻斷劑4-AP(1 mmol/L)、Kir阻斷劑BaCl2(1 mmol/L)、KCa阻斷劑TEA(1 mmol/L)、KATP阻斷劑Gli(0.01 mmol/L)、MAPK抑制劑PD98059(3 μmol/L)或SB239063(3 μmol/L)，待RCA收縮再次達到坪臺后加入NEN(2 μmol/L)，觀察抑制劑對NEN舒張RCA作用的影響。以最大收縮幅度為100%，計算NEN的舒張百分比。

注：A、B：分別為NEN舒張KCl或U46619引起大鼠RCA收縮的原始記錄圖；C、D：NEN濃度-舒張曲線。與溶劑對照組相比，* P < 0.05。圖1 NEN對KCl、U46619預收縮的RCA的舒張作用Note.A and B: Typical original tracing after application of KCl or U46619 followed by cumulative application of niclosamide ethanolamine, respectively. C and D: Relaxation was expressed as percentages of maximal contraction induced by KCl (60 mmol/L) or U46619 (0.3 μmol/L), respectively. Compared with the vehicle control group,*P< 0.05.Fig.1 Niclosamide ethanolamine-induced relaxation in rat coronary artery precontracted with KCl or U46619

1.3.4 NEN對收縮劑所致的細胞內(nèi)或外鈣依賴性收縮的影響

用含EGTA(1 mmol/L)的無鈣PSS溶液洗脫RCA，15 min后將浴槽內(nèi)的液體更換為不含EGTA的無鈣PSS溶液[5]。繼續(xù)平衡15 min后將液體更換為等體積的無鈣60 mmol/L高鉀PSS溶液或直接加入U46619(0.3 μmol/L)，待收縮達到坪臺后復鈣，即加入CaCl2使浴槽中Ca2+為2.5 mmol/L，血管繼續(xù)收縮達到坪臺后用正常PSS溶液洗脫。待RCA恢復靜息張力后分別用NEN(1、1.5、2 μmol/L)預孵15 min，然后在NEN存在的情況下重復以上去鈣和復鈣操作。觀察不同濃度NEN對外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放引起的RCA收縮的影響。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 NEN濃度依賴性舒張離體大鼠RCA

KCl(60 mmol/L)、U46619(0.3 μmol/L)收縮離體大鼠RCA，最大收縮幅度分別為(4.04±0.26) mN、(3.75±0.69) mN；NEN(0.5～3 μmol/L)濃度依賴性地舒張KCl和U46619收縮的離體RCA，其最大舒張百分率分別為(93.97±0.85)%、(91.06±1.23)%，RC50分別為(1.85±0.28) μmol/L、(1.94±0.41) μmol/L。見圖1。

2.2 鉀通道阻斷劑和MAPK抑制劑對NEN舒張大鼠RCA作用的影響

NEN(2 μmol/L)對U46619(0.3 μmol/L)預收縮RCA的最大舒張百分率為(62.85±4.07)%。在鉀通道阻斷劑4-AP(1 mmol/L)、BaCl2(1 mmol/L)、TEA(1 mmol/L)、Gli(0.01 mmol/L)存在情況下，NEN的最大舒張百分率分別為(57.88±5.98)%、(54.69±4.62)%、(55.56±3.97)%和(57.51±3.61)%，與對照組相比均無顯著影響(P> 0.05，見圖2)。MAPK抑制劑PD98059(3 μmol/L)、SB239063(3 μmol/L)存在時，NEN(2 μmol/L)對KCl(60 mmol/L)預收縮RCA的舒張幅度分別減小(27.93±0.71)%和(30.47±0.82)%(P< 0.05)；對U46619(0.3 μmol/L)預收縮RCA的舒張幅度分別減小(25.92±0.58)%、(27.09±0.65)%，差異有顯著性(P< 0.05，見圖3)。

圖2 鉀通道阻斷劑對NEN舒張U46619預收縮RCA作用的影響Fig.2 Effect of K+ channel inhibitors on niclosamide ethanolamine-induced relaxation in isolated rat coronary artery rings precontracted with 0.3 μmol/L U46619

注：與NEN相比，* P< 0.05。圖3 MAPK抑制劑對NEN舒張RCA作用的影響Note.Compared with NEN,*P< 0.05.Fig.3 Effect of mitogen-activated protein kinase inhibitors on niclosamide ethanolamine-induced relaxation in isolated rat coronary artery rings precontracted with 60 mmol/L KCl or 0.3 μmol/L U46619

2.3 NEN對細胞內(nèi)鈣釋放和細胞外鈣內(nèi)流所致收縮的影響

KCl(60 mmol/L)在無鈣PSS溶液中引起RCA收縮幅度為(0.11±0.13) mN，復鈣后收縮幅度為(3.92±1.13) mN。預孵NEN(1、1.5、2 μmol/L)能明顯抑制KCl(60 mmol/L)外鈣內(nèi)流引起的RCA收縮(見圖4)，收縮幅度分別為(3.73±1.02) mN、(2.35±0.61) mN、(1.60±0.25) mN。U46619(0.3 μmol/L)在無鈣PSS溶液中引起RCA收縮幅度為(0.55±0.14) mN，復鈣后進一步收縮RCA，其收縮幅度為(3.44±1.13) mN。預孵NEN(1、1.5、2 μmol/L)能明顯抑制U46619(0.3 μmol/L)復鈣后外鈣內(nèi)流引起的RCA收縮，收縮幅度分別為(3.28±0.95) mN、(2.34±0.16) mN、(1.71±0.23) mN，差異有顯著性(P< 0.05，見圖5)；而NEN對內(nèi)鈣釋放引起的收縮均無明顯影響(P> 0.05，見圖4、圖5)。

注：與NEN 0 μmol/L相比，* P< 0.05。圖4 NEN對KCl引起的細胞內(nèi)鈣依賴性和細胞外鈣依賴性RCA收縮的影響Note.Compared with vehicle control (NEN 0 μmol/L),*P< 0.05.Fig.4 Effect of niclosamide ethanolamine on rat coronary artery contraction induced by KCl in a Ca2+-free bath followed by restoration of 2.5 mmol/L Ca2+

注：與NEN 0 μmol/L相比，* P< 0.05。圖5 NEN對U46619引起的細胞內(nèi)鈣依賴性和細胞外鈣依賴性RCA收縮的影響Note.Compared with vehicle control (NEN 0 μmol/L),*P< 0.05.Fig.5 Effect of niclosamide ethanolamine on rat coronary artery contraction induced by U46619 in Ca2+-free PSS followed by restoration of 2.5 mmol/L Ca2+

3 討論

氯硝柳胺是世界衛(wèi)生組織唯一推薦使用的殺滅血吸蟲中間宿主的殺螺劑，其機制為對寄生蟲的線粒體氧化磷酸化具有解偶聯(lián)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺具有抗結(jié)核、抗病毒、抗腫瘤以及改善糖尿病抵抗等作用[6 - 8]。氯硝柳胺水溶性低的特點限制了其應用。NEN是氯硝柳胺合鹽，具有更高的水溶性，同時具有對哺乳動物毒性低和對環(huán)境污染小等優(yōu)點。最近研究表明，NEN對大鼠腸系膜動脈和主動脈具有顯著的舒張作用，其機制可能與激活AMPK有關(guān)[4]。冠狀動脈形成起源、生物學特點及藥理學特點均不同于其他血管[9 - 10]，了解藥物對冠狀動脈的影響對臨床合理用藥具有重要意義。本研究表明，NEN對處于收縮狀態(tài)的RCA具有強大的舒張作用，最大舒張率可達90%以上，RC50< 2.0 μmol/L。其藥理學特點為舒張RCA濃度范圍相對較窄(0.5～3 μmol/L)，對去極化(60 mmol/L KCl)和血栓素A2受體激動藥所致收縮的舒張作用無明顯的選擇性。

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)上主要表達有Kv、Kir、KCa和KATP四種鉀通道，它們在VSMC細胞膜電位和血管阻力的調(diào)節(jié)中具有重要作用[11 - 13]。該四種鉀通道選擇性抑制劑分別為4-氨基吡啶、氯化鋇、四乙胺和格列本脲，本研究結(jié)果表明，它們對NEN舒張U46619預收縮的RCA均無顯著影響，提示NEN對離體大鼠RCA的舒張作用與鉀通道無關(guān)。MAPK在VSMC收縮中起重要作用[14]。本實驗結(jié)果顯示MAPK抑制劑PD98059和SB239063減弱NEN的舒張作用，提示NEN舒張RCA可能與其激活MAPK有關(guān)。本研究結(jié)果還表明，NEN選擇性抑制細胞外鈣依賴性收縮成分，其抑制程度與其舒張RCA強度相一致，而對血管收縮劑所致的細胞內(nèi)鈣釋放依賴性的收縮成分無顯著影響，這可能與其脫偶聯(lián)作用促進線粒體Ca2+釋放有關(guān)[4]。

綜上所述，本研究證明NEN對RCA具有突出的舒張作用，并提示該作用可能與其激活MAPK信號通路、抑制細胞外鈣內(nèi)流有關(guān)。本研究擴展了對NEN血管作用的認識，為臨床合理評估NEN對冠狀動脈的作用提供基礎(chǔ)研究參考。

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