滕永康，叢日旭，劉云波(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，因具有與人類(lèi)高度遺傳同源性，在生物學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用[1]。普通綿耳狨猴是一種小型的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，具有體型小，飼養(yǎng)成本低，繁殖效率高，方便實(shí)驗(yàn)操作且不易攜帶猴B病毒等優(yōu)勢(shì)，目前，狨猴在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究較為廣泛，尤其是在神經(jīng)科學(xué)，藥物動(dòng)力學(xué)及藥物的毒性篩查[2]、自身免疫性疾病、感染性疾病動(dòng)物模型，如登革熱[3]、丙型肝炎[4]方面都具有較大的潛能。然而，狨猴至今仍被定義為“實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物”，即狨猴作為諸多學(xué)科研究用的非人靈長(zhǎng)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，相關(guān)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)正在擬定，很多生物學(xué)特性也亟待發(fā)掘。建立普通綿耳狨猴相關(guān)基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)于其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化培育及開(kāi)展相關(guān)研究都至關(guān)重要，對(duì)于狨猴的血液學(xué)和血清生化檢測(cè)的研究，國(guó)外開(kāi)展較早，Mcnees等[5]、Mcintosh等[6]相繼于1984年、1985年開(kāi)展相關(guān)研究，而后，針對(duì)狨猴的血液學(xué)和血清生化檢測(cè)逐漸步入驗(yàn)證和應(yīng)用階段，如Omatsu等[7]通過(guò)血液學(xué)和血清生化指標(biāo)數(shù)據(jù)變化直觀展現(xiàn)接種登革熱前后動(dòng)物的生理表征。在國(guó)內(nèi)，繼1986年第一篇狨猴血液學(xué)檢查報(bào)道后，國(guó)內(nèi)尚未有針對(duì)普通綿耳狨猴的血液學(xué)和血清生化指標(biāo)的更新報(bào)道，同時(shí)，血液學(xué)和血清生化學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)與取血方式[8]、樣本處理方式[9]以及動(dòng)物因素如單籠或群居飼養(yǎng)[10]等多種因素相關(guān)，因此，隨著狨猴標(biāo)準(zhǔn)工作的逐步完善，有必要對(duì)本地狨猴群體血液學(xué)和血清生化各指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析。為此，本文就本單位引進(jìn)的實(shí)驗(yàn)用狨猴群體，進(jìn)行血液學(xué)和血清生化指標(biāo)的檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析，描述了本單位飼養(yǎng)的狨猴群體的血液及血清生化指標(biāo)的測(cè)定數(shù)據(jù)，同時(shí)，對(duì)比Oliveira e Silva等研究者[11]報(bào)道的巴西雨林的野生狨猴群體以及邢鳳英等研究者[12]報(bào)道的獼猴非麻醉狀態(tài)下的各指標(biāo)數(shù)據(jù)，加以分析比較，為狨猴血液及血清生化分析積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

就中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物北方資源中心2016年8月引進(jìn)的實(shí)驗(yàn)用普通綿耳狨猴群體，共取成年狨猴30只，其中雄猴21只，雌猴9只，年齡2～4歲，體重330～420 g[SCXK (京) 2014-0011]。飼養(yǎng)環(huán)境微生物質(zhì)量等級(jí)：普通環(huán)境；飼養(yǎng)條件：?jiǎn)位\飼養(yǎng)或成對(duì)飼養(yǎng)，籠具尺寸60 cm × 80 cm × 110 cm，籠內(nèi)擺放干木條和木盒作為豐容措施，動(dòng)物室溫度維持在24℃～29℃，濕度控制為> 40%，12 h光照/黑暗循環(huán)控制[SYXK (京) 2017-0027]。每日飼喂配合飼料，輔以清潔水果，自由飲水。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

抗凝劑為乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)。血液學(xué)測(cè)定采用全自動(dòng)血液分析儀(ABX Pentra DX120，法國(guó))，血清生化分析測(cè)定采用全自動(dòng)生化分析儀(日立7100，日本)，血樣離心使用Thermo Fresco 21型離心機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血樣采集

采樣時(shí)間為6月份，在動(dòng)物清醒空腹?fàn)顟B(tài)下，人工保定，保持動(dòng)物俯臥姿勢(shì)，伸展后肢，使用1 mL一次性無(wú)菌注射器分兩次通過(guò)后肢靜脈穿刺，針頭規(guī)格為26G，共采集1.1 mL全血，其中乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血0.4 mL，用于血常規(guī)檢測(cè)，非抗凝血0.7 mL，3000 r/min離心15 min，分離得血清，用于血清生化指標(biāo)檢測(cè)，血液學(xué)及血清生化指標(biāo)檢測(cè)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所GLP中心檢驗(yàn)室完成，測(cè)定方法參考馮仁豐[13]方法。

1.3.2 血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定

在采血后1.5 h內(nèi)，應(yīng)用全自動(dòng)血液分析儀，設(shè)定猴類(lèi)種屬，圈定細(xì)胞亞群，檢測(cè)以下血液學(xué)指標(biāo)：白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞平均容量(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白容量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、平均血小板容量(MPV)、血小板比容(PCT)、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、淋巴細(xì)胞百分比(LYMPH%)、單核粒細(xì)胞百分比(MONO%)、嗜堿性粒細(xì)胞百分比(BASO%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS%)。

1.3.3 血清生化指標(biāo)測(cè)定

在采血后2 h內(nèi)，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀上樣檢測(cè)以下血清生化指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、總膽紅素(TBIL)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、鈣(Ca)、磷(P)、膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血液學(xué)測(cè)定結(jié)果

對(duì)比巴西雨林野外條件的狨猴群體，可以看出本單位飼養(yǎng)的狨猴群體中的HGB、MCHC、NEUT指標(biāo)數(shù)據(jù)均有明顯差別，而與相應(yīng)性別組的獼猴指標(biāo)數(shù)據(jù)相近。對(duì)比獼猴血液學(xué)指標(biāo)可以看出，狨猴的血液學(xué)大部分指標(biāo)數(shù)據(jù)大部分落在獼猴血液學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)的95%置信區(qū)間內(nèi)，其中，雌性狨猴的WBC、RBC、HCT、MCH均值未處在雌性獼猴區(qū)間內(nèi)，而雄性狨猴僅有HCT指標(biāo)數(shù)據(jù)與雄性獼猴差距較大。

2.2 血清生化測(cè)定結(jié)果

對(duì)比巴西大西洋沿岸森林的狨猴群體，可以看出本單位飼養(yǎng)的狨猴群體的ALT、AST、GLOB指標(biāo)數(shù)據(jù)明顯升高，雌雄組規(guī)律相同。與雌性獼猴指標(biāo)數(shù)據(jù)區(qū)間相比，雌性狨猴的ACT、GGT、CREA指標(biāo)數(shù)據(jù)未處在獼猴參考值范圍內(nèi)，雄性狨猴除了雌猴對(duì)比的三個(gè)指標(biāo)差別較大外，還有ALP指標(biāo)數(shù)值偏低。

表1 普通綿耳狨猴血常規(guī)指標(biāo)的比較Tab.1 Comparison of hematological parameters in common marmosets

表2 普通綿耳狨猴血清生化學(xué)指標(biāo)的比較Tab.2 Comparison of serum biochemical parameters in common marmosets

注：與雌猴組血清生化指標(biāo)相比，*P< 0.05。

Note.Compared with serum biochemical parameters of the female group,*P< 0.05.

3 討論

與嚙齒類(lèi)動(dòng)物相比，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物因具有部分獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)并且將繼續(xù)被用于更多的藥理學(xué)和毒理學(xué)，傳染病學(xué)等研究。本研究選取30只營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)良好的普通綿耳狨猴，在動(dòng)物空腹清醒狀態(tài)下，后肢靜脈采血，并在2 h內(nèi)完成檢測(cè)工作，檢測(cè)試劑耗材可以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

從雌猴雄猴組間差異比較，血清生化測(cè)定結(jié)果中，LDL-C、HDL-C指標(biāo)差異有顯著性，可能與雌、雄猴的飲食量和營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)有關(guān)。對(duì)比的數(shù)據(jù)中，第一組數(shù)據(jù)來(lái)源為巴西大西洋沿岸的野生狀態(tài)下的狨猴，與本研究動(dòng)物種屬一致，動(dòng)物捕捉后使用10 mg/kg鹽酸氯胺酮麻醉，后肢靜脈采血進(jìn)行檢測(cè)[11]；第二組數(shù)據(jù)來(lái)源為經(jīng)人工繁育三代的獼猴群體[12]，考慮到氯胺酮誘導(dǎo)[14]對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此選擇此數(shù)據(jù)作為獼猴屬參考數(shù)據(jù)。血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，可以看出本單位飼養(yǎng)的狨猴群體中的HGB、MCHC、NEUT指標(biāo)數(shù)據(jù)均有明顯差別，其中，HGB、MCHC指標(biāo)數(shù)據(jù)相差近10倍，這兩個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)與獼猴相近，血紅蛋白位于紅細(xì)胞內(nèi)，是紅細(xì)胞的主要組成成分，巴西雨林的狨猴中血紅蛋白可能與巴西大西洋沿岸雨林食物供應(yīng)不穩(wěn)定的生存環(huán)境有關(guān)。血清生化檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，較巴西大西洋沿岸森林的狨猴，可以看出本單位飼養(yǎng)的狨猴群體的ALT、AST、GLOB指標(biāo)數(shù)據(jù)明顯升高，雌雄組規(guī)律相同。ALT為谷丙轉(zhuǎn)氨酶，主要存在于肝臟、心臟組織細(xì)胞中，當(dāng)組織發(fā)生病變時(shí)，該酶活力增多；AST為谷草轉(zhuǎn)氨酶，主要分布在心肌，其次是肝臟、骨骼肌和腎臟等組織中，AST在血清含量較高提示肝臟可能損傷，鑒于動(dòng)物群體檢疫合格，個(gè)體狀態(tài)良好，與獼猴對(duì)應(yīng)指標(biāo)數(shù)據(jù)比較，ALT、AST指標(biāo)值相差不大，猜測(cè)可能與野外生存環(huán)境下的特殊體質(zhì)有關(guān)，同時(shí)與肝功相關(guān)的指標(biāo)GGT，本單位飼養(yǎng)的狨猴比獼猴測(cè)定值較低，提示肝功未有異常，此處原因尚不明確，是否動(dòng)物狀態(tài)有關(guān)，還需要做肝臟活檢等檢測(cè)加以佐證。與雌性獼猴指標(biāo)數(shù)據(jù)區(qū)間相比，雌性狨猴的ACT、GGT、CREA指標(biāo)數(shù)據(jù)沒(méi)有處在獼猴正常值范圍內(nèi)，雄性狨猴除了雌猴對(duì)比的三個(gè)指標(biāo)差別較大外，還有ALP指標(biāo)數(shù)值偏低，可能是狨猴與獼猴種屬差異。

與同屬新大陸猴的卷尾猴[15]和松鼠猴[16]相比，狨猴與卷尾猴的血液學(xué)指標(biāo)均值差異不大，與松鼠猴一致性極高。血清生化檢測(cè)結(jié)果中，狨猴與卷尾猴存在差異的指標(biāo)有ALT、AST、GGT、ALP、ALB、TP、LDH，其中相差較大的是TP和GGT，狨猴TP均值高于卷尾猴近10倍，而GGT均值又約是卷尾猴的1/10，造成差異的原因除了種間差異外，還可能跟卷尾猴野外生存的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)以及囚禁狀態(tài)下的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。國(guó)內(nèi)對(duì)狨猴血液學(xué)的探究始于1986年陳天培等[17]對(duì)四只綿耳狨猴的血液學(xué)檢查的報(bào)道，本研究對(duì)普通綿耳狨猴的各項(xiàng)血液學(xué)和血清生化的大部分指標(biāo)的范圍與先前報(bào)道基本一致，其中LDH、PLT均值略低，可能與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀況和飼養(yǎng)環(huán)境差異有關(guān)。對(duì)比潘振業(yè)等[18]報(bào)道的白須狨猴的相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)，普通綿耳狨猴L(fēng)DH、ALB、CREA均值較高，而WBC、ALT、AST、BUN指標(biāo)均值則較低，結(jié)果與種間差異有關(guān)，也可能是與氯胺酮誘導(dǎo)麻醉有關(guān)。

本研究對(duì)本單位飼養(yǎng)的30只普通綿耳狨猴進(jìn)行血液學(xué)和血清生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，建立普通綿耳狨猴血液學(xué)和血清生化學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)的背景資料，為藥理、毒理研究以及狨猴疾病診療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 田朝陽(yáng), 楊守凱. 非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物在醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 19(6): 74-77.

[2] Smith D, Trennery P, Farningham D, et al. The selection of marmoset monkeys (Callithrixjacchus) in pharmaceutical toxicology [J]. Lab Anim, 2001, 35(2): 117-130.

[3] Omatsu T, Moi ML, Hirayama T, et al. Common marmoset (Callithrixjacchus) as a primate model of dengue virus infection: development of high levels of viraemia and demonstration of protective immunity [J]. J Gen Virol, 2011, 92(Pt 10): 2272-2280.

[4] 帥麗芳, 李婷婷, 陳姿喧, 等. GBV-B與HCV嵌合病毒狨猴感染模型的建立 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 20(10): 73.

[5] Mcnees DW, Lewis RW, Ponzio BJ, et al. Blood chemistry of the common marmoset (Callithrixjacchus) maintained in an indoor-outdoor environment: primate comparisons [J]. Primates, 1984, 25(1): 103-109.

[6] Mcintosh GH, Lawson CA, Rodgers SE, et al. Haematological characteristics of the common marmoset (Callithrixjacchusjacchus) [J]. Res Vet Sci, 1985, 38(1): 109-114.

[7] Omatsu T, Moi ML, Takasaki T, et al. Changes in hematological and serum biochemical parameters in common marmosets (Callithrixjacchus) after inoculation with dengue virus [J]. J Med Primatol, 2012, 41(5): 289-296.

[8] 田蜜, 蔣雪云, 曹麗歌, 等. 不同取血方式及性別對(duì)成年Wistar大鼠11種血液生物化學(xué)指標(biāo)的影響 [J]. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 38(4): 572-575.

[9] 朱科燕, 蔡月琴, 徐孝平, 等. 血液樣本處理方式對(duì)Wistar大鼠血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的影響 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 26(11): 80-84.

[10] 宋征, 李華, 阮斌, 等. 群體飼養(yǎng)對(duì)比格犬血液學(xué)及生化指標(biāo)的影響 [J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2017, 38(8): 71-75.

[11] Oliveira e Silva I, Fátima Rodrigues da Silva F, Fuzessy L, et al. Hematology and blood biochemistry in wild hybrid marmosets from the Atlantic Forest, Brazil [J]. Ciência Rural, 2014, 44(9): 1596-1602.

[12] 邢鳳英, 嚴(yán)國(guó)鋒, 楊偉敏, 等. 3～4歲獼猴生理指標(biāo)的測(cè)定 [J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué), 2013, 33(4): 310-314.

[13] 馮仁豐.實(shí)用醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1996：267-488.

[14] 程樹(shù)軍, 黃韌. 氯胺酮麻醉對(duì)恒河猴血液學(xué)指標(biāo)的影響 [J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2003, 39(3): 23-25.

[15] Monteiro FOB, Monteiro MVB, Scofield AA, et al. Hematological and biochemistry evaluation in capuchin monkeys from the illegal captivity [J]. Acta Veterinaria Brasilica, 2016, 10(1): 92-97.

[16] 周世賢, 陶勇, 杜文鵬, 等. 松鼠猴血液生理指標(biāo)的測(cè)定 [J]. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào), 2008, 29(2): 72-73.

[17] 陳天培, 潘振業(yè), 李建平, 等. 狨猴研究Ⅲ—血液學(xué)檢查 [J]. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué), 1986, 6(2): 88-90.

[18] 潘振業(yè), 鄒勇, 馬東林, 等. 白須狨猴血液學(xué)初步測(cè)定 [J]. 動(dòng)物學(xué)雜志, 1988, 23(1): 51-54.