郭愛玲，寧慧娟，秦子芳，譚曉妍，苗雨欣，張秀清*

（1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 529156；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

靈芝（Ganoderma lucidum），在中國古代被稱為“仙草”或“瑞草”，隸屬于真菌門（Eumycota）擔(dān)子菌亞門 （Basidiomycotina）層菌綱 （Hymenomycetes）非褶菌目 （Aphyllophorales）靈芝菌科（Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma），具有獨特的藥用和保健價值[1]。

靈芝多糖是靈芝的重要化學(xué)成分和主要的生理活性成分，目前國內(nèi)外關(guān)于靈芝的大量研究表明，靈芝多糖具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種作用[2－5]，其多糖含量的高低可以作為靈芝質(zhì)量評價指標(biāo)之一[6]。靈芝多糖的生物活性與多糖的種類、單糖的組成和多糖分子量范圍等有關(guān)[7]。倪力軍等[8]研究了8種中藥材的多糖組成與活性，發(fā)現(xiàn)8種中藥材多糖的單糖組成和含量具有較大差異，單糖組成與體外抗氧化活性之間存在較強的整體相關(guān)性。徐雪峰等[9]從赤靈芝多糖分離純化得到的GLPa-2（365 kDa）、GLPb-1 （39 kDa）、GLPc（14 kDa）3個組分，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖組成，分子量最大的GLPa-2抗氧化活性最佳，表明赤靈芝多糖的抗氧化活性與其組成相關(guān)。

由于野生靈芝有限，20世紀(jì)60年代，我國開始著手靈芝人工栽培。早期的栽培方式以段木栽培為主，之后以木屑為基質(zhì)進(jìn)行瓶栽和袋栽，目前大多利用短段木進(jìn)行栽培[10]。通過比較大段木、小段木和袋料靈芝栽培方式靈芝多糖的含量、單糖組成和分子量的差異，旨在為進(jìn)一步探究不同靈芝栽培方式下靈芝多糖的生理學(xué)活性和藥理價值奠定理論基礎(chǔ)，為靈芝的合理栽培和適時采收提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：赤靈芝子實體由天方健（中國）藥業(yè)有限公司提供，大段木靈芝采收于安徽省大別山種植基地；小段木靈芝采收于安徽省金寨種植基地；袋料靈芝采收于山東冠縣種植基地，靈芝放入烘箱經(jīng)60℃烘干（水分含量＜17%），樣品粉碎后過24目篩，備用。

試劑：葡聚糖（Dextran系列）標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；蒽酮，北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司；D-葡萄糖、L-阿拉伯糖等8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），美國Sigma公司；三氟乙酸（TFA），北京化學(xué)試劑公司；其他試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀，安捷倫公司；LC-20A液相色譜儀，島津公司；HHSY21-NY電熱恒溫水浴鍋，北京長風(fēng)儀器儀表公司；BS200S電子天平，北京賽多利斯天平公司；DHG-9240A鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TG16-WS高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；TM-1901型雙光束紫外可見光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海振捷實驗設(shè)備有限公司；TYS-100高速多功能粉碎機，永康市紅太陽機電有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 靈芝多糖的制備和測定

采用蒽酮-硫酸法[11]。稱取2.000 g過24目篩的靈芝粉末，置于100 mL圓底燒瓶中，加去離子水60 mL靜置1 h，沸水加熱回流4 h，趁熱過濾，用少量去離子水洗滌濾器和濾渣，將濾渣和濾紙置燒瓶中，加去離子水60 mL，加熱回流3 h，趁熱濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣用5 mL去離子水溶解，邊攪拌邊緩慢滴加95%乙醇75 mL，搖勻，在4℃放置12 h，8 000 r·min-1離心10 min，取沉淀烘干即為靈芝多糖樣品。靈芝多糖樣品用去離子水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容至刻度。取適量溶液，離心，精密量取上清液3 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取無水葡萄糖對照品0.120 g，用去離子水定容至1 L。精密稱取蒽酮0.250 g，加硫酸250 mL使其溶解，搖勻。精密量取無水葡萄糖溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于20 mL具塞試管中，各加去離子水使其體積為2.0 mL，再加入硫酸蒽酮溶液6 mL，搖勻，室溫放置15 min后，置冰水浴中冷卻15 min后取出，在625 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水為空白試驗對照。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

靈芝樣品多糖含量的測定：精密量取靈芝多糖溶液1 mL，置于20 mL具塞試管中，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL，在625 nm波長處測定吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算靈芝多糖樣品中多糖的含量。按干燥品計算，靈芝多糖含量以無水葡萄糖（C6H12O6）計。

1.3.2 靈芝多糖分子量測定

采用凝膠滲透色譜法（Gel Permeation Chromatography，GPC）測定多糖分子量。色譜條件如下：色譜儀：Agilent 1200；檢測器：示差折光檢測器；色譜柱：Agilent PL aquageL-OH MIXED-M、300 nm×8 μm；流動相：0.1 mol·L-1的硝酸鈉溶液；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與樣品測定：將分子量分別為180 Da、9 kDa、30 kDa、300 kDa、2 000 kDa 的Dextran標(biāo)準(zhǔn)品用0.1 mol·L-1的硝酸鈉水溶液溶解，靈芝多糖用蒸餾水溶解（濃度為0.5 mg·mL-1），過0.22 μm的濾膜[12]，依次進(jìn)樣。以保留時間為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的相對分子質(zhì)量對數(shù)（lgMw）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算靈芝多糖樣品分子量。

1.3.3 靈芝多糖的單糖組成測定

靈芝多糖的水解：分別稱取干燥后靈芝多糖樣品各 10 mg，加入 2 mL濃度 2 mol·L-1三氟乙酸（TFA）于10 mL消解管中，擰緊管口，置于105℃的烘箱中反應(yīng)6 h，擰開管口，烘干，向消解管中加入500 μL無水甲醇，再次烘干，重復(fù)3次，使殘留的TFA揮發(fā)，加入3 mL去離子水復(fù)溶。

單糖衍生化：取1 mL的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mol·L-1）或多糖水解液，置于10 mL離心管中，依次加入 0.3 mol·L-1的 NaOH 溶液 600 μL，0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液600 μL，使用渦漩振蕩器混勻，70℃水浴條件下反應(yīng)2 h（期間每隔15 min振蕩混勻1次），反應(yīng)結(jié)束后取出，冷卻至室溫。加入0.3 mol·L-1的HCl溶液600 μL，混勻中和反應(yīng)體系，再加入1 mL的三氯甲烷溶液充分振蕩，靜置，棄下層有機相，重復(fù)萃取5次，取上層水相，過0.22 μm的濾膜，進(jìn)行HPLC檢測[13-14]，色譜條件為：色譜儀：島津LC-20A高效液相色譜儀；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：250 nm；流動相：20 mmol·L-1磷酸緩沖溶液（pH 6.7）-乙腈=82:18；流速：1 mL·min-1；色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS Statistics 22進(jìn)行單因素方差分析，并采用LSD法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同栽培方式靈芝多糖含量

靈芝多糖含量測定結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同栽培方式靈芝多糖含量Fig.1 The polysaccharides content of Ganoderma lucidum by different cultivation methods

不同栽培方式靈芝多糖含量由高到低依次為大段木靈芝>小段木靈芝>袋料靈芝，多糖含量分別為14.67 mg·g-1，11.96 mg·g-1，5.35 mg·g-1，通過 SPSS統(tǒng)計分析可得，3種栽培方式靈芝多糖含量之間存在極顯著的差異（P<0.01）。袁學(xué)軍等[15]研究了不同栽培方式對靈芝活性成分的影響，顯示椰糠栽培的靈芝多糖含量最高，仿野生栽培的其次，表明靈芝多糖的含量與栽培基質(zhì)有直接關(guān)系。閆梅霞[16]測定了吉林地區(qū)不同基質(zhì)（木屑和段木）栽培的松杉靈芝多糖含量，結(jié)果表明段木基質(zhì)大棚下栽培的靈芝多糖含量較高。靈芝多糖是靈芝重要的活性成分，其含量是判斷靈芝質(zhì)量高低的指標(biāo)。本文的研究也表明大段木栽培靈芝多糖含量最高。

2.2 不同栽培方式靈芝多糖分子量

不同栽培方式靈芝多糖的分子量和組分含量存在差異，如表1所示。

表1 不同栽培方式靈芝多糖分子量Tab.1 Molecular weight of Ganoderma lucidum polysaccharides by different cultivation methods

大段木靈芝多糖組分不均一，2個組分的分子量為4 688 kDa和10 kDa，峰面積占比分別為88.5%和11.5%；小段木靈芝多糖組分不均一，主要多糖組分分子量為2 462 kDa，峰面積占比為85.6%，次要多糖組分分子量約為7 kDa；袋料靈芝多糖組分均一，分子量為105 kDa。研究顯示靈芝多糖具有抗腫瘤等藥理活性，Zhang等[17]從靈芝中分離純化出1種靈芝多糖GLIS（分子量為2 000 kDa左右），試驗證明該靈芝多糖能選擇性刺激B細(xì)胞，增強免疫球蛋白的產(chǎn)生，還可以刺激小鼠的巨噬細(xì)胞分泌活性物質(zhì)[18]，具有增強機體免疫力和抗腫瘤的藥理活性。本研究從大段木靈芝中提取的靈芝多糖分子量較大，推測其可能具有相應(yīng)的藥理活性。

2.3 不同栽培方式單糖組成

不同栽培方式靈芝多糖的單糖種類和比例存在差異，如圖2所示。

從圖2和表2看出，大段木靈芝多糖主要由葡萄糖、木糖、巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖和甘露糖8種單糖組成，其摩爾比為19.62∶3.80∶3.00∶1.95∶1.83∶1.07∶1.06∶1.00，其中葡萄糖為主要成分，含量為58.87%；小段木靈芝多糖含有5種單糖，阿拉伯糖含量（28.75%）最高，其次是木糖（23.59%）和鼠李糖（21.80%）；袋料靈芝多糖由7種單糖組成，其中葡萄糖的含量最高，半乳糖和阿拉伯糖的含量也較高。

前期研究表明，木糖有助于提高多糖的抗氧化活性[19]，王海燕等[20]從赤靈芝子實體提取多糖經(jīng)分離純化得到3個多糖級分GLMP1（462 kDa）、GLMP2（65 kDa）和GLMP3（6 kDa），多糖的單糖摩爾比各異，其中分子最大的GLMP1中單糖組成種類更多，試驗表明高生物活性的木糖含量越高，相關(guān)的抗氧化活性也越高。本研究中3種栽培方式中大段木栽培靈芝多糖的單糖組成種類最多，木糖含量較高，推測其可能具有更高的生理活性。

圖2 不同栽培方式靈芝多糖單糖組成HPLC色譜圖Fig.2 Monosaccharide composition of Ganoderma lucidum polysaccharides from different cultivation methods by HPLC chromatogram

表2 不同栽培方式靈芝多糖的單糖組成Tab.2 Monosaccharide composition of Ganoderma lucidum polysaccharides by different cultivation methods

3 結(jié)論

本試驗研究表明不同栽培方式靈芝多糖的含量、分子量和單糖組成存在差異。大段木靈芝多糖含量最高，為14.67 mg·g-1。大段木栽培靈芝含有2個不同分子量段的多糖，分子量最高達(dá)4 688 kDa，小段木靈芝多糖主要成分分子量為2 462 kDa，袋料靈芝多糖分子量為105 kDa。單糖組成方面，大段木靈芝多糖含8種單糖，葡萄糖、木糖和巖藻糖的含量較高，與甘露糖的摩爾比為 19.62∶3.80∶3.00∶1.00，小段木靈芝多糖含5種單糖，袋料靈芝多糖含7種單糖。綜合各方面，本試驗研究顯示大段木栽培靈芝的多糖含量最高，分子量最高，單糖組成更豐富，推測其可能具有更高的生理活性，為不同栽培方式靈芝多糖的選擇和應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究：3版（精）[M].北京：北大醫(yī)出版社，2007.

[2]Wasser S.Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immune modulating polysaccharides[J].Applied Microbiology&Biotechnology,2002,60(3):258-274.

[3]Wang SY,Hsu ML,Hsu HC,et al.The anti-tumor effect of Ganoderma lucidum is mediated by cytokines released from activated macrophages and T lymphocytes[J].International Journal of Cancer,1997,70(6):699.

[4]Seto SW,Lam TY,Tam HL,et al.Novel hypoglycemic effects of Ganoderma lucidum water-extract in obese/diabetic (+db/+db)mice[J].Phytomedicine,2009,16(5):426-436.

[5]Ferreira IC,Heleno SA,Reis FS,et al.Chemical features of Ganoderma polysaccharides with antioxidant,antitumor and antimicrobial activities[J].Phytochemistry,2015(114)：38-55.

[6]張曉云，李朝謙，楊春清.不同生長期赤靈芝子實體多糖含量變化研究[J].食用菌，2008，30（1）：10-11.

[7]黃生權(quán).赤靈芝多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)分析與生物活性研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2010.

[8]倪力軍，王媛媛，何婉瑛，等.8種多糖的單糖組成、活性及其相關(guān)性分析[J].天津大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)與工程技術(shù)版，2014，47（4）：326-330.

[9]徐雪峰，李桂娟，閆浩，等.赤靈芝多糖分離純化及體外抗氧化性研究[J].食品與機械，2017，33（1）：143-147.

[10]蔡衍山，黃秀治.靈芝段木栽培技術(shù) [J].中國食用菌，1991，10 （2）：29-31.

[11]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015.

[12]耿安靜，陳健，徐曉飛.GPC法測定香菇多糖的含量及相對分子質(zhì)量[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（4）：458-460.

[13]萬強，吳學(xué)昊，范華均，等.HPLC衍生化法分析決明子多糖水解產(chǎn)物中單糖組分及其多糖組成特征的研究[J].分析測試學(xué)報，2014，33（11）：1231-1236.

[14]楊興斌，趙燕，周四元，等.柱前衍生化高效液相色譜法分析當(dāng)歸多糖的單糖組成[J].分析化學(xué)，2005，33（9）：1287-1290.

[15]袁學(xué)軍，陳永敢，陳光宙，等.不同栽培方式對靈芝活性成分的影響[J].中國食用菌，2012，31（5）：18-19.

[16]閆梅霞，鄭斯文，張瑞，等.松杉靈芝多糖含量測定[J].特產(chǎn)研究，2017，39（3）：39-42.

[17]Zhang J,Tang Q,Zimmerman-Kordmann M,et al.Activation of B lymphocytes by GLIS,a bioactive proteoglycan from Ganoderma lucidum[J].Life Sciences,2002,71(6):623-638.

[18]唐慶九,張勁松,潘迎捷,等.靈芝活性多糖GLIS對正常和荷瘤小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的激活作用[J].現(xiàn)代免疫學(xué),2005,25(1)：49-52.

[19]王海燕，戴軍，陳尚衛(wèi).靈芝菌絲體多糖的分離純化及其單糖組成分析與分子量測定 [J].食品與機械，2015，31（5）：201-205.

[20]Wang J,Guo H,Zhang J,et al.Sulfated modification,characterization and structure-antioxidantrelationships of Artemisia sphaerocephala,polysaccharides[J].Carbohydrate Polymers,2010,81(4):897-905.