雷 萍，吳亞召，張文雋，杜 芳,**，王賀祥

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安710043；2.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193）

α－半乳糖苷酶（α－Galactosidase，α－Gal）又稱蜜二糖酶、α－半乳糖苷鍵水解酶，可水解非還原性末端以α－1，6鍵結(jié)合的半乳糖苷健，因此可水解含有α－半乳糖苷鍵的雜多糖和棉籽糖、水蘇糖、蜜二糖等低聚糖[1]。α－半乳糖苷酶可以降解不溶性低聚糖，提高豆類制品的代謝能力，消除脹氣，還可改造并改變藥物理化性質(zhì)，增加藥物穩(wěn)定性等，因此被廣泛應(yīng)用于飼料業(yè)、食品業(yè)、制藥業(yè)和科學(xué)研究等領(lǐng)域[2]。

α－半乳糖苷酶普遍存在于人、動物、植物和微生物中，其中由于微生物具有分布廣、種類多、生長快等優(yōu)點成為生產(chǎn)α－半乳糖苷酶的主要目標[3]。上世紀70年代末期我國學(xué)者對微生物產(chǎn)α－半乳糖苷酶及其酶學(xué)特性開始進行研究，目前已篩選出多株產(chǎn)α－半乳糖苷酶活性的微生物菌種，并制備分離出越來越多的純化酶，取得了較大進展。有研究學(xué)者從多種大型真菌子實體和發(fā)酵液中檢測并分離到高活性的α－半乳糖苷酶[4]。云芝（Coriolus versicol－or）是珍貴的藥用真菌，具有提高免疫、抗腫瘤、降血糖等藥用價值。我們在云芝子實體中檢測到高活性α-半乳糖苷酶的存在，但是子實體生成周期較長，提取成本增加，因此利用發(fā)酵法生產(chǎn)云芝α-半乳糖苷酶成為1種有效途徑。本研究擬對云芝發(fā)酵生產(chǎn)高活性α-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)劑和發(fā)酵培養(yǎng)基進行研究，為更進一步開發(fā)應(yīng)用α-半乳糖苷酶提供試驗理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

云芝菌種由陜西省微生物研究所微生物資源中心第三研究室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基

綜合PDA培養(yǎng)基。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基

豆粕粉2%、磷酸二氫鉀0.1%。

1.2.3 誘導(dǎo)物篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基

蛋白胨2%、磷酸二氫鉀0.5%，去離子水100mL。

1.2.4 液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基

豆粕粉6%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.1%。

1.2.5 液體發(fā)酵培養(yǎng)基

豆粕粉2%、半乳糖1%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂0.1%。

1.3 方法

1.3.1 種子液制備

按1.2.2配方配制種子液培養(yǎng)基，采用250 mL三角瓶裝入50 mL種子液，加入10?！?5粒玻璃珠，高壓滅菌后接入云芝試管菌種，于搖床培養(yǎng)6d，培養(yǎng)條件為振蕩頻率180 r·min-1，溫度26℃。

1.3.2 誘導(dǎo)物篩選試驗

在誘導(dǎo)物篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖2%、蔗糖2%、半乳糖2%、棉籽糖2%、豆粕粉6%、玉米粉6%，高壓滅菌后接入云芝試管菌種，于搖床培養(yǎng)，振蕩頻率180 r·min-1，溫度26℃。每天取樣進行發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶活性的測定。

1.3.3 碳源篩選試驗

在液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.5%、1%、2%三個含量的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、玉米粉、棉籽糖，高壓滅菌后接入3%的種子培養(yǎng)液，于搖床培養(yǎng)，振蕩頻率180 r·min-1，溫度26℃。重復(fù)3次，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照。

1.3.4 氮源篩選試驗

在液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入4%、6%、8%三個含量的蛋白胨、酵母粉，0.4%、0.8%、1.2%三個含量的硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨，高壓滅菌后接入3%的種子培養(yǎng)液，于搖床培養(yǎng)，振蕩頻率180r·min-1，溫度26℃。重復(fù)3次，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照。

1.3.5 無機鹽篩選試驗

在只含有6%豆粕粉的液體基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.05%、0.1%和0.2%三個含量的硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鐵，高壓滅菌后接入3%的種子培養(yǎng)液，于搖床培養(yǎng)，振蕩頻率180 r·min-1，溫度26℃。重復(fù)3次，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照。

1.3.6 正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素篩選試驗結(jié)果，對篩選出的豆粕粉（A）、半乳糖（B）、硫酸鎂（C）和磷酸二氫鉀（D）進行四因素三水平正交優(yōu)化試驗，見表1。

表1 L9(34)正交試驗的因素及水平Tab.1 Factors and their levels in L9(34)orthogonal test

1.3.7 α-半乳糖苷酶活性的測定

吸取0.1 mL適當稀釋后的粗酶液，再加入同體積的10 mmol·L-1對硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷作為底物，在40℃恒溫條件下振蕩反應(yīng)10 min，再加入0.5 mol·L-1Na2CO3溶液0.8 mL振蕩混勻，在405nm波長處測定吸光值。

酶活力單位定義：在一定條件下，每分鐘生成1 μmol對硝基苯酚的酶量為一個酶活力單位[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)物對云芝發(fā)酵液產(chǎn)酶的影響

不同誘導(dǎo)物對云芝發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響情況見圖1。

由圖1可以看出，以豆粕粉為誘導(dǎo)物時，培養(yǎng)至第7天在發(fā)酵液中檢測到α-半乳糖苷酶，酶活性為38.78 U·mL-1，第13天時酶活性迅速增至180.71 U·mL-1，培養(yǎng)至第14天酶活性達到最大值213.73 U·mL-1；以玉米粉為誘導(dǎo)物時，發(fā)酵初期檢測不到α-半乳糖苷酶的活性，培養(yǎng)至第11天時檢測到酶活性僅為28.17 U·mL-1，繼續(xù)發(fā)酵到第15天時酶活性達到最大值73.98 U·mL-1；以棉籽糖為誘導(dǎo)物時，培養(yǎng)至第14天時才檢測到α-半乳糖苷酶的活性，為32.82 U·mL-1，第 16 天時酶活性為 83.94 U·mL-1；以葡萄糖、半乳糖和蔗糖為誘導(dǎo)物時，直至發(fā)酵至第16天時才檢測到α-半乳糖苷酶，但活性均較低，分別為 9.21 U·mL-1、13.38 U·mL-1和 8.24 U·mL-1。因此，云芝發(fā)酵生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的最佳誘導(dǎo)物為豆粕粉。

圖1 誘導(dǎo)物對α-半乳糖苷酶發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different inducer sources on the α-galactosidase fermentation

2.2 不同碳源對云芝發(fā)酵液產(chǎn)酶的影響

不同碳源對云芝發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響情況見圖2。

圖2 碳源對α-半乳糖苷酶發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the α-galactosidase fermentation

從圖2可以看出，添加0.5%半乳糖對發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶活性的影響最大，酶活性達到259.40 U·mL-1，高于對照培養(yǎng)基（222.50 U·mL-1），添加0.5%蔗糖時發(fā)酵液中酶活性為212.00 U·mL-1，低于對照培養(yǎng)基；隨著半乳糖和蔗糖濃度的增加，酶活均隨之降低；添加葡萄糖、棉籽糖和玉米粉對發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶沒有促進作用。因此，云芝發(fā)酵生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的最佳碳源為半乳糖。

2.3 不同氮源對云芝發(fā)酵液產(chǎn)酶的影響

不同氮源對云芝發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響情況見圖3。

圖3 氮源對α-半乳糖苷酶發(fā)酵的影響Fig.3 Efect of different nitrogen sources on the α-galactosidase fermentation

從圖3可以看出，添加的幾種氮源均使發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶酶活性低于對照培養(yǎng)基（185.9 U·mL-1），尤其是添加8%酵母粉時酶活性降至38.67 U·mL-1，而且同一種氮源隨著濃度的升高，產(chǎn)α-半乳糖苷酶的能力也隨之降低。因此，云芝發(fā)酵生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的培養(yǎng)基中不需要額外添加氮源，誘導(dǎo)物豆粕粉在誘導(dǎo)α-半乳糖苷酶產(chǎn)生的同時，也作為有機氮源為其生長提供營養(yǎng)。

2.4 不同無機鹽離子對云芝發(fā)酵液產(chǎn)酶的影響

不同無機鹽離子對云芝發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響情況見圖4。

圖4 無機鹽離子對α-半乳糖苷酶發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of different ions on the α-galactosidase fermentation

從圖4可以看出，添加0.05%MgSO4和0.1%KH2PO4對發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶的產(chǎn)生有促進作用，酶活均高于對照培養(yǎng)基（187.96 U·mL-1），分別為197.26 U·mL-1和196.93 U·mL-1，且差異不明顯；添加任何濃度的CaCl和FeSO4均不利于α-半乳糖苷酶的產(chǎn)生，酶活性均低于對照培養(yǎng)基。因此，云芝發(fā)酵生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的無機鹽應(yīng)選取硫酸鎂和磷酸二氫鉀。

2.5 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基的結(jié)果與直觀分析

L9(34)正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基的結(jié)果分析見表2。

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果直觀分析表Tab.2 Intuitive analysis table for the result of L9(34)orthogonal test

從極差分析結(jié)果可以看出，各因素影響云芝發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶能力的順序依次為：D＞A＞B＞C，其中影響最為顯著的是MgSO4，其次是豆粕粉和半乳糖，KH2PO4影響不顯著。從表中還可以看出，正交試驗優(yōu)水平組合A1B1C2D2為最優(yōu)組合，即優(yōu)化后的云芝發(fā)酵培養(yǎng)基為：豆粕粉2%、半乳糖0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%。以優(yōu)化獲得的培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)8 d，重復(fù)3次，發(fā)酵液中α-半乳糖苷酶的酶活性平均值為301.6 U·mL-1，表明此配方合理，達到了優(yōu)化培養(yǎng)基的目的。

3 結(jié)論

通過單因素篩選試驗確定了云芝發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的最佳誘導(dǎo)物為豆粕粉，以其作為發(fā)酵培養(yǎng)基固定組成，進一步試驗發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳碳源為半乳糖，誘導(dǎo)物豆粕粉起到氮源的作用為其生長提供營養(yǎng)，不需要額外添加氮源物質(zhì)，無機鹽宜選取 MgSO4和 KH2PO4。

通過L9(34)正交試驗優(yōu)化云芝發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的培養(yǎng)基，確定最優(yōu)培養(yǎng)和組合為：豆粕粉2%、半乳糖0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%，發(fā)酵培養(yǎng)8 d，酶活性可達301.6 U·mL-1。

參考文獻：

[1]杜芳.雞樅菌和云芝中α-半乳糖苷酶的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[2]楊冠東，劉芳，李荷.飼用α-半乳糖苷酶的研究進展概況[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（3）：275-179.

[3]郝桂娟，張凱，王學(xué)智，等.α-半乳糖苷酶的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（3）：149-154.

[4]Ramalingam,Saraswathy N,Sadasivam S,et al.Purification and properties of alpha-galactosidase from white-rot fungus Pleurotus florida [J].Indian Journal of Biochemistry&Biophysics,2007,44(2):76-81.

[5]Rezessy-Szabó JM,Nguyen QD,Hoschke á,et al.A novel thermostable α-galactosidase from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus CBS 395.62/b:Purification and characterization[J].Biochimica Et Biophysica Acta General Subjects,2007,1770(1):55-62.