康彩霞,戴星照,劉 艷

(1.華東交通大學(xué)土木建筑學(xué)院,江西 南昌 330013；2.江西省山江湖開發(fā)治理委員會(huì)辦公室,江西 南昌 330046； 3.江西省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站,江西 南昌 330039)

亞洲苦草(Vallisneriaasiatica)是一種常見的沉水植物,分布廣泛,有較強(qiáng)的吸污能力和耐污性,且再生能力強(qiáng),是治理水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要水生植物[10]。目前生物方法以其低成本、高效安全的特點(diǎn)成為控制湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的研究熱點(diǎn)[11]。因此，本文以富營(yíng)養(yǎng)化水體為研究背景,以高等水生植物亞洲苦草為研究對(duì)象，通過室內(nèi)靜態(tài)模擬試驗(yàn),對(duì)亞洲苦草葉片中葉綠素a、蛋白質(zhì)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性進(jìn)行了分析,探討了高濃度氨氮或磷營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)亞洲苦草抗氧化生理系統(tǒng)的影響,以便闡明水生植物消失的原因,并為富營(yíng)養(yǎng)化水體中沉水植物的恢復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料與裝置

(1) 試驗(yàn)材料：選取于水體中根系發(fā)達(dá)的成熟亞洲苦草,去除泥土和枯葉,用曝曬過的自來水充分沖洗后浸泡3 d，選取健壯并長(zhǎng)勢(shì)一致的植株用于試驗(yàn)。

(2) 試驗(yàn)裝置：試驗(yàn)裝置為體積40 L的鋼化玻璃水槽，其尺寸為30 cm(長(zhǎng))×30 cm(寬)×45 cm(高)，見圖1。

圖1 試驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental device

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 3 測(cè)定方法

(2) 亞洲苦草葉片中葉綠素a的濃度的測(cè)定：取2 g亞洲苦草葉子,加入10 mL丙酮,用研缽研磨成漿,在離心力為12 000×g下離心10 min,取其上清液于645 nm和663 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值OD645和OD663。葉綠素a的濃度采用Chl.a(mg/g鮮重)=20.21OD645-8.02OD663公式計(jì)算[12]。

(3) 亞洲苦草葉片中蛋白質(zhì)含量和氧化酶活性的測(cè)定：另取2 g亞洲苦草葉子,用8 mL的50 mM的磷酸鉀緩沖液研磨,再在緩沖液中加入3 mM的EDTA和0.5% (W/V)的PVP，混合液在4℃、12 000×g離心力下離心10 min,取萃取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)的含量和氧化酶的活性。蛋白質(zhì)的測(cè)定根據(jù)Lowry等[13]提出的方法進(jìn)行，即取0.6 mL萃取上清液稀釋5倍，加入3 mL由溶于0.1 M NaOH的2% Na2CO3和溶于1%酒石酸鈉的0.5% CuSO4組成的混合液,在25°C水浴中反應(yīng)10 min后加入50%(V/V)Folin試劑,靜置30 min,于波長(zhǎng)750 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線由牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在相同的步驟下測(cè)定得出。SOD活性單位以抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示[14]；CAT活性由萃取液和過氧化氫在24 °C常壓下產(chǎn)生的氧氣量決定[15]。

1. 4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差SD標(biāo)記；處理前(0 d)的數(shù)據(jù)與處理后(20 d)的數(shù)據(jù)之間的顯著性差異采用統(tǒng)計(jì)學(xué)單因素方差分析,并采用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 水體中pH值和營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的變化

經(jīng)過20 d處理后，各試驗(yàn)組水體中pH值和營(yíng)養(yǎng)鹽濃度見圖2和表1。

圖2 試驗(yàn)前后各試驗(yàn)組水體中pH值變化Fig.2 Changes of pH at the beginning and the end of the experiments

由圖2可見，各試驗(yàn)組水體中pH值沒有顯著差異，試驗(yàn)結(jié)束后各試驗(yàn)組水體中pH值在7.29～8.00之間。

表1 試驗(yàn)前后各試驗(yàn)組營(yíng)養(yǎng)鹽的濃度(mg/L)Table 1 Concentrations of nutrients (mg/L) at the beginning and the end of the experiments

2.2 亞洲苦草葉片中葉綠素a和蛋白質(zhì)含量的變化

由于本試驗(yàn)選取的亞洲苦草是健壯并長(zhǎng)勢(shì)一致的植株,所以在試驗(yàn)初期(0 d)其葉片中的葉綠素a和蛋白質(zhì)含量基本一致。經(jīng)過20 d處理后,亞洲苦草葉片中葉綠素a的含量明顯上升，但與亞洲苦草適宜生存的中濃度氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽(N1P1組)相比,高濃度氨氮(N2P1組)和高濃度磷(N1P2組)處理后的亞洲苦草葉片中葉綠素a含量的上升量要顯著減小,各試驗(yàn)組之間均存在顯著性差異(見圖3)。與處理前相比,中濃度氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽與高濃度氨氮營(yíng)養(yǎng)鹽處理后的亞洲苦草葉片中蛋白質(zhì)含量沒有顯著性差異，見圖4。

圖3 試驗(yàn)前后各試驗(yàn)組亞洲苦草葉片中葉綠素a含量的變化Fig.3 Changes of chlorophyll a content in the leaves of V.asiatica at the beginning and the end of the experiments

圖4 試驗(yàn)前后各試驗(yàn)組亞洲苦草葉片中蛋白質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of protein contents of in the leaves of V.asiatica at the beginning and the end of the experiments

2. 3 亞洲苦草體內(nèi)SOD和CAT活性的變化

試驗(yàn)前后各試驗(yàn)組亞洲苦草體內(nèi)SOD和CAT活性的變化見圖5和圖6。

圖5 試驗(yàn)前后各試驗(yàn)組亞洲苦草葉片中SOD活性的變化Fig.5 Changes of SOD activities in the leaves of V.asiatica at the beginning and the end of the experiments

由圖5可見，各試驗(yàn)組的亞洲苦草體內(nèi)SOD活性與試驗(yàn)初期相比無任何明顯變化。

圖6 試驗(yàn)前后各試驗(yàn)組亞洲苦草體內(nèi)CAT活性的變化Fig.6 Changes of CAT activities in the leaves of V.asiatica at the beginning and the end of the experiments

由圖6可見，各試驗(yàn)組的亞洲苦草體內(nèi)CAT活性與試驗(yàn)初期相比明顯上升,且高濃度氨氮(N2P1組)和高濃度磷(N1P2組)處理過的亞洲苦草體內(nèi)CAT活性要比中濃度營(yíng)養(yǎng)鹽(N1P1組)處理過的亞洲苦草明顯高很多。

3 討 論

水生植物可以生存的pH值范圍為4～12,適合生長(zhǎng)的pH值范圍為6～10[16]。本試驗(yàn)中,pH值在7.52～8.00之間變化，因此營(yíng)養(yǎng)鹽濃度是影響亞洲苦草生長(zhǎng)的唯一因素。

3. 1 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)亞洲苦草代謝反應(yīng)的影響

氮是植物葉綠素的重要組成成分，磷在植物體內(nèi)也參與光合作用及細(xì)胞分裂等其他一些過程,所以氮、磷的補(bǔ)充可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。經(jīng)過20 d處理后,亞洲苦草葉片中葉綠素a的含量有明顯上升,表明中濃度氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽可以促進(jìn)亞洲苦草的生理代謝；但隨著氨氮或磷濃度的增加,亞洲苦草葉片中葉綠素a的含量與中濃度營(yíng)養(yǎng)鹽處理后的相比有所下降，表明高濃度氨氮或高濃度磷會(huì)抑制亞洲苦草的新陳代謝。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用必不可少的物質(zhì)，而光合作用是植物體內(nèi)極為重要的代謝過程,其作用強(qiáng)弱對(duì)植物生長(zhǎng)及抗逆性具有十分重要的影響[17]，因此葉綠素a含量的高低在很大程度上反映了植株的生長(zhǎng)狀況和光合作用的效率[17]。環(huán)境脅迫可使葉綠素a的含量降低。經(jīng)中濃度營(yíng)養(yǎng)鹽處理后,亞洲苦草葉片中葉綠素a的含量顯著增加，表明中濃度氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽可以促進(jìn)亞洲苦草的光合作用，但隨著氨氮或磷濃度的增加,亞洲苦草光合作用系統(tǒng)受到損傷,光合作用效率受到抑制，這可能是因?yàn)楦邼舛劝钡蚋邼舛攘讜?huì)脅迫亞洲苦草產(chǎn)生大量的活性氧,從而對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)有損害作用。

植物新陳代謝涉及到的酶絕大多數(shù)屬于蛋白質(zhì)，所以植物體內(nèi)蛋白質(zhì)含量常被作為指示外界環(huán)境對(duì)植物生理影響的指標(biāo)[17]。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組之間亞洲苦草體內(nèi)的蛋白質(zhì)含量沒有顯著性差異,可能是因?yàn)樘幚頃r(shí)間僅為20 d,在短時(shí)間內(nèi)亞洲苦草體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量無法表現(xiàn)出明顯的區(qū)別，而在長(zhǎng)時(shí)間的高濃度氨氮或磷脅迫下可能會(huì)造成亞洲苦草體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的下降。本試驗(yàn)結(jié)果證明了富營(yíng)養(yǎng)化水體中高濃度營(yíng)養(yǎng)鹽是亞洲苦草和其他沉水植物大量衰退的主要原因之一,這與吳義鋒等[18]的研究結(jié)果基本一致。

3. 2 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)亞洲苦草抗氧化反應(yīng)的影響

經(jīng)高濃度營(yíng)養(yǎng)鹽處理后亞洲苦草體內(nèi)CAT活性急劇上升,表明亞洲苦草受到高濃度營(yíng)養(yǎng)鹽的脅迫?；钚陨仙腃AT和基本不變的SOD顯示亞洲苦草通過提升自身的CAT酶活性來適應(yīng)逆境脅迫[19],且CAT比SOD對(duì)于高濃度營(yíng)養(yǎng)鹽的脅迫更加敏感。SOD和CAT作為亞洲苦草自身保護(hù)系統(tǒng)的重要組成部分,可以保持活性氧在其產(chǎn)生和清除之間處于動(dòng)態(tài)平衡,避免活性氧過量對(duì)植物造成的傷害。SOD通過歧化反應(yīng)可將有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫；盡管過氧化氫仍是對(duì)有機(jī)體有害的活性氧,但是CAT會(huì)立即將其分解為完全無害的水[20]。本試驗(yàn)中亞洲苦草體內(nèi)SOD活性基本沒有變化,未被SOD歧化降解的超氧自由基可以通過Haber-Weiss反應(yīng)轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的羥自由基[21]。所以,高濃度氨氮或高濃度磷對(duì)亞洲苦草造成傷害可能一部分歸因于超氧自由基和過氧化氫,另一部分則歸因于毒性更大的羥自由基。在經(jīng)過20 d處理后,亞洲苦草體內(nèi)CAT活性急劇上升,表明在遭受高濃度氨氮或高濃度磷脅迫時(shí),亞洲苦草體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)啟動(dòng),以抵御外界環(huán)境脅迫對(duì)亞洲苦草造成的氧化損傷。亞洲苦草對(duì)氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽的抗氧化反應(yīng)機(jī)理見圖7。

圖7 亞洲苦草對(duì)氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽的抗氧化反應(yīng)Fig.7 Antioxidant responses of V.asiatica to N and P nutrients

3. 3 營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)亞洲苦草生理反應(yīng)的影響

由圖7可知,中濃度的氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽可以促進(jìn)亞洲苦草的生長(zhǎng)。亞洲苦草在正常的有氧代謝過程中,不可避免地會(huì)產(chǎn)生活性氧,SOD和CAT發(fā)揮其清除過剩活性氧的功能使亞洲苦草體內(nèi)活性氧在產(chǎn)生和清除之間維持動(dòng)態(tài)平衡。充足的營(yíng)養(yǎng)鹽能保證亞洲苦草進(jìn)行正常的光合作用,體內(nèi)葉綠素a和蛋白質(zhì)含量有所提高,生長(zhǎng)健康。但是,隨著氨氮或磷濃度的提高,亞洲苦草受到一定的脅迫,CAT活性明顯提高以抵御外界的脅迫,但是抗氧化能力有限,活性氧的動(dòng)態(tài)平衡被打破,產(chǎn)生的大量剩余活性氧對(duì)亞洲苦草造成了嚴(yán)重的氧化損傷,亞洲苦草的光合作用功能下降,其體內(nèi)葉綠素a和蛋白質(zhì)含量相對(duì)于中濃度氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽處理后的含量明顯降低,表明高濃度氨氮或高濃度磷會(huì)對(duì)亞洲苦草產(chǎn)生脅迫,影響亞洲苦草的健康生長(zhǎng)。因此,為了減少對(duì)亞洲苦草的氧化損傷,在富營(yíng)養(yǎng)化水體中恢復(fù)沉水植物亞洲苦草時(shí),對(duì)氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽進(jìn)行雙重控制是非常必要的。

另外,在貧營(yíng)養(yǎng)水體中,沉水植物可以直接從水層和底泥中吸收氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽,降低水體中的氮、磷營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度,從而抑制藻類生長(zhǎng)[22]。隨著水體中營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的增加,藻類大量繁殖，從而對(duì)沉水植物產(chǎn)生遮光效應(yīng),同時(shí)形成的低CO2環(huán)境也會(huì)抑制沉水植物的生長(zhǎng)[23]。雖然在本試驗(yàn)期間試驗(yàn)水槽中沒有藻類生長(zhǎng),但在富營(yíng)養(yǎng)化水體中恢復(fù)沉水植物時(shí)仍要注意藻類的生長(zhǎng)繁殖對(duì)其生長(zhǎng)的影響。

4 結(jié) 論

(1) 對(duì)于中高濃度氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽的脅迫,CAT比SOD更為敏感，亞洲苦草可以通過提高CAT活性來抵御外界環(huán)境的脅迫。

(2) 對(duì)于高濃度氨氮或高濃度磷脅迫,亞洲苦草的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)雖然被激活,但是不能保證亞洲苦草的代謝系統(tǒng)免受損傷,直接危害表現(xiàn)為亞洲苦草葉片中葉綠素a的含量明顯下降。

(3) 富營(yíng)養(yǎng)化水體中沉水植物消失的重要原因之一是氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的增加，所以在富營(yíng)養(yǎng)化水體中恢復(fù)沉水植物亞洲苦草時(shí),對(duì)氮、磷營(yíng)養(yǎng)鹽進(jìn)行雙重控制是至關(guān)重要的。

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