謝景夢 孟辰穎 李二粉 張英俠 宋旭琴 張媚玉 賀利民

摘 要 建立了簡單、靈敏、可靠的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定豬尿中玉米赤霉醇及其類似物、氯霉素、五氯苯酚等10種違禁物質(zhì)的分析方法。豬尿樣品分別采用凍干法和QuEChERS法前處理，乙腈和5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，梯度洗脫，分析物經(jīng)Zorbax SB-C18色譜柱分離，在電噴霧負(fù)離子模式下，采用四極桿質(zhì)譜儀進行多反應(yīng)監(jiān)測分析。在實驗濃度范圍內(nèi)，10種分析物基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99； 在5、10及20 μg/L添加濃度水平，兩種前處理方法所得10種分析物的回收率分別為80.7%～107.7%和73.5%～103.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于15%，檢出限和定量限分別為0.1～2.0 μg/L和0.2～5.0 μg/L。本方法可滿足生豬體內(nèi)多種違禁物質(zhì)的快速篩查監(jiān)測要求。

關(guān)鍵詞 違禁藥物； 凍干法； QuEchERS法； 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法； 豬尿

1 引 言

現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中，獸藥在畜禽疾病的預(yù)防、治療及改善動物性食品品質(zhì)方面起著重要的作用[1]。農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定31種獸藥禁止用于所有食用動物，9種獸藥可用于治療但不得在動物性食品中檢出[2]。但是濫用藥物或者違規(guī)使用違禁藥物的現(xiàn)象仍常常發(fā)生，造成獸藥在動物性食品中殘留，對人類健康、畜牧業(yè)發(fā)展及生態(tài)環(huán)境均造成嚴(yán)重危害。近年，在動物性食品中檢出違禁藥物的報道較多[3～5]，建立高效、靈敏和可靠的動物中違禁藥物監(jiān)測方法對確保食品動物質(zhì)量安全具有重要意義。

目前，各國規(guī)定食品中有害物質(zhì)的限量水平越來越低，因此需要更靈敏的檢測手段和更有效的前處理技術(shù)分析復(fù)雜食品基質(zhì)中的有害物質(zhì)[6]。動物源性食品及尿液、糞便等排泄物樣品基質(zhì)復(fù)雜，違禁藥物含量低，理化性質(zhì)差異大，對違禁藥物多殘留分析樣品前處理技術(shù)提出了更高要求[7-8]。凍干溶劑置換法和QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）法因其獨特優(yōu)勢，在動物性食品、環(huán)境水及土壤等復(fù)雜基質(zhì)中多類藥物殘留分析中均有很多報道[9～16]。大部分藥物在動物體內(nèi)不能被完全吸收，通常以原型或代謝物的形式隨尿液或糞便排出體外。相比于其它組織樣品，尿液在采集過程中可減少對活體動物的影響，適合作為大規(guī)模安全監(jiān)管的檢測介質(zhì)[17]。孫曉亮等[18]采用MCX柱凈化，王麗君等[19]則采用分子印跡固相萃取凈化，均建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時測定豬尿液中β-受體激動劑類違禁藥物殘留方法。QuEChERS法和凍干法都是豬尿中違禁物質(zhì)的有效監(jiān)測手段，而根據(jù)違禁藥物的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)特性和酸堿性，按正、負(fù)兩種電離模式進行分類監(jiān)測將大大提高分析和監(jiān)測效率。基于LC-MS/MS電噴霧正離子監(jiān)測模式，本研究組已建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定豬尿中23種禁用藥物的分析方法[20，21]。

玉米赤霉醇及其類似物和己烯雌酚具有激素作用藥物，能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率和胴體瘦肉率；氯霉素和硝基酚鈉為抗菌藥；五氯苯酚在畜牧業(yè)生產(chǎn)中主要作為消毒劑，這些藥物都禁止用于食品動物或在動物性食品中不得檢出，它們的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特性各異，難以通過固相萃取技術(shù)凈化、富集。為此，本研采用通用性強的凍干法和QuEChERS快速前處理法，基于它們在負(fù)離子模式下的共同特性，建立了靈敏和可靠的LC-MS/MS同時監(jiān)測豬尿中氯霉素、己烯雌酚和玉米赤霉醇類等10種違禁藥物的分析方法，對提高生豬生產(chǎn)中違禁物質(zhì)監(jiān)測的時效性具有重要的實際意義。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；API 4000電噴霧-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司）；真空冷凍干燥機（德國Christ公司）。

玉米赤霉醇及其類似物（純度>98.5%，中國獸藥藥品監(jiān)察所）；氯霉素、己烯雌酚及對硝基酚鈉（純度>99.3%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；五氯苯酚（純度>98.9%，中國農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所）；甲醇和乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；N-丙基-乙二胺（PSA，德國CNW公司），C18和石墨化碳（GCB）填料（上海月旭公司）。

標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 mg/L）：分別準(zhǔn)確稱取10種藥物對照品， 用甲醇溶解并定容至10 mL，20℃避光保存，12個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 mg/L）：分取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，混勻，20℃避光保存，有效期3個月。

2.2 前處理方法

2.2.1 凍干法 取5 mL豬尿置于離心管中，加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，混勻，置真空冷凍干燥機中凍干15 h。殘渣用2 mL 50%（V/V）乙腈-水溶液超聲復(fù)溶，15000 r/min離心10 min，取上清液，待測。

2.2.2 QuEChERS法 取5 mL豬尿置于離心管中，依次入加10 mL乙腈、4 g無水MgSO4和1 g NaCl，振蕩離心后，取上層轉(zhuǎn)移至裝有200 mg PSA的離心管中，渦旋，8000 r/min離心10 min，移取上清液，吹干，殘渣用1 mL 50%（V/V）乙腈-水復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，待測。

2.3 LC-MS/MS分析條件

2.3.1 液相色譜條件 Zorbax SB-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm）；流速0.3 mL/min；流動相A為乙腈，B為5 mmol/L乙酸銨溶液。梯度洗脫：0.0～4.0 min，15% A；4.0～10.0 min，70% A；10.1 min，15% A。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離負(fù)離子模式，電噴霧電壓4000 V，離子源溫度550℃，霧化氣壓力60 psi， 輔助氣壓力65 psi，氣簾氣壓力25 psi。

3 結(jié)果與討論

3.1 儀器條件優(yōu)化

3.1.1 質(zhì)譜條件選擇 在負(fù)離子模式下，對10種藥物進行母離子和子離子掃描，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3.1.2 液相色譜條件選擇 比較了Agilent Zorbax SB-Aq與SB-C18（150 mm × 2.1 mm i.d.， 3.5 μm）和CNW Athena C18-WP （150 mm × 2.1 mm i.d.， 5 μm）3種色譜柱和乙腈（甲醇）-水、乙腈（甲醇）-5 mmol/L 乙酸銨溶液和乙腈（甲醇）-水（含0.1%氨水）流動相體系對10種藥物的分離效果。結(jié)果表明，以乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液體系為流動相，10種藥物在SB-C18色譜柱上分離最好，峰形對稱尖銳。

3.2 凍干法的復(fù)溶效果

為了有效溶解凍干試樣中的目標(biāo)分析物，且最大限度減少基質(zhì)中雜質(zhì)的溶出，考察了30%乙腈（甲醇）、乙腈（甲醇）（含5 mmol/L乙酸銨）、30%乙腈（甲醇）（含5 mmol/L乙酸銨及0.01%氨水）的復(fù)溶效果。結(jié)果表明，甲醇溶液體系作為復(fù)溶液，因大量雜質(zhì)同時復(fù)溶而影響分離和電離，存在較嚴(yán)重的基質(zhì)抑制效應(yīng)，分析物回收率均較低。而含乙腈的3種復(fù)溶體系，分析物的回收率都較高，且相差不大。因此，最終選擇乙腈-水體系作為復(fù)溶液。進一步比較10%、30%、50%、80%及100% （V/V） 乙腈作為復(fù)溶液時分析物的回收率。結(jié)果表明，隨著復(fù)溶液中乙腈含量增加，回收率逐漸提高；50%和80%乙腈為復(fù)溶液，分析物回收率都達到80%以上，但純乙腈為復(fù)溶液，藥物的回收率反而降低，且80%以上乙腈為復(fù)溶液，分析物的色譜峰變寬，并出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。因此，選擇50% （V/V）乙腈-水作為豬尿樣品凍干殘渣的復(fù)溶液。

3.3 QuEChERS法

3.3.1 提取 QuEChERS法用于殘留分析時，常使用乙腈作為提取劑[22]。QuEChERS法通常用無水MgSO4作為脫水劑，并加入NaCl等鹽類，從而形成飽和鹽溶液與有機相分層，促使待測物從水相轉(zhuǎn)移到有機相中。經(jīng)優(yōu)化后的乙腈提取液體積、無水MgSO4及NaCl用量分別為10 mL乙腈、4 g無水MgSO4和1 g NaCl。

3.3.2 凈化 比較了吸附劑PSA、C18和GCB對待測物回收率的影響。結(jié)果表明，PSA凈化效果最好，10種分析物的回收率均達80%以上；C18的回收率較低，其中五氯苯酚和對硝基酚鈉的回收率低于20%，其它藥物也低于50%；GCB的回收率最低，五氯苯酚和α-玉米赤霉烯醇的回收率<5%。可能主要是后二者在吸附雜質(zhì)的同時也大量吸附了分析物。進一步優(yōu)化了PSA用量，實驗表明， PSA用量小于150 mg時，凈化效果不理想，基質(zhì)效應(yīng)較強；采用200 mg PSA凈化豬尿樣品，去雜效果最好，基質(zhì)效應(yīng)最小，分析物回收率均大于75%。

3.4 方法學(xué)驗證

3.4.1 選擇性 將空白豬尿分別按照凍干法和QuEChERS法進行處理，得到的凍干法空白豬尿添加10種違禁物質(zhì)和空白豬尿的MRM質(zhì)量色譜圖如圖1所示，目標(biāo)化合物出峰時間附近沒有干擾峰，峰形尖銳對稱，與雜質(zhì)分離良好，方法選擇性好。

3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 在0.1～200.0 μg/L濃度范圍內(nèi)，采用凍干法和QuEChERS法測定10種藥物的線性關(guān)系良好， 相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。

3.4.3 回收率與精密度 低、中、高（5， 10 和20 μg/L）3個添加濃度水平的豬尿樣品，除QuEChERS法的五氯苯酚回收率約75%外，其余分析物的回收率都大于80%，10種分析物的批內(nèi)和批間精密度（RSD）均小于20%，凍干法和QuEChERS法的結(jié)果分別見表2和表3。

3.4.4 檢出限與定量限 配制一系列濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，按3倍信噪比（S/N）計算方法檢出限，10倍信噪比計算定量限，凍干前處理方法的檢出限和定量限如表2，QuEChERS法的檢出限和定量限見表3。凍干法的10種分析物的檢測限和定量限分別為0.1～2.0 μg/L和0.2～5.0 μg/L；QuEChERS法的分別為0.1～1.0 μg/L和0.2～2.0 μg/L，兩種方法都具有較高的靈敏度。

3.5 凍干法和QuEChERS法的比較

本研究建立的基于凍干和QuEChERS兩種前處理技術(shù)快速檢測豬尿中10種違禁物質(zhì)方法，兩種方法都具有較高的靈敏度和回收率，滿足殘留分析檢測要求。與傳統(tǒng)的提取和凈化過程相比，兩種方法具有操作簡單、通用性強、有機試劑用量少和藥物損失少等優(yōu)點。

與QuEChERS法相比，凍干法所需時間相對較長，基質(zhì)效應(yīng)大。同時，由于QuEChERS法采用PSA固相分散吸附雜質(zhì)，凈化效果好，一些藥物的檢出限低于凍干法。但是QuEChERS法在前處理過程中添加鹽類和吸附劑，可能會使藥物少量損失，回收率略低于凍干法。兩種方法各有優(yōu)缺點，均符合殘留分析檢測要求，可根據(jù)實際情況選擇兩種方法。

3.6 實際樣品分析

500份不同來源的豬尿樣品，按照建立的基于QuEChERS前處理技術(shù)的LC-MS/MS方法分析監(jiān)測，其中1份豬尿試樣檢測出約0.83 μg/L的氯霉素，其它違禁物質(zhì)均未檢出。檢出氯霉素的陽性豬尿試樣用凍干法復(fù)測，測定值為0.97 μg/L。

4 結(jié) 論

建立了豬尿中6種玉米赤霉醇類化合物、氯霉素、己烯雌酚、五氯苯酚以及對硝基酚鈉共10種違禁物質(zhì)快速篩查的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。凍干法和QuEChERS法兩種前處理方法均操作簡單，都獲得了較好的回收率與高的靈敏度，建立的方法可用于豬尿樣品中10種違禁物質(zhì)的同時快速監(jiān)測。

References

1 FENG Bing， WANG Shuo. Food Research and Development， 2007， （01）： 158-162

馮 冰， 王 碩. 食品研究與開發(fā)， 2007， （01）： 158-162

2 Maximum Residue Limits of Veterinary Drugs in Animal Derived Food. MOA， Bulletin 235， 2002， Annex 3 and 4

動物源性食品中獸藥最大殘留限量. 農(nóng)業(yè)部235號公告， 2002， 附錄3和4

3 YAN Zhong-Yong， ZHANG Xiao-Jun， MEI Guang-Ming， LI Pei-Pei， LONG Ju， ZHU Yin， WANG Jian. Food Sci.， 2014， 35（16）： 153-159

嚴(yán)忠雍， 張小軍， 梅光明， 李佩佩， 龍 舉， 祝 銀， 王 建. 食品科學(xué)， 2014， 35（16）： 153-159

4 GAO Yu-Feng， ZHEN Zhen-Peng， ZHANG Lin， CHEN Hong-Xiang， YU Gou-Bin， GUO Jian-Xiong， LI Hai-Qiao. Chin. J. Food. Hygi.， 2016， 28（3）： 372-374

高裕鋒， 甄振鵬， 張 琳， 陳紅香， 余構(gòu)彬， 郭劍雄， 李海喬. 中國食品衛(wèi)生雜志， 2016， 28（3）： 372-374

5 Chen X B， Wu Y L， Yang T. J. Chromatogr. B， 2011， 879（11）： 799-803

6 WANG Fei， JIANG Hong， ZHENG Ping. Anhui Chemical Industry， 2007， （06）： 3-7

王 飛， 蔣 閎， 鄭 屏. 安徽化工， 2007， （06）： 3-7

7 ZHANG Yi， YUE Zhen-Feng， GUO Wen， WU Shao-Jing， SHEN Jin-Can， XIAO Chen-Gui， LIN Li， HUA Hong-Hui， HOU Le-Xi， YI Bing-Qing. Food Sci.， 2016， 37（1）： 213-221

張 毅， 岳振峰， 郭 文， 吳紹精， 沈金燦， 肖陳貴， 林 黎， 華紅慧， 侯樂錫， 易冰清. 食品科學(xué)， 2016， 37（1）： 213-221

8 LIU Qing-Yan， LUO Fang-Mu. J. Instr. Anal.， 2009， 28（5）： 589-591

劉慶艷， 羅芳苜. 分析測試學(xué)報， 2009， 28（5）： 589-591

9 Jiménez V， Companyó R， Guiteras J. Food Chem.， 2012， 134（3）： 1682-1690

10 Wang L Q， Zeng Z L， Wang Z， Guo J Y， He L M. Food Anal. Method， 2016， 9（7）： 1904-1911

11 Bourdatdeschamps M， Leang S， Bernet N， Daudin J J， Nélieu S. J. Chromatogr. A， 2014， 1349： 11-23

12 Villar-Pulido M， Gilbert-López B， García-Reyes J F， Martos N R， Molina-Díaz A. Talanta， 2011， 85（3）： 1419-1427

13 Lopes R P， Reyes R C， Romero-González R， Frenich A G， Vidal J L M. Talanta， 2012， 89： 201-208

14 ZHAO Dong-Hao， WANG Qiang， WANG Xu-Feng， LI Zhi-Guang， HUANG Ke， LI Liu-Dong. Chinese Fishery Quality and Standards， 2017， （03）： 30-37

趙東豪， 王 強， 王旭峰， 黎智廣， 黃 珂， 李劉冬. 中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)， 2017， （03）： 30-37

15 Yu Y， Liu X W， He Z Y， Wang L， Luo M， Peng Y， Zhou Q W.Anal. Methods， 2016， 8（11）： 2463-2470

16 Hu F Y， He L M， Yang J W， Bian K， Wang Z N， Yang H C， Liu Y H. J. Chromatogr. B， 2014， 949-950（4）： 79-86

17 LI Xiao-Min， GAO Yan， SU Xiao-Ou， LI Yang， WANG Rui-Guo， ZHANG Yu， FU Jian-Jie. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（12）： 1779-1784

李曉敏， 高 燕， 蘇曉鷗， 李 陽， 王瑞國， 張 瑜， 傅建捷. 分析化學(xué)， 2014， 42（12）： 1779-1784

18 SUN Xiao-Liang， LI Xue-Lian， CAO Xu-Min， YANG Yan-Fei， WANG Juan， WANG Shu-Ting， WANG Yu-Dong， WANG Xiao-Yin， QU Zhi-Na， ZHAO Si-Jun.Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（1）： 124-132

孫曉亮， 李雪蓮， 曹旭敏， 楊艷菲， 王 娟， 王淑婷， 王玉東， 王曉茵， 曲志娜， 趙思俊. 分析化學(xué)， 2017， 45（1）： 124-132

19 WANG Li-Jun， CAO Xu-Min， SUN Xiao-Liang， WANG Shu-Ting， LIU Jing， HAO Zhi-Hui， QU Bao-Han， ZHAO Si-Jun. Chinese Journal of Chromatography， 2016， 34（3）： 240-248

王麗君， 曹旭敏， 孫曉亮， 王淑婷， 劉 靜， 郝智慧， 曲寶涵， 趙思俊. 色譜， 2016， 34（3）： 240-248

20 WANG Xu-Feng， ZHAO Li， ZHANG Gao-Kui， YANG Jian-Wen， BIAN Kui， WANG Zong-Nan， YANG Hai-Cui， HE Li-Min. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（8）： 1254-1258

王旭峰， 趙 麗， 張高奎， 楊建文， 卞 愧， 王宗楠， 楊海翠， 賀利民. 分析化學(xué)， 2013， 41（8）： 1254-1258

21 Wang X F， Liu Y H， Su Y J， Yang J W， Bian K， Wang Z N， He L M. J. Agric. Food Chem.， 2014， 62（2）： 516-527

22 DONG Jing， GONG Xiao-Ming， ZHANG Li， SUN Jun， WANG Hong-Tao. Chin. J. Health Lab Technol.， 2008， 18（1）： 26-28

董 靜， 宮小明， 張 立， 孫 軍， 王洪濤. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2008， 18（1）： 26-28