劉佳蓉 黃忠平 劉會(huì)君 王麗麗 劉春勝 任一平 史鴻鑫

摘 要 建立了一種實(shí)時(shí)直接分析-質(zhì)譜法（DART-MS）用于飲料（水、碳酸飲料、啤酒）和尿液中γ-羥基丁酸（GHB）快速檢測(cè)。樣品經(jīng)甲醇-水（1∶1， V/V）溶液稀釋后，在負(fù)離子模式下，以選擇離子掃描（SIR）模式進(jìn)行直接定量分析。離子化氣體溫度為 350℃，進(jìn)樣速率為0.5 mm/s。針對(duì)水樣、碳酸飲料、啤酒、尿液樣品，本方法的檢出限（S/N=3）為1～2 μg/mL，定量限（S/N=10）為3～5 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)為0.9899～0.9980，加標(biāo)回收率為80.8%～115.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～12.8%。本方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、分析速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，有望在大批量飲料和尿液樣品的快速篩查分析中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞 實(shí)時(shí)直接分析-質(zhì)譜法；γ-羥基丁酸；快速篩查

1 引 言

γ-羥基丁酸（γ-Hydroxybutyric acid，GHB）是一種常見(jiàn)的濫用藥物，被用作鎮(zhèn)靜劑和麻醉劑，過(guò)度使用會(huì)造成暫時(shí)性失憶，甚至導(dǎo)致死亡。我國(guó)和美國(guó)都將其列為管制藥物。GHB具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)靜及健忘效應(yīng)，易溶于大多數(shù)液體基質(zhì)中，且無(wú)色無(wú)味，因此常作迷藥用于藥物輔助性犯罪[1]。對(duì)于服用GHB者，尿液中GHB濃度明顯高于內(nèi)生濃度水平（低于10 μg/mL），因此尿液是檢測(cè)GHB極具參考價(jià)值的生物樣本，有必要建立快速靈敏的檢測(cè)飲料和尿液中GHB的方法。

目前，GHB的檢測(cè)方法有顯色法、紅外光譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、離子色譜法及核磁共振法等。Alston等[2]用化學(xué)顯色法作為初步篩選藥物的方法，但該方法檢出限高，且易受干擾； Witkowski等[3]采用傅里葉變換紅外法（FTIR）用于GHB的快速篩查，但定量分析存在不足； 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是使用最廣泛的方法之一，Lenz等[4]在酸性條件下將γ-羥基丁酸（GHB）轉(zhuǎn)變?yōu)棣?丁內(nèi)酯（GBL），濃縮后采用頂空進(jìn)樣方式的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）分析； 孟品佳等[5]用五氟卞基溴烷基化衍生后，對(duì)衍生物進(jìn)行了質(zhì)譜解析，然而提取和衍生化的過(guò)程復(fù)雜且耗時(shí)； Busardo等[6]采用HPLC-MS/MS法檢測(cè)血漿、尿液、腦脊髓液和頭發(fā)中的GHB，盡管避免了GC-MS中將GHB進(jìn)行內(nèi)酯化或者衍生化的樣品前處理問(wèn)題，但仍然需要耗時(shí)的色譜分離，且使用的串聯(lián)質(zhì)譜價(jià)格昂貴，不利于推廣。Liu等[7]采用二維離子色譜法測(cè)定了人尿樣品中GHB含量，通過(guò)離子排斥色譜柱消除尿液基質(zhì)干擾，再利用柱切換技術(shù)，采用離子交換色譜柱測(cè)定GHB，由于需要對(duì)儀器進(jìn)行改裝，且使用實(shí)驗(yàn)室自制離子交換色譜柱，不利于推廣。Palomino-Schtzlein等[8]利用核磁共振對(duì)尿液和血清中的GHB進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，在NMR分析中，體液中大分子重疊共振，嚴(yán)重干擾了GHB的檢測(cè)。Saar-Reismaa等[9]利用毛細(xì)管電泳法測(cè)定人唾液樣本中的GHB，但毛細(xì)管電泳中電滲流的不穩(wěn)定性經(jīng)常引起遷移時(shí)間的變化。

實(shí)時(shí)直接分析離子源（DART）是一種新型的敞開(kāi)式非表面接觸型解析/離子化分析技術(shù)，可分析各形態(tài)樣品，無(wú)需繁雜的前處理和冗長(zhǎng)的色譜分離過(guò)程，分析速度為秒級(jí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的實(shí)時(shí)定性與定量分析[10]。Bennett等[11]將DART與飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（TOF）聯(lián)用，檢測(cè)飲料中GHB； Chen等[12]將DART與四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜（Q-Orbitrap）聯(lián)用，用于檢測(cè)包括GHB在內(nèi)的多種街頭藥物。但上述工作均未進(jìn)行GHB的準(zhǔn)確定量分析，且未涉及尿液樣本的檢測(cè)； 同時(shí)，飛行時(shí)間質(zhì)譜和四極桿-離子阱質(zhì)譜比單四極桿質(zhì)譜價(jià)格昂貴，測(cè)試成本高，不利于普及使用。

本研究采用實(shí)時(shí)直接分析-單四極桿質(zhì)譜法，建立了快速檢測(cè)飲料及尿液中的GHB的方法。本方法無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，分析速度快，且單重四極桿質(zhì)譜成本相對(duì)較低，體積小，更易于推廣，飲料及尿液樣本的同時(shí)測(cè)定更利于刑事案件的偵查。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

實(shí)時(shí)直接分析離子源DART SVP（美國(guó)Ion Sense公司）； ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）； 3K15離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）、UPR-II-5T超純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）、VX-200渦旋攪拌器（美國(guó)Labnet公司）、AR223CN電子天平（美國(guó)Ohaus公司）、KH7200DB型超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

甲醇（色譜純，德國(guó) Merck 公司），實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)UPR-II-5T超純水儀制備的超純水； γ-羥基丁酸（美國(guó)Cerilliant公司）。3種飲料樣品購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?，分別為水、無(wú)色碳酸飲料和啤酒； 尿液樣品由志愿者提供。

2.2 溶液配制

稱取GHB標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g （精確到0.001 g），以超純水溶解并定容至10 mL，配制成1000 μg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于4℃保存。使用前以甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

碳酸飲料、啤酒的標(biāo)準(zhǔn)溶液：取碳酸飲料和啤酒各10 μL，加入適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用990 μL甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

模擬樣品的配制： 在空白樣品中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，制得不同濃度的陽(yáng)性樣品。配制的模擬水樣中GHB濃度約為20、40和80 μg/mL，以甲醇稀釋1倍后進(jìn)樣； 碳酸飲料和啤酒中GHB濃度約為1000、2000和4000 μg/mL，以甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋100倍后進(jìn)樣； 尿液中GHB濃度約為200 μg/mL， 以甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋10倍后進(jìn)樣。

2.3 樣品前處理

飲料：水樣取500 μL，加入500 μL甲醇，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)樣； 對(duì)于碳酸飲料和啤酒，取10 μL樣品，加入990 μL甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后檢測(cè)。

尿樣：取尿樣100 μL，加900 μL甲醇-水（1∶1， V/V），渦旋混勻，以10000 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后檢測(cè)。

2.4 實(shí)時(shí)直接分析離子源條件和質(zhì)譜條件

負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，離子化氣體為高純氦氣，氦氣的流速為3 L/min，氣體離子化溫度為350℃； 采用12 Dip-it Samplers 模式進(jìn)樣，用玻璃棒蘸取適量溶液置于自動(dòng)進(jìn)樣架上，待溶液揮干后進(jìn)樣，進(jìn)樣速率為0.5 mm/s，柵極電壓為200 V， 離子源出口距質(zhì)譜進(jìn)口約2.4 cm。在負(fù)離子模式下，選擇離子掃描模式（SIR）采集數(shù)據(jù)，錐孔電壓為8 V，母離子m/z 103.3。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在選擇離子掃描模式下，分別采用正離子模式和負(fù)離子模式對(duì)GHB進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，得到其分子離子峰。如圖1所示，GHB在正負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，但在負(fù)離子模式下GHB的信號(hào)強(qiáng)度明顯優(yōu)于正離子模式，因此本研究選擇負(fù)離子模式進(jìn)樣。在此條件下，優(yōu)化錐孔電壓，使分子離子峰達(dá)到最大響應(yīng)值，最終確定錐孔電壓為8 V。

3.2 DART條件的優(yōu)化

3.2.1 離子化溫度 DART利用高溫激發(fā)態(tài)的等離子體對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行解吸離子化，因此離子化溫度是需要優(yōu)化的重要參數(shù)。溫度過(guò)高或過(guò)低，都會(huì)影響DART的離子化效率和背景噪音。高溫會(huì)加速待測(cè)樣品的熱解吸率，使更多的待測(cè)樣品進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器，進(jìn)而增強(qiáng)響應(yīng)。然而，過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致待測(cè)樣品在熱解吸過(guò)程中降解，降低靈敏度[13]。本研究考察了離子化氣體溫度在300～450℃范圍內(nèi)對(duì)GHB離子化效率的影響，發(fā)現(xiàn)離子化溫度為350℃時(shí)，信號(hào)響應(yīng)最高，如圖2所示。

3.2.2 樣品傳輸速度 DART軟件能控制線性軌道上dip-it玻璃棒的移動(dòng)速度，玻璃棒蘸取待測(cè)樣品后引入質(zhì)譜儀分析。玻璃棒通過(guò)電離區(qū)域的速度對(duì)樣品信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度有較大的影響。本研究考察了樣品傳輸速度為0.2、0.5和0.8 mm/s時(shí)GHB的峰形和離子響應(yīng)強(qiáng)度。如圖3所示，當(dāng)樣品傳輸速度較慢時(shí)，有利于離子化氣體與樣品充分接觸，從而提高離子化效率，但峰形變寬。綜合考慮峰形、分析速度及離子響應(yīng)強(qiáng)度等因素，最終確定以0.5 mm/s的速度進(jìn)行樣品傳輸。

3.3 方法學(xué)考察

水樣的基質(zhì)較為簡(jiǎn)單，用甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋1倍后直接進(jìn)行分析。碳酸飲料和啤酒的基質(zhì)成分較復(fù)雜，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)公式為：基質(zhì)效應(yīng)=（1-基質(zhì)空白溶液的加標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度/空白溶劑的加標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度） ×100%[14]。經(jīng)計(jì)算碳酸飲料和啤酒的基質(zhì)效應(yīng)>15%，故以空白碳酸飲料和啤酒為溶劑配制一系列不同濃度的GHB標(biāo)準(zhǔn)溶液。由于碳酸飲料中含有較多的糖類，樣品黏度大，而啤酒中的成分較為復(fù)雜，基質(zhì)濃度過(guò)高時(shí)，樣品液膜太厚，可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的瞬間氣化，直接進(jìn)樣后得到的選擇離子流圖出現(xiàn)了裂峰現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋碳酸飲料和啤酒樣品，考察稀釋倍數(shù)（10、20、50和100倍）對(duì)峰形及信號(hào)響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，稀釋100倍后直接進(jìn)樣可以消除選擇離子流圖的裂峰現(xiàn)象。

尿液樣品通過(guò)甲醇-水（1∶1， V/V）稀釋10倍后進(jìn)樣，結(jié)果表明，尿液的基質(zhì)效應(yīng)小于15%，屬于低基質(zhì)效應(yīng)影響，故在實(shí)際定量分析過(guò)程中采用與水樣相同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

飲料（水、碳酸飲料、啤酒）和尿液的工作曲線方程如表1所示，其線性范圍均為5～100 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)R>0.98，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～5.7%，檢出限（S/N=3）為1.0～2.0 μg/mL，定量限（S/N=10）為3.0～5.0 μg/mL。

3.4 模擬樣品分析

在實(shí)際的刑事案件中，飲料中GHB的濃度范圍在1.7～21.1 mg/mL之間[11]。由于陽(yáng)性的實(shí)際樣品難以獲取，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)加標(biāo)的方式配制模擬陽(yáng)性樣品。在適量飲料樣品中添加GHB標(biāo)準(zhǔn)品，使飲料中GHB的含量分別約為1000、2000和4000 μg/mL。對(duì)于刑事案件中的尿液樣品，Bosman等[15]報(bào)道在疑似藥物服用的不同案件中尿液樣品中GHB濃度范圍為14～2000 μg/mL。LeBeau等[16]也報(bào)道了一例疑似藥物輔助性犯罪（DFSA）案件中，尿液中GHB的濃度為308 μg/mL。采用在陰性尿液中添加GHB標(biāo)準(zhǔn)品的方式配制模擬陽(yáng)性尿液樣品，使尿液中GHB的含量約為200 μg/mL。按照2.3節(jié)的方法對(duì)上述配制的模擬樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單前處理后，進(jìn)行檢測(cè)。

稀釋后的模擬陽(yáng)性樣品測(cè)得的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4，測(cè)得的GHB濃度如表2所示。加標(biāo)回收率在80.8%～115.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～12.8%，表明本方法具有較好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。

4 結(jié) 論

本研究建立了一種飲料和尿液中快速篩查GHB的DART-MS方法，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單快速，操作方便，可對(duì)實(shí)際飲料樣品（水、碳酸飲料、啤酒）以及尿液中的GHB進(jìn)行快速篩查，且DART-MS儀器成本低，體積小。本方法可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，可為司法鑒定中涉及GHB的案件提供技術(shù)支持。

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