（商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院，河南商丘476000）

隨著消費(fèi)者膳食結(jié)構(gòu)的改變和安全意識(shí)的增強(qiáng)，動(dòng)物源性食品安全已經(jīng)成為全球共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題。近年來，我國(guó)肉雞養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展態(tài)勢(shì)迅猛，已然成為世界第二大肉雞生產(chǎn)國(guó)[1]，畜舍空氣質(zhì)量是保證肉雞養(yǎng)殖成功和保障雞肉品質(zhì)的關(guān)鍵[2]。然而，由于高密度、集約化的養(yǎng)殖模式，養(yǎng)殖環(huán)境特別是雞舍內(nèi)有害氣體對(duì)肉雞生產(chǎn)所帶來的危害亦愈發(fā)嚴(yán)重，其中，NH3被認(rèn)為是肉雞舍內(nèi)最有害的氣體[3-5]，直接刺激、損傷畜禽呼吸道，形成呼吸道炎癥，誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病，并引起其他并發(fā)癥。而且，據(jù)研究報(bào)道，長(zhǎng)時(shí)間低濃度的NH3刺激，會(huì)有助于病原微生物在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的定植[6]，損傷肉雞呼吸道上皮細(xì)胞，造成呼吸困難，降低免疫力，引發(fā)結(jié)膜炎和腹水癥，大大提高肉雞的死亡率和發(fā)病率，給肉雞養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3，7-8]。并且雞舍高濃度氨氣可降低雞的抗氧化能力，影響雞肉品質(zhì)，且隨著氨氣濃度的升高而逐漸增強(qiáng)，具有時(shí)間累加效應(yīng)[9]。

研究證明，養(yǎng)殖場(chǎng)的NH3通過刺激嗅覺神經(jīng)和三叉神經(jīng)，易引發(fā)慢性支氣管炎、高早產(chǎn)死亡率、哮喘疾病等，影響人畜的呼吸功能，危害人畜健康[10-11]，也是養(yǎng)殖場(chǎng)周邊環(huán)境空氣質(zhì)量PM2.5形成的主要原因之一[9，12]。呼吸道是一個(gè)開放性器官，是NH3進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體的門戶，而呼吸道正常菌群是抵御外來異物的第一道防線，對(duì)于動(dòng)物機(jī)體的免疫功能起著至關(guān)重要的作用。但是，迄今為止，對(duì)于NH3應(yīng)激條件下，由呼吸道微生態(tài)失衡而造成的雞源肉制品安全的相關(guān)研究還鮮見報(bào)道。

因此，本研究將于NH3應(yīng)激肉雞呼吸道中采集喉拭子，對(duì)呼吸道微生物進(jìn)行分離純化，探索畜舍空氣環(huán)境質(zhì)量對(duì)肉雞呼吸道微生態(tài)的影響，揭示NH3應(yīng)激條件下雞源肉食品的潛在安全風(fēng)險(xiǎn)及其實(shí)質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

將1日齡健康羅斯308肉雞公雛和母雛各10羽，置于密閉的環(huán)境控制倉(cāng)，內(nèi)置監(jiān)控?cái)z像頭可隨時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為變化，并安裝固定式氨氣氣體檢測(cè)儀FIX800-NH3-A（深圳市萬安迪科技有限公司）以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)舍內(nèi)氨氣濃度，舍內(nèi)氨氣濃度為60 mg/m3。試驗(yàn)為期42 d，自由采食。

1.1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑與儀器

λDNA/HindⅢ：生工生物工程（上海）股份有限公司；2000 DNAMarker：寶生物工程（大連）有限公司；2×Taq MasterMix：上海萊楓科技有限公司；脫脂奶粉：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：天津市縱橫工貿(mào)有限公司化工試劑公司；無水乙醇（分析純）：天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、氯化鈉（NaCl，分析純）：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷（trichloromethame，分析純）；異戊醇（分析純）：天津大茂化學(xué)試劑廠；三（羥甲基）氨基甲烷 [tris-（hydroymethyl）-aminomethane，分析純]：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

Telstar BIO IIA超凈工作臺(tái)：西班牙Telstar；Centrifuge 5424小型高速離心機(jī)、Centrifuge 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf；JY-SPCT凝膠電泳槽、JY600+雙恒定時(shí)電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；MLS-3750立式高壓滅菌器、MDF-4186S超低溫冰箱：日本SANYO；Gel Doc XR+凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad；Piko Real實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：美國(guó)Thermo Fisher Scientific；Direct-Q3超純水一體化系統(tǒng)：美國(guó)Millipore；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、ZHP-100智能恒溫震蕩培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與處理

用無菌棉拭子于咽后壁取樣，于無菌操作臺(tái)上將取樣后的棉拭子放入裝有5 mL無菌生理鹽水的10 mL離心管中，折斷手柄；震蕩離心管，用移液器吸取100 μL液體涂布胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基平板；將接過菌的平板置于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株分離與純化

利用平板劃線接種法進(jìn)行微生物分離。挑取平板上不同形態(tài)的菌落并在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基五點(diǎn)劃線后，將平板置于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h。重復(fù)上述操作直至平板上長(zhǎng)出單個(gè)菌落。挑取平板上單菌落于裝有MH肉湯培養(yǎng)基的試管內(nèi)，分別標(biāo)記TSB87001、TSB87002和TSB87003。

液體培養(yǎng)24 h后，用凍存管和離心管從每管菌液中各取約1.5 mL，1 000 g高速離心5 min，于超凈工作臺(tái)上倒掉上清，凍存管內(nèi)加入約1.5 mL的脫脂牛奶充分混勻后，放入-80℃冰箱內(nèi)進(jìn)行菌種保存。離心管內(nèi)的菌體凍存在-20℃，以備提取DNA。

1.3 微生物的分子鑒定

1.3.1 微生物DNA的提取

取出凍存在-20℃的菌體，向離心管內(nèi)加入500 μL 0.15 mol/L NaCl-檸檬酸鈉緩沖液重懸菌體，移至無菌研磨器中，仔細(xì)研磨10 min；1 mL NaCl-檸檬酸鈉緩沖液沖洗研磨杵上的菌體2次至研磨器中，將研磨器中的液體移至離心管中，用NaCl-檸檬酸鈉緩沖液沖洗研磨器2次每次1 mL，沖洗液移至離心管內(nèi)，6 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清；向沉淀中加入5 mL NaCl-檸檬酸鈉緩沖液，重懸沉淀；6 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清；再用5 mL NaCl-檸檬酸鈉緩沖液重懸沉淀，6 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清；用5 mL 0.15 mol/L NaCl-EDTA和1 mL 0.05 g/mL SDS重懸沉淀，并振蕩10 min；取4.5 mL至另一離心管中，加 4.5 mL 氯仿異戊醇（24∶1）振蕩 10 min，3 600 r/min，4℃離心10 min；取最上層水相加入等體積氯仿異戊醇，3 600 r/min，4℃離心10 min；取上清加入95%乙醇邊加邊搖動(dòng)至DNA析出或放入冰箱冷凍10 min～30 min，12 000 r/min，4℃離心 10 min；用 75%乙醇洗滌2次，置超凈工作臺(tái)中晾干；用50 μL 1×TE緩沖液或ddH2O溶解沉淀，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，分裝4 μL用于電泳檢測(cè)，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的選擇及PCR反應(yīng)

采用細(xì)菌 16S rRNA 基因通用引物：（27F）5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和（533R）5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由華大基因科技股份有限公司（北京）合成。

PCR 總體系為 25 μL，其中 12.5 μL 2× Taq Master Mix，基因組DNA為1 μL，正向和反向引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。于 94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳監(jiān)測(cè)

擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%的凝膠電泳檢測(cè)，電泳緩沖液1×TAE[三（羥甲基）氨基甲烷乙酸鹽乙二胺四乙酸緩沖液，tris acetate-EDTA buffer]，1 μL 上樣緩沖液與2 μL基因組DNA混合均勻點(diǎn)樣，同時(shí)點(diǎn)5 μL DL2 000 Marker作為參照，100 V電壓下電泳20 min，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并照相。

1.3.4 菌種鑒定

將含有目的條帶的PCR產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司（北京）測(cè)序。序列利用http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進(jìn)行比對(duì)，確定微生物種屬。如果兩條序列的相似性小于97%，就認(rèn)為是不同的序列類型[13-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果分析

將分離得到的3株菌提取基因組DNA后，用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F/533R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示，在約500 bp處，樣品TSB87001、TSB87002有目的條帶而樣品TSB87003沒有目的條帶，說明此樣品DNA中沒有所要的細(xì)菌DNA，因此，此樣品不再做進(jìn)一步研究。

2.2 菌種的分子鑒定

圖1 分離菌株的16S rRNA基因的PCR電泳結(jié)果Fig.1 The PCR electrophoresis results of the 16S rRNA gene of the isolated strains

選擇含有目的條帶的樣品TSB87001、TSB87002的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blastn序列比對(duì)，結(jié)果表明：菌株TSB87001和TSB87002分別與Cronobacter sakazakii（GenBank：HQ880345.1）和Vibrio cholerae（GenBank：JN873349.1）的相似性達(dá)到 97%，初步鑒定為阪崎腸桿菌和霍亂弧菌。

3 討論

畜舍空氣質(zhì)量是保證畜禽養(yǎng)殖成功和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要保證[2]。NH3是畜舍內(nèi)產(chǎn)生量最多、危害最大的有害氣體之一[18-19]，通過鼻腔進(jìn)入呼吸道，破壞心臟和氣管組織，造成繼發(fā)感染和破壞肌肉細(xì)胞膜的完整性，造成肉品質(zhì)下降[21-22]，同時(shí)給養(yǎng)殖工人和周邊環(huán)境帶來嚴(yán)重威脅。長(zhǎng)期生活于NH3環(huán)境中的畜禽對(duì)病原微生物的易感性增加，可引起呼吸道損傷[19]，誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病及其他并發(fā)癥，給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但是，由畜舍空氣環(huán)境質(zhì)量造成雞肉食品安全的具體研究還鮮見報(bào)道。

本研究將羅斯308肉雞飼養(yǎng)于一定濃度的NH3環(huán)境中，經(jīng)過稀釋平板法和借助分子生物學(xué)技術(shù)，從NH3應(yīng)激肉雞呼吸道中分離到了兩株致病菌阪崎腸桿菌和霍亂弧菌，研究結(jié)果為畜舍空氣質(zhì)量直接影響畜產(chǎn)品品質(zhì)及安全提供了直接的試驗(yàn)證據(jù)。阪崎腸桿菌是一種有周生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧的、人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在一定條件下可引起人和動(dòng)物致病[22-25]，該菌雖然從不同環(huán)境和食物樣品中都曾被檢測(cè)到，如奶粉、水、面包、香腸、蔬菜等[23]，但其在自然界的傳播渠道和污染來源尚不清楚。阪崎腸桿菌正是由于能夠形成菌毛結(jié)構(gòu)，除可幫助細(xì)菌浸染外，還使得阪崎腸桿菌非常容易黏附在各種表面?；魜y弧菌是引起雞霍亂的致病菌，引發(fā)雞出血性敗血癥，是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的一種急性敗血性傳染病，該病的死亡率很高，最急性病例幾乎看不到前驅(qū)癥狀而突然死亡。

畜舍空氣環(huán)境質(zhì)量不佳，特別是NH3濃度過高，除了會(huì)影響肉雞生長(zhǎng)性能和存活率之外，還會(huì)損傷氣管的免疫功能[19]，如雞舍中的NH3濃度達(dá)到50 mg/L時(shí)，引起呼吸道粘膜充血、水腫，發(fā)生支氣管炎、肺炎等[10]。而且，雞舍內(nèi)的NH3會(huì)影響肉雞的免疫功能，降低特異性抗體滴度和提高疾病易感性[8]，給肉雞養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失。但是，就目前為止，由畜舍空氣質(zhì)量直接影響畜產(chǎn)品品質(zhì)及其質(zhì)量安全的研究還很少見到報(bào)道，而本研究的結(jié)果為此直接提供了試驗(yàn)證據(jù)。并且，進(jìn)一步驗(yàn)證了前人研究成果，即畜禽在NH3應(yīng)激條件下，病原微生物容易侵入動(dòng)物機(jī)體，增加了動(dòng)物源性食品安全問題的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究結(jié)果將加強(qiáng)畜牧工作者改善畜舍空氣質(zhì)量以保障肉雞的生態(tài)養(yǎng)殖和健康可持續(xù)發(fā)展的決心，及為人民提供安全、綠色的動(dòng)物源性肉制品奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在動(dòng)物的生命和提供畜產(chǎn)品的生產(chǎn)活動(dòng)中，除了遺傳、營(yíng)養(yǎng)、疫病防治外，環(huán)境因素也是重要的一環(huán)。環(huán)境因素會(huì)直接或間接影響畜禽養(yǎng)殖業(yè)，本研究從微生態(tài)角度入手，研究畜舍內(nèi)空氣環(huán)境質(zhì)量對(duì)肉雞呼吸道微生物的影響，研究結(jié)果證明了在高濃度NH3環(huán)境中，病原微生物會(huì)更容易定制于肉雞機(jī)體內(nèi)，從而揭示了畜舍空氣質(zhì)量引發(fā)雞源肉食品的潛在安全風(fēng)險(xiǎn)及其機(jī)制。

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