李承穎，王寶維，，*，秦鵬飛，葛文華，張名愛，，岳斌，陳海華

（1.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東青島266109；2.國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系營養(yǎng)與飼料功能研究室，山東青島266109）

鵝肥肝有著較多人體需要的卵磷脂、三酰甘油、不飽和脂肪酸和各類微量元素，其中人體所需不飽和脂肪酸占其總脂肪酸含量的65%～68%[1-3]，可以起到降血脂、延緩衰老、軟化血管的效果。鵝油中75.7%[4]為必需脂肪酸，包括無法由自身合成的亞油酸[5]，與植物油相似，熔點低、易吸收，不僅與普通食用油在口感、外觀等方面有相似性狀[6]，且具有減少體內(nèi)脂肪堆積、預防高血脂等相關(guān)疾病的功能[7-8]，王偉偉等[9]研究發(fā)現(xiàn)鵝肥肝對大鼠高脂血癥具有修復作用。所以，研究鵝肥肝油的提取方法與產(chǎn)品性質(zhì)意義非凡。當前，針對鵝油進行的研究屈指可數(shù)。張佰帥等[10]研究表明粗鵝油的最佳提取溫度為60℃。侯杰等[11]采用超聲波輔助法提取鵝肥肝油，最佳條件下鵝肥肝油收率為67.44%。隋明等[12]采用5種方法對鵝油進行提取，結(jié)果表明：烘箱提取法最佳工藝下所提取的鵝油無雜質(zhì)、色澤佳、穩(wěn)定性好、出油率較高。目前，國內(nèi)外對鵝油提取方法、性質(zhì)報道研究較少，傳統(tǒng)化學提取法有溶劑殘留、提取率低、時間長、操作復雜等缺點。為此，創(chuàng)建一種省時、低耗、低成本、低排放的鵝油提取方法迫在眉睫。本研究將酶解、離心兩種技術(shù)有機結(jié)合用于鵝肥肝油的提取，酶解法是利用酶對蛋白質(zhì)水解，使蛋白質(zhì)不與脂肪結(jié)合，從而分離出油脂的一種提取方法，本試驗利用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝，旨在創(chuàng)建一種效率快、高品質(zhì)、提油率高的新工藝，為鵝肥肝深度開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鵝肥肝：山東濰坊銀河潤雁鵝業(yè)有限公司；檸檬酸（分析純）：天津惠瑞化工科技有限公司；磷酸氫二鉀（分析純）：天津市巴斯夫化工有限公司；酸性蛋白酶（≥50 u/mg）、中性蛋白酶（100 u/mg）、堿性蛋白酶（200 u/mg）、木瓜蛋白酶（≥800 u/mg）、菠蘿蛋白酶（≥300 u/mg）：上海瑞永生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1型高速組織搗碎機：上海標本模型廠；多參數(shù)測試儀：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；H2050R型冷凍離心機：長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；SY-1000E超聲波提取儀：北京弘祥隆生物技術(shù)股份有限公司；E-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；500MHz超導核磁共振波譜儀：瑞士布魯克公司。

1.3 方法與設(shè)計

1.3.1 酶解離心法提取鵝肥肝油

1.3.1.1 鵝肥肝勻漿液

將鵝肥肝斬拌，用組織搗碎機完全搗碎呈漿狀，再用保鮮袋分裝，并置于-18℃以下的冰箱或冷庫內(nèi)保存待用。

1.3.1.2 蛋白酶緩沖液

把蛋白酶溶于pH 3.5～8.5的0.1 mol/L～0.2 mol/L磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖液中。

1.3.1.3 酶解

把蛋白酶緩沖液與鵝肥肝勻漿液混合，在40℃～65℃進行酶解3.5 h～5.5 h。

1.3.1.4 離心取油

把酶解液于7 500 r/min～14 500 r/min速率下離心10 min～30 min，上層清油即為鵝肥肝油。

1.3.2 鵝肥肝油提取率計算公式

1.3.3 酶解離心法提取鵝肥肝油的單因素試驗設(shè)計

以鵝肥肝油提取率為考察指標，確定酶解工藝條件，分別對蛋白酶種類、緩沖液pH值、酶解溫度、酶解時間、離心速率、離心時間6個影響因素進行研究，分別針對蛋白酶種類：酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶5種類型；緩沖液pH值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，5 個水平）。酶解溫度（45、50、55、60、65 ℃，5 個水平）；酶解時間（3.5、4、4.5、5、5.5 h，5個水平）；離心速率（8 500、10 000、11 500、13 000、14 500 r/min，5 個水平）；離心時間（10、15、20、25、30 min，5個水平）進行單因素試驗，確定各影響因素的適宜值。

1.3.4 酶解離心法提取鵝肥肝油的響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，以鵝肥肝油提取率為考察指標，綜合單因素試驗結(jié)果選擇離心速率、時間、緩沖液pH值設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，獲得酶解離心法提取鵝肥肝油的最適工藝條件，響應(yīng)面因素水平編碼表如表1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factor level table of response surface

1.3.5 鵝肥肝油脂肪酸含量的測定

前處理方法：稱取鵝肥肝油樣品2 mg，加入1.5 mL正己烷、40 μL 乙酸乙酯、100 μL NaOCH3/CH3OH 后室溫條件下甲基化20 min，靜置10 min于冷凍箱，取出后迅速加入60 μL草酸，離心去沉淀，為吸附其中水分將溶液通過無水Na2SO4層。使用FID檢測器、CPSi188熔融石英毛細管柱氣相色譜柱進行Agilent 7890A氣相色譜分析。

測定條件：進樣口溫度250℃，進樣量1.0 μL，壓力128.226 kPa，不分流。載氣為氮氣，柱壓128.22 kPa。采用程序升溫，起始溫度50℃，保持此溫度1 min；以25℃/min升至200℃，保持0 min；再以3℃/min升至230℃，保持6 min。FID檢測器280℃，燃氣為氫氣、空氣，流速分別為40、450 mL/min；助燃氣為空氣，流速為30 mL/min。

1.3.6 不同鵝肥肝油提取方法的比較

1.3.6.1 鵝肥肝油提取方法

1）酶解離心法：按照本試驗中響應(yīng)面所得最佳工藝條件提取鵝肥肝油。

2）溶劑浸提法：用脫脂棉包好準確稱量的鵝肥肝，石油醚作為提取劑，提取時間為5 h；提取溫度為35℃，利用索氏提取裝置抽提，完成后將接收瓶中石油醚-油脂混合物進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去石油醚，獲得鵝肥肝油。

3）超聲波提取法：根據(jù) 1 ∶5（g/mL）料液比將鵝肥肝和提取劑放在超聲波提取儀處理杯中并攪拌均勻，然后在超聲波功率400 W、提取時間11 min、提取溫度35℃下進行超聲波提取[11]，結(jié)束后將提取液離心取上清液過濾，再進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去提取劑，干燥得到鵝肥肝油。

1.3.6.2 鵝肥肝油的理化性質(zhì)測定

酸價、過氧化值、皂化值、碘值分別參考GB 5009.229-2016《食品安全國家標準食品中酸價的測定》、GB 5009.227-2016《食品安全國家標準食品中過氧化值的測定》、GB/T 5534-2008《動植物油脂皂化值的測定》、GB/T 5532-2008《動植物油脂碘值的測定》。

1.3.6.3 鵝肥肝油的1H-NMR分析

1H-NMR分析使用500 MHz超導核磁共振波譜儀，將油脂溶解在CDCl3中進行氫譜分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

各項指標均重復3次并取均值，Excel建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 22.0進行數(shù)理統(tǒng)計，通過多重比較（LSD）檢驗各處理平均數(shù)之間的差異顯著性，Design expert 7.0軟件進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解離心法提取鵝肥肝油單因素試驗結(jié)果

各因素對酶解離心提取鵝肥肝油率的影響見圖1。

圖1 各因素對酶解離心提取鵝肥肝油率的影響Fig.1 Effect of various factors on enzymatic extraction of fatty liver oil in goose

由圖（a）可知，酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶5種蛋白酶（各種酶的最佳酶解條件下）對鵝肥肝油的提取率均高于63%，且使用堿性蛋白酶提取鵝肥肝油得率最高。因此，選擇堿性蛋白酶。

由圖（b）可知，隨著緩沖液pH值逐漸增大，鵝肥肝油提取率先顯著增加（P＜0.05）后減小。當pH值為9.0時，鵝肥肝油提取率最大。這可能是因為堿性蛋白酶在pH 9.0時酶活最高，使得其與底物的結(jié)合程度最好，提取率最高。因此，最佳緩沖液pH值選擇9.0。

由圖（c）可知，鵝肥肝油提取率隨酶解溫度的增加先升高后略有下降，當溫度達到60℃時，提取率最大。說明酶解溫度的升高可加大酶活，使鵝肥肝中的脂類復合物更多的降解，提高提取率，但過高的溫度會使酶活降低甚至失活，影響酶解反應(yīng)。因此，最佳酶解溫度選擇60℃。

由圖（d）可知，在3 h～3.5 h提取過程中，隨著酶解時間的延長，鵝肥肝細胞逐漸被破壞，酶與底物充分反應(yīng)，油脂提取率不斷提高，在3.5 h之后，隨著時間延長提取率變化不顯著（P＞0.05）。這可能是因為酶與底物作用時間的延長會增加酶解的充分性，當?shù)孜锉幻附馔耆珪r，提取率將不再隨著酶解時間的延長而顯著增長[13]。因此，最佳酶解時間選擇3.5 h。

由圖（e）可知，加快離心速率鵝肥肝油提取率也隨之提高，當離心速率達到11 500 r/min時，提取率隨著離心速率的升高而趨于平穩(wěn)。這可能是由于增大離心速率，利于鵝肥肝中蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)發(fā)生沉淀，使得較多油脂得以分離。因此，最佳離心速率選擇11 500 r/min。

由圖（f）可知，隨著離心時間的延長，鵝肥肝油提取率不斷提高，當離心20 min時，再延長時間提取率也處于平穩(wěn)狀態(tài)。這可能是因為隨著時間延長大分子物質(zhì)的沉淀數(shù)量也隨之增加，當沉淀完全時，提取率將不再隨離心時間的延長而增加。因此，最佳離心時間選擇20 min。

通過單因素初步篩選得到酶解離心提取工藝的優(yōu)選參數(shù)為：①蛋白酶種類為堿性蛋白酶；②緩沖液pH值為9.0；③酶解過程：酶解溫度60℃、時間3.5 h；④離心過程：離心速率11 500 r/min、時間20 min。

2.2 方差分析酶解離心法提取鵝肥肝油單因素試驗結(jié)果

2.2.1 蛋白酶種類對鵝肥肝油提取率的影響結(jié)果

蛋白酶種類對鵝肥肝油提取率單因素方差分析結(jié)果見表2。

表2 蛋白酶種類對鵝肥肝油提取率的影響Table 2 Effect of protease type on extraction rate of goose liver oil

根據(jù)表2 的方差分析結(jié)果，F(xiàn)＜F0.05，即 P＞0.05，表明蛋白酶種類對鵝肥肝油提取率的影響不顯著。

2.2.2 緩沖液pH值對鵝肥肝油提取率的影響結(jié)果

緩沖液pH值對鵝肥肝油提取率單因素方差分析結(jié)果見表3。

表3 緩沖液pH值對鵝肥肝油提取率單因素方差分析Table 3 Single factor analysis of variance in extraction rate of goose liver oil by buffer pH

根據(jù)表3 的方差分析結(jié)果，F(xiàn)＞F0.01，即 P＜0.01，表明緩沖液pH值對鵝肥肝油提取率的影響極顯著。為了比較各水平間影響的差異程度，進行（LSD）檢驗，結(jié)果見表4。

表4 Fisher LSD多重比較結(jié)果Table 4 Fisher LSD multiple comparison results

根據(jù)表4多重比較結(jié)果，緩沖液pH 7.5和9.0、9.5之間以及pH 8.0和9.0之間對鵝肥肝油提取率的影響差異極顯著；pH 8.0和9.5之間以及pH 8.5和9.0之間對鵝肥肝油提取率的影響差異顯著。

2.2.3 酶解溫度對鵝肥肝油提取率的影響結(jié)果

酶解溫度對鵝肥肝油提取率單因素方差分析結(jié)果見表5。

根據(jù)表5 的方差分析結(jié)果，F(xiàn)＜F0.05，即 P＞0.05，表明酶解溫度對鵝肥肝油提取率的影響不顯著。

表5 酶解溫度對鵝肥肝油提取率單因素方差分析Table 5 Single factor analysis of variance in extraction rate of goose liver oil by enzymolysis temperature

2.2.4 酶解時間對鵝肥肝油提取率的影響結(jié)果

酶解時間對鵝肥肝油提取率單因素方差分析結(jié)果見表6。

表6 酶解時間對鵝肥肝油提取率單因素方差分析Table 6 Single factor analysis of variance in extraction rate of goose liver oil by enzymolysis time

根據(jù)表6 的方差分析結(jié)果，F(xiàn)＜F0.05，即 P＞0.05，表明酶解時間對鵝肥肝油提取率的影響不顯著。

2.2.5 離心速率對鵝肥肝油提取率的影響結(jié)果

離心速率對鵝肥肝油提取率單因素方差分析結(jié)果見表7。

表7 離心速率對鵝肥肝油提取率單因素方差分析Table 7 Single factor analysis of variance in extraction rate of goose liver oil by centrifugal speed rate

根據(jù)表7 的方差分析結(jié)果，F(xiàn)＞F0.01，即 P＜0.01，表明離心速率對鵝肥肝油提取率的影響極顯著。為了比較各水平之間影響的差異程度，進行LSD檢驗，結(jié)果見表8。

表8 Fisher LSD多重比較結(jié)果Table 8 Fisher LSD multiple comparison results

根據(jù)表8多重比較結(jié)果，離心速率8 500 r/min和 10 000 r/min之間、10 000 r/min和 11 500 r/min、10000r/min和 13 000 r/min、10 000 r/min和 14 500 r/min之間對鵝肥肝油提取率的影響差異顯著；離心速率8 500 r/min和 11 500 r/min、8 500 r/min和 13 000 r/min、8 500 r/min和14 500 r/min之間對鵝肥肝油提取率的影響差異極顯著。

2.2.6 離心時間對鵝肥肝油提取率的影響結(jié)果

離心時間對鵝肥肝油提取率單因素方差分析結(jié)果見表9。

表9 離心時間對鵝肥肝油提取率單因素方差分析速率Table 9 Single factor analysis of variance in extraction rate of goose liver oil by centrifugal time

根據(jù)表9 的方差分析結(jié)果，F(xiàn)0.05＜F＜F0.01，即 0.01＜P＜0.05，表明離心速率對鵝肥肝油提取率的影響顯著。為了比較各水平之間影響的差異程度，進行（LSD）檢驗，結(jié)果見表10。

表10 Fisher LSD多重比較結(jié)果Table 10 Fisher LSD multiple comparison results

根據(jù)表10多重比較結(jié)果，離心時間10 min和30 min之間對鵝肥肝油提取率的影響差異極顯著；離心時間15 min和30 min之間對鵝肥肝油提取率的影響差異顯著。

2.3 酶解離心法提取鵝肥肝油響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表11。

表11 響應(yīng)面試驗設(shè)計及其結(jié)果Table 11 Response surface test design and its results

續(xù)表11 響應(yīng)面試驗設(shè)計及其結(jié)果Continue table 11 Response surface test design and its results

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

以離心時間、速率、pH值為影響因素，鵝肥肝油提取率為響應(yīng)值的線性回歸方程如下：Y=53.76+1.59A+5.60B+2.66C+1.59AB-0.29AC+3.30BC-1.08A2-6.54B2-2.28C2。

2.3.3 方差分析響應(yīng)面試驗結(jié)果

以上響應(yīng)面試驗回歸方程的方差分析結(jié)果見表12。

表12 響應(yīng)面試驗回歸方程方差分析Table 12 Response surface test regression equation variance analysis

由表可知，方差分析模型Pr（P）＞F值＜0.01時模型極顯著，擬合精度好意味著可使用該響應(yīng)面近似模型做近一步優(yōu)化設(shè)計；失擬項Pr＞F值＞0.05意味著不顯著，換言之此模型在被研究的整個回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好。

一次項對試驗影響排序為B＞C＞A，即離心時間＞緩沖液pH值＞離心速率，其中離心時間對試驗影響極顯著（P＜0.01），緩沖液pH值和離心速率對試驗影響顯著（P＜0.05）。交互項中AB和BC顯著性較好，說明離心速率和離心時間，離心時間和緩沖液pH值的相互作用對鵝肥肝油的提取率影響較大。

經(jīng)Design-Expert軟件分析，酶解離心提取工藝的優(yōu)選參數(shù)為：蛋白酶種類為堿性蛋白酶；緩沖液pH值為8.5；酶解溫度60℃、時間3.5 h；離心速率14 500 r/min、時間30 min。此條件下，鵝肥肝油提取率為58.57%，按照GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》中酸水解法測定鵝肥肝中總脂肪，其占比為59.01%，即鵝肥肝油實際提取率為99.25%。

2.3.4 響應(yīng)面試驗的響應(yīng)曲面和等高線圖

利用二次方程模型分別做出試驗因素間交互作用的三維立體響應(yīng)曲面和等高線圖，分析某個因素固定在中心值不變情況下，其他兩個因素的交互作用對鵝肥肝油提取率的影響（見圖2～圖4），等高線形狀為橢圓形表示因素的交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。

圖2 離心速率和離心時間對鵝肥肝油提取率的交互影響Fig.2 Interaction of centrifugal rate and centrifugal time on extraction rate of goose fat liver oil

圖3 離心速率和緩沖液pH值對鵝肥肝油提取率的交互影響Fig.3 Effects of centrifugation rate and buffer pH on the extraction rate of goose fat liver oil

圖4 離心時間和緩沖液pH值對鵝肥肝油提取率的交互影響Fig.4 Effect of centrifugal time and buffer pH on the extraction rate of goose fat liver oil

從圖2等高線圖可以看出，在緩沖液pH值不變條件下，離心速率與離心時間交互作用顯著。從三維立體圖中看出，鵝肥肝油提取率在合適的離心速率和離心時間下，具有最大值，該極大值出現(xiàn)在較高的離心速率（13 625 r/min～14 500 r/min）范圍內(nèi)，較高的離心時間（25 min～30 min）范圍內(nèi)。

從圖3等高線圖可以看出，在離心時間不變條件下，離心速率與緩沖液pH值交互作用顯著，從三維立體圖中看出，增大離心速率與緩沖液pH值有助于提高鵝肥肝油提取率，鵝肥肝油提取率存在極大點，該極點出現(xiàn)在較高的離心速率（13 625 r/min～14 500 r/min）范圍內(nèi)，較高的緩沖液pH（8.00～8.50）范圍內(nèi)。

從圖4等高線圖可以看出，離心速率不變的情況下，離心時間與緩沖液pH值兩者交互作用顯著。由三維立體圖可見，鵝肥肝油提取率存在極大點，離心時間在25 min至30 min范圍內(nèi)、緩沖液pH值從8.00提高至8.50時，鵝肥肝油提取率增加。

2.4 鵝肥肝油中脂肪酸含量測定結(jié)果

標準品脂肪酸圖見圖5，鵝肥肝油脂脂肪酸圖見圖6，鵝肥肝油中脂肪酸成分見表13。

圖5 標準品脂肪酸圖Fig.5 Standard fatty acid diagram

圖6 鵝肥肝油脂脂肪酸圖Fig.6 Fatty acid diagram of goose liver fatty acid

由圖5、圖6和表13得出，鵝肥肝油不飽和脂肪酸居多，高于71%，其中肉豆蔻酸（C14：0）0.83%、亞油酸（C18：2）1.50%、棕櫚烯酸（C16：1）4.25%、棕櫚酸（C16：0）25.08%、油酸（C18：1）56.28%；飽和脂肪酸以11.78%的硬脂酸為主。

表13 鵝肥肝油中脂肪酸成分Table 13 Fatty acid composition in goose liver oil

2.5 不同鵝肥肝油提取方法的比較

2.5.1 鵝肥肝油的理化性質(zhì)比較

不同的提取方法對鵝肥肝油的理化性質(zhì)存在著影響，鵝肥肝油中脂肪酸成分見表14。

從表14中可以看出，提取的鵝肥肝油酸價、過氧化值、皂化值以及碘值的大小順序為：溶劑浸提法＞超聲波提取法＞酶解離心提取法。這可能是由于溶劑浸提法和超聲波法均需較長時間高溫浸提回流，使所獲得的鵝肥肝油發(fā)生了氧化。由此得出，酶解離心法提油條件溫和，未經(jīng)長時間有機溶劑處理，較完整保留了鵝肥肝油本身天然活性成分，并在保證油脂安全性的同時獲得更高的品質(zhì)。

表14 鵝肥肝油中脂肪酸成分Table 14 Fatty acid composition in goose liver oil

2.5.2 鵝肥肝油的1H-NMR的比較結(jié)果與分析

鵝肥肝油1H-NMR波譜中各信號峰的歸屬見表15，不同方法提取鵝肥肝油的核磁共振氫譜分析見表16，鵝肥肝油的核磁共振氫譜見圖7。

表15 鵝肥肝油1H-NMR波譜中各信號峰的歸屬Table 15 The signal peak of goose liver oil1H-NMR spectroscopy in attribution

表16 不同方法提取鵝肥肝油的核磁共振氫譜分析Table 16 Nuclear magnetic resonance spectroscopy analysis of goose liver oil by different methods

由圖（a）表明，在 0～5.5（1/106）處出現(xiàn)了 9 個信號峰，圖（b）和（c）中出現(xiàn)了 10個信號峰，7.26×10-6處為氘代氯仿的溶劑峰，這些信號峰主要由鵝肥肝油中的甘油三酯的不同結(jié)構(gòu)中的H質(zhì)子產(chǎn)生，其峰值的高低與相應(yīng)化學環(huán)境下H質(zhì)子的含量有關(guān)。油脂在熱氧化過程中產(chǎn)生諸如醛類化合物、過氧化物、芳香烴等氧化產(chǎn)物直接影響了信號峰的高低。

在溶劑浸提法和超聲波提取法的高溫提取過程中，由于所提鵝肥肝油發(fā)生了熱氧化反應(yīng)，結(jié)果顯示：烯族類（不飽和雙鍵）、二烯丙基、烯丙基的信號峰幅值比酶解離心法低；飽和脂肪酸所連的甲基峰值比酶解離心法高；油脂中烯質(zhì)子、烯丙基亞甲基質(zhì)子和烯丙基次甲基質(zhì)子的百分含量的順序為溶劑浸提＞超聲波提取＞酶解離心；并且隨著油脂氧化程度的加劇，脂肪酸組成也發(fā)生了一定變化。表明，酶解離心法提取工藝未經(jīng)過高溫浸提，有效避免了所提取的鵝肥肝油發(fā)生熱氧化反應(yīng)，所提取的鵝肥肝油質(zhì)量更優(yōu)。

圖7 鵝肥肝油的核磁共振氫譜Fig.7 Nuclear magnetic resonance spectroscopy of goose fat liver oil

3 討論

3.1 蛋白酶種類對酶解離心提取鵝肥肝油的影響

黃萬有等[14]研究了胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶4種蛋白酶對軍曹魚內(nèi)臟魚油提取的影響，胰蛋白酶作用下提取率高于其他酶的作用，胰蛋白酶屬于中性蛋白酶，但價格較貴。此外各種蛋白酶都有用于提取其他動物油脂的研究報道，且根據(jù)原料的不同所采用的蛋白酶各有差異，油脂的提取率也不同。本文考慮到成本、工藝條件及操作難易程度，選用堿性蛋白酶進行提取研究。

3.2 酶解溫度對酶解離心提取鵝肥肝油的影響

酶是特定的蛋白質(zhì)，溫度過高，會使得酶失活而使反應(yīng)不能正常進行；溫度過低會導致酶活降低，酶解反應(yīng)不充分，因此只有在特定溫度下，才能保持其最佳活性。華娣[15]采用水酶法從花生中提取油和水解蛋白進行了研究，結(jié)果表明，確定的堿性蛋白酶最佳酶解溫度為60℃，與本試驗酶解溫度單因素篩選結(jié)果一致。但范東方[16]以油莎豆為原料，對水酶法提取油莎豆油進行工藝優(yōu)化研究時，堿性蛋白酶最佳酶解溫度為50℃。由此得出，蛋白酶最佳反應(yīng)溫度的不同，可能與結(jié)合的底物種類有關(guān)。

3.3 不同鵝肥肝油提取方法效果比較

侯杰等[11]使用石油醚對鵝肥肝油進行超聲波提取，最優(yōu)提取率為67.44%；使用傳統(tǒng)的溶劑法提取率為99.05%；本研究使用堿性蛋白酶進行酶解提油，獲得99.25%的提取率，高于前兩種提取方法，且以酶解離心法所獲得的鵝肥肝油品質(zhì)最好。

本研究結(jié)果顯示，溶劑浸提法獲得的鵝肥肝油酸值最高，原因是長時間加熱，使得油脂中產(chǎn)生的過氧化物進一步分解成酸、醛等小分子物質(zhì)，導致油脂酸值增加、過氧化值較?。磺掖朔椒ㄈ菀自斐扇軇埩?，不僅破壞油脂風味，同時存在安全風險。超聲波法是將有機溶劑與超聲波儀有機結(jié)合的一種方法，此方法在提取鵝肥肝油成本較高，不利于鵝肥肝油的工業(yè)化生產(chǎn)。酶解離心法通過使用蛋白酶對鵝肥肝中蛋白質(zhì)進行水解并破壞蛋白質(zhì)和脂肪的結(jié)合，使細胞內(nèi)油脂等細胞內(nèi)容物充分快速釋放，此工藝溫度較低，有效防止不飽和脂肪酸的氧化，能夠最大程度保持油脂的原有性質(zhì)與活性，并且采用了高速離心將油脂快速析出，大大提高了生產(chǎn)效率，降低了能量消耗；此外，酶解過程中適宜的溫度和時間又使鵝肝油得到了巴氏消毒，符合鵝肝油高端保健食品衛(wèi)生要求。

4 結(jié)論

由于酶解離心法能夠有效防止不飽和脂肪酸的氧化，較好保持油脂的活性，效率高，能耗低，所以符合產(chǎn)品衛(wèi)生要求。

酶解離心法提取鵝肝油最佳工藝為：蛋白酶種類為堿性蛋白酶；緩沖液pH 8.5；酶解溫度60℃、時間3.5 h；離心速率14 500 r/min、時間30 min。此條件下，鵝肥肝油提取率為99.25%，大大提高了產(chǎn)品得率。

[1]孫振國,劉文青.鵝肥肝產(chǎn)量和品質(zhì)的影響因素[J].養(yǎng)殖與飼料,2010(11):15-18

[2]鄭建,林松毅,徐彩娜,等.鵝肥肝中重要物質(zhì)測定及卵磷脂提取[J].食品科學,2007,28(11):267-270

[3]張鳳清,徐永苗.復配天然抗氧化劑對鵝肥肝抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(3):111-112

[4]Christie W W.Lipid Analysis Oxford[M].Oxford:Pergamon Press,1998

[5]張磊,徐桂花,杜志明,等.淺議江西發(fā)展鵝肥肝產(chǎn)業(yè)的對策[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志,2010(1):7-9

[6]Morita O,Soni MG.Safety assessment of diacylglycerol oil as an edible oil:a review of the published literature[J].Food and Chemical Toxicology,2009,47(1):9-21

[7]Taguchi H,Watanabe H,Onizawa K.et al.Energy value and digestibility of dietary oil containing mainly 1,3-diacylglycerol are similar to those of triacylglycerol[J].Lipids,2001,36(4):379-382

[8]Meng XH,Zou DY,Shi ZP,et al.Dietary diacylglycerol prevents high-fat diet-induced lipid accumulation in rat liver and abdominal adipose tissue[J].Lipids,2004,39(1):37-41

[9]王偉偉,王寶維,耿欣,等.富硒鵝肥肝對大鼠高脂血癥的修復研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2011,44(5):1029-1039

[10]張佰帥.鵝油精煉加工工藝及功能性研究[D].青島:青島農(nóng)業(yè)大學,2012

[11]侯杰.超聲波輔助法提取鵝肥肝油工藝的研究[J].中國糧油學報,2013,28(9):75-81

[12]隋明.鵝油提取及理化指標分析[J].糧食與油脂,2016,29(3):42-45

[13]石迪,郝劍君,楊小克,等.微堿條件生物酶法提取魷魚油工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(2):277-281

[14]黃萬有,李德濤,屈小娟,等.人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化軍曹魚內(nèi)臟魚油酶法提取工藝參數(shù)[J].食品工業(yè)科技,2013(7):173-177

[15]華娣.水酶法從花生中提取油與水解蛋白的研究[D].無錫:江南大學,2007

[16]范東方.超聲波輔助水酶法提取油莎豆油的研究[D].福州:福建農(nóng)林大學,2013