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        黃秋葵花提取物不同極性部位抗氧化活性的研究

        2018-05-30 09:34:35郭溆李文剛田碩曹宏杰王維婷劉超程安瑋王新坤孫金月
        食品研究與開發(fā) 2018年10期
        關(guān)鍵詞:黃秋葵超氧水相

        郭溆,李文剛,田碩,曹宏杰,王維婷,劉超,程安瑋,王新坤,孫金月,*

        (1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南250100;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地服務(wù)中心,山東濟(jì)南250100;3.濟(jì)南市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心,山東濟(jì)南250000)

        黃秋葵(Abelmoschus esculentus L.)屬于錦葵科(Malvaceae)秋葵屬(Abelmoschus Medic)一年生草本植物,是一種具有較高營養(yǎng)價(jià)值的新型保健蔬菜,抗疲勞效果佳[1]。自引入我國后,在山東、浙江、福建、江西、廣州、北京等多省市種植,選種的品種也較多。黃秋葵的花具有花期短、產(chǎn)量大的特點(diǎn),因此具有很強(qiáng)的開發(fā)應(yīng)用潛能,現(xiàn)在已經(jīng)有大量的黃秋葵花茶在售,市場前景較好。

        自由基與活性氧是機(jī)體在正常有氧呼吸過程中產(chǎn)生的物質(zhì),若不及時(shí)清理,就會破壞人體內(nèi)的動態(tài)平衡,使人體處于氧化應(yīng)激狀態(tài),易引發(fā)疾病與衰老[2]。開發(fā)自由基清除劑和抗氧化劑已經(jīng)受到了人們的重視,但化學(xué)合成抗氧化劑因具有潛在的毒、副作用,因此從植物中尋找天然抗氧化劑已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[3]。黃秋葵花中富含黃酮、多酚、多糖、氨基酸等多種物質(zhì)[4],其中黃酮和多酚類化合物是植物抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[5-6]。目前對黃秋葵抗氧化活性的研究主要集中在果實(shí)中,對黃秋葵花的研究還很少。李孟秋等實(shí)驗(yàn)證明黃秋葵花水提物的抗氧化活性較好[7]。本研究以黃秋葵花乙醇提取物為研究對象,采用萃取法將黃秋葵花乙醇提取物分為乙酸乙酯相和水相兩個(gè)部位,對兩個(gè)不同極性部位中的總酚和黃酮含量進(jìn)行了測定,并分別對其抗氧化活性進(jìn)行分析,為黃秋葵花的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù),也為天然抗氧化劑和功能性食品開發(fā)提供新的資源。

        1 材料與方法

        1.1 原料

        黃秋葵品種卡里巴:2016年春播種于山東省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品研究所章丘龍山試驗(yàn)基地,采集其盛開的花器官作為試驗(yàn)材料,經(jīng)干燥脫水后,粉碎過80目篩,置常溫干燥處備用;采用有機(jī)溶劑萃取法將黃秋葵花乙醇提取物分為乙酸乙酯相和水相部位。

        1.2 試劑與儀器

        蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):上海源葉生物科技有限公司;鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸鹽緩沖液(pH6.6)、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、乙醇、Tris-HCl-EDTA緩沖液、鄰苯三酚:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        UV-1800型紫外分光光度計(jì):日本島津公司;FE20K型臺式酸度計(jì):美國梅特勒-托利多公司;AR423CN型電子天平:美國奧豪斯公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋:上海精宏公司;Allegra 25R型高效冷凍離心機(jī):美國貝克曼公司。

        1.3 方法

        1.3.1 黃秋葵花不同極性溶劑提取物制備

        在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶50(g/mL)、溫度60℃條件提取1 h,提取2次,過濾;將濾液低壓濃縮至膏狀物質(zhì),取部分冷凍干燥,得到醇提物干樣;加入定量的水將上述剩余的膏狀物質(zhì)溶解后,充分搖勻,轉(zhuǎn)入分液漏斗中。用乙酸乙酯進(jìn)行萃取3次,得到乙酸乙酯部位和水提部位的萃取物。將各組萃取物減壓濃縮后,真空冷凍干燥至恒質(zhì)量,密封置于冰箱冷藏備用。

        1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

        采用Al(NO3)3法測定[8]。準(zhǔn)確稱取經(jīng)120℃烘干至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1 g,80%乙醇溶解后定容至100 mL,搖勻,得0.5 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、1、2、3、4、5、6 mL,各加 80%乙醇溶液至10 mL,再加入0.7 mL 5%亞硝酸鈉溶液,搖勻,避光靜置反應(yīng)6 min后,加入0.7mL的10%硝酸鋁,搖勻,靜置6 min,加入5.0 mL的4%氫氧化鈉,用25%乙醇定容至25 mL后搖勻放置15 min后,于波長510 nm處測定其吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)方程Y=1.410 6x+0.007 3,R2=0.997 6。式中:Y為吸光度;x為黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL。

        1.3.3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

        采用Folin-Ciocalteu方法測定[9]。準(zhǔn)確稱取經(jīng)120℃烘干至恒質(zhì)量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g,80%乙醇溶解定容至50 mL,得到1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 1、2、3、4、5 mL,各加80%乙醇溶液至10 mL,各吸取200 μL后加入1.0 mL蒸餾水、福林酚試劑0.2 mL混勻,靜置3 min后,加入7.5%碳酸鈉溶液0.6 mL后混勻,室溫靜置40 min后,于波長765 nm下測定器吸光值。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)方程Y=2.151x-0.032 6,R2=0.992 5。式中:Y為吸光度;x為多酚質(zhì)量濃度,mg/mL。

        1.3.4 黃秋葵花不同極性部位中總黃酮、多酚含量測定

        準(zhǔn)確稱取黃秋葵花萃取物0.01 g,溶于10 mL 80%乙醇中,配制成1 mg/mL溶液,代入到各標(biāo)準(zhǔn)曲線中,測定萃取物中總黃酮、多酚含量。

        1.3.5 還原力的測定

        將水相和乙酸乙酯相分別稀釋為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的濃度,用相同濃度的VC溶液做對照。取各濃度的樣品液1 mL于試管中,分別加0.2 mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖液和1%的K3Fe(CN)6溶液各2.5 mL,混勻后將試管在50℃水浴鍋中反應(yīng)20 min,取出放置室溫,再加入2.5 mL 10%三氯乙酸,混勻后靜置10 min,取出2.5 mL,再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的 FeCL3,混勻后反應(yīng) 10 min,在700 nm處測定吸光度。

        1.3.6 清除DPPH自由基活性的測定

        配制濃度為1×10-4mol/L的DPPH溶液。量取配制好的 DPPH 溶液 2、4、6、8、10 mL 于 10 mL 容量瓶之中,用無水乙醇定容后在517 nm波長下測吸光度并記錄,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將VC、水相和乙酸乙酯相分別配制成濃度為 0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012 mg/mL的溶液。各取1.00 mL溶液,分別加入1mL DPPH溶液,室溫避光反應(yīng)15 min,在517 nm波長下下測定吸光度A樣品,用1 mL無水乙醇與1.00 mL樣品溶液調(diào)零,消除樣品本身的顏色對吸光度的影響。向1 mL DPPH溶液中加入1 mL相應(yīng)樣品溶劑,記錄吸光度為A空白,用1 mL無水乙醇與1 mL相應(yīng)樣品溶劑調(diào)零,以扣除溶劑的影響。

        清除率計(jì)算公式:DPPH自由基清除率/%=(A空白-A樣品)/A空白×100。

        1.3.7 清除羥自由基的測定

        將水相和乙酸乙酯相分別稀釋為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的溶液,相同濃度的VC溶液做對照。取1 mL樣品,分別加入1.8mmol/LFeSO42mL和1.8mmol/L水楊酸-乙醇1.5 mL,再加入0.03%H2O20.1 mL在37℃反應(yīng) 30 min,8 000 r/min離心 10 min,510 nm 測定吸光度Ax。另用1 mL蒸餾水代替樣品溶液做空白對照測定吸光值A(chǔ)0,1 mL的蒸餾水代替雙氧水測定吸光度AX0。

        清除率計(jì)算公式為:羥自由基清除率/%=[(A0-(AX-AX0))/A0]×100

        1.3.8 清除超氧陰離子自由基的測定

        將水相和乙酸乙酯相分別稀釋為0.000 5、0.001 1、0.005.、0.01、0.021、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL 的溶液,相同濃度的VC溶液做對照。取4.5 mL pH值為8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖液加入0.5 mL蒸餾水25℃反應(yīng)10 min,再加入10 μL 45 mmol/L鄰苯三酚溶液,混合均勻在325 nm波長下測定吸光度,每隔1 min測一次,共測4 min,計(jì)算未加入樣品時(shí)鄰苯三酚自氧化速率△A0。用樣品替代蒸餾水重復(fù)上述試驗(yàn),計(jì)算入樣品后鄰苯三酚自氧化速率△A。

        清除率計(jì)算公式:超氧陰離子自由基清除率/%=(△A0-△A)△A0×100

        2 結(jié)果與分析

        2.1 黃秋葵花提取物不同極性部位總黃酮和多酚含量

        黃秋葵花水提部位總黃酮含量為(43.14±1.46)mg/g,總酚含量為(66.42±2.63)mg/g。乙酸乙酯提取部位總黃酮含量為(352.78±20.73)mg/g,總酚含量為(405.2±23.02)mg/g。乙酸乙酯部位的總黃酮和多酚含量要多于水提部位。

        2.2 還原力的測定結(jié)果

        采用鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power,F(xiàn)RAP)法測定,其作用機(jī)理是抗氧化物質(zhì)在較低pH值條件下可將Fe3+還原為Fe2+,在700 nm處檢測吸光值,值越大還原能力越強(qiáng)即抗氧化能力越強(qiáng)[10]。還原力的測定結(jié)果見圖1。

        圖1 黃秋葵花不同極性部位提取物的還原能力Fig.1 Reducing power abilities of different polarity fractions from okra flowers

        如圖1所示,黃秋葵花乙酸乙酯相和水相提取物均表現(xiàn)出不同程度的還原能力,具有明顯的量效關(guān)系,水提部位提取物的還原力要大于陽性對照,乙酸乙酯部位提取物的還原力要弱于陽性對照。

        2.3 對DPPH自由基清除能力

        DPPH自由基清除能力的作用機(jī)理是在抗氧化劑的作用下,紫色的DPPH自由基可被還原為黃色的非自由基DPPH-H,在517 nm處檢測吸光值,一定范圍內(nèi)吸光值變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系[11]。對DPPH自由基清除能力見圖2。

        由圖2可以看出,樣品對DPPH自由基的清除作用隨著濃度的增加而增強(qiáng),水提部位清除DPPH自由基活性明顯優(yōu)于乙酸乙酯提取部位和VC。

        為了便于比較不同物質(zhì)的抗氧化能力,常用IC50值表示抗氧化物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力,即對自由基清除率為50%時(shí)所對應(yīng)抗氧化劑的質(zhì)量濃度。IC50值越小,表明該物質(zhì)清除自由基的能力越強(qiáng)。黃秋葵花不同極性部位提取物清除DPPH自由基的IC50見表1。

        圖2 黃秋葵花不同極性部位提取物清除DPPH能力Fig.2 DPPH scavenging abilities of different polarity fractions from okra flowers

        表1 黃秋葵花不同極性部位提取物清除DPPH自由基的IC50Table 1 IC50of DPPH scavenging capacities of different polarity fractions from okra flowers

        由表1可知,黃秋葵花水提部位IC50值最小,而乙酸乙酯相值最大,表明它們的DPPH自由基清除能力大小依次為水相>VC>乙酸乙酯相。

        2.4 對羥自由基的清除能力

        清除羥自由基的作用機(jī)理是羥基自由基可與水楊酸分子上的苯環(huán)作用產(chǎn)生2,3-二羥基苯甲酸,在510 nm處可檢測吸光值,若反應(yīng)體系中存在抗氧化劑,吸光值就會降低[12]。對羥自由基的清除能力見圖3。

        圖3 黃秋葵花不同極性部位提取物清除羥自由基能力Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging abilities of different polarity fractions from okra flowers

        由圖3可知,在考察濃度范圍內(nèi),隨著濃度的逐漸增大,VC、水相和乙酸乙酯相表現(xiàn)出清除羥自由基的能力越來越強(qiáng),量效關(guān)系非常明顯,尤其是乙酸乙酯相,很小的濃度變化就對清除率產(chǎn)生很大的影響。

        黃秋葵花不同極性部位提取物清除羥自由基的IC50見表2。

        表2 黃秋葵花不同極性部位提取物清除羥自由基的IC50Table 2 IC50of hydroxyl free radical scavenging capacities of different polarity fractions from okra flowers

        由表2可知,乙酸乙酯提取部位清除羥自由基的IC50值最小,為14.04 μg/mL,因此清除羥自由基的能力的大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴ヌ崛〔课唬舅嗵崛〔课唬綱C。

        2.5 清除超氧陰離子自由基的能力

        鄰苯三酚自氧化法清除超氧陰離子自由基的作用機(jī)理是鄰苯三酚在弱堿性條件下會發(fā)生自氧化反應(yīng)會產(chǎn)生有色中間物質(zhì),若加入抗氧化物質(zhì)會阻斷有色物質(zhì)的積累,限制鄰苯三酚的自氧化,可在325 nm處檢測吸光度值變化情況[13]。由清除超氧陰離子自由基的能力見表4。

        圖4 黃秋葵花不同極性部位提取物清除超氧陰離子自由基的能力Fig.4 Superoxide anion scavenging abilities of different polarity fractions from okra flowers

        圖4所知,在考察濃度范圍內(nèi),VC的清除能力最強(qiáng),乙酸乙酯提取部位的清除能力略優(yōu)于水提部位,且隨著濃度的增加,其清除超氧陰離子自由基的能力增強(qiáng)。

        黃秋葵花不同極性部位提取物清除超氧陰離子自由基的IC50見表3。

        由表3可知,對照品VC清除50%的超氧陰離子自由基所需濃度為3.65 μg/mL,乙酸乙酯提取部位清除50%的超氧陰離子自由基所需濃度為6.19 μg/mL,水相提取部位清除50%的超氧陰離子自由基所需濃度為15.00 μg/mL。說明乙酸乙酯提取部位清除超氧陰離子自由基的能力強(qiáng)于水相提取部位。

        表3 黃秋葵花不同極性部位提取物清除超氧陰離子自由基的IC50Table 3 IC50of superoxide anion scavenging capacities of different polarity fractions from okra flowers

        3 結(jié)論與討論

        不同抗氧化能力檢測方法有不同的反應(yīng)機(jī)理,本研究為了獲得更加可靠的結(jié)果,分別采用還原能力測定、清除DPPH自由基、清除羥自由基和清除超氧陰離子自由基4種不同方法對黃秋葵花不同極性部位提取物的抗氧化能力進(jìn)行評價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)黃秋葵花不同極性部位提取物對Fe3+、DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基均具有不同程度的抗氧化能力,且隨著濃度的升高抗氧化能力不斷提高,說明總黃酮和多酚含量與抗氧化活性之間具有良好的量效關(guān)系。由于不同抗氧化評價(jià)方法的測定原理不同,不同極性部位抗氧化能力的強(qiáng)弱順序有可能不一致,本研究中水相的還原能力和清除DPPH自由基的能力較強(qiáng),強(qiáng)于VC,乙酸乙酯相最弱;水相和乙酸乙酯相對羥自由基的清除能力均較強(qiáng),極低的濃度就具有較高的清除羥自由基活性且強(qiáng)于VC;水相和乙酸乙酯相清除超氧陰離子自由基的能力均弱于VC。

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