王瑩，曲蕙名，趙博，紀曉彤，劉可春，楚杰，*

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）山東省科學院生物研究所，山東濟南250103；2.山東師范大學生命科學院，山東濟南250014）

體內自由基在信號傳導等方面具有一定功能，但過多的自由基易導致人體細胞損傷，從而引發(fā)癌癥、腫瘤等疾病[1-3]。β-胡蘿卜素廣泛存在于蔬菜、水果中[4]，可以清除人體內的自由基，是一類重要的天然抗氧化劑，能夠有效提高機體的免疫功能[5-8]。三孢布拉霉發(fā)酵法是目前國際上大規(guī)模生產天然β-胡蘿卜素的最佳方法，改進發(fā)酵和提取工藝能夠有效提高β-胡蘿卜素含量[9-12]。目前，對來源于微生物發(fā)酵β-胡蘿卜素的主要研究集中在提高產量方面，缺乏對其抗氧化動力學的系統(tǒng)研究，而動力學研究是對β-胡蘿卜素抗氧化活性機理研究的前提基礎[13]。因此，對三孢布拉霉產β-胡蘿卜素抗氧化活性動力學研究具有重要意義。

本文采用DPPH法測定從三孢布拉霉菌株中提取的β-胡蘿卜素清除自由基的活性，進而通過計算獲得相應動力學參數，確定不同質量濃度的β-胡蘿卜素在不同的反應溫度和反應時間條件下清除DPPH自由基能力的變化，為下一步對β-胡蘿卜素抗氧化活性的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三孢布拉霉（Blakeslea trispora）正（+）菌株、負（-）菌株：山東省科學院生物所工業(yè)微生物科室保藏。

β-胡蘿卜素標準品：Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：梯希愛（上海）化成發(fā)展有限公司；無水乙醇、石油醚等試劑均為國產分析純；試驗用水為超純水。

種子培養(yǎng)基：玉米粉2.5%，黃豆粉5%，VB10.000 5%。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉1.8%，葡萄糖0.48%，黃豆粉3.00%，玉米漿粉0.075%，MgSO4·7H2O 0.10%，KH2PO40.2%，植物油5%。

1.2 儀器與設備

UNICO UV-2100紫外分光光度計：上海賀德實驗設備有限公司；CS601電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；LE204E/02電子天平：梅特勒托利多集團；N-1110V-WD旋轉蒸發(fā)儀：東京理化器械株式會社；FD-1冷凍干燥機：北京德天佑科技發(fā)展有限公司；HZQ-QX溫控搖床：哈爾濱市東聯電子技術開發(fā)有限公司；DNP-9082恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 三孢布拉霉菌株發(fā)酵產β-胡蘿卜素

在無菌條件下，從斜面保存的三孢布拉霉原始正、負菌株取一定大小的菌苔，分別置于內裝25 mL種子培養(yǎng)基的滅菌后的250 mL錐形瓶中，27℃，180 r/min，搖床培養(yǎng)，其中負菌培養(yǎng)60 h，正菌培養(yǎng)48 h。而后，將正負菌株同時轉接到內裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，轉接正、負菌株菌種比例為1∶4，27℃，180 r/min，搖床培養(yǎng)120 h。

1.3.2 β-胡蘿卜素提取及含量測定

將β-胡蘿卜素標準品溶解于乙酸乙酯，分別配制濃度為 0、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL 樣品，使用分光光度計于450 nm處測定吸光值，繪制標準曲線。

收集發(fā)酵菌液，離心去除上清，菌體蒸干水分，準確稱量，按照參考文獻[14]方法進行提取，測定450 nm吸光值，通過標準曲線計算β-胡蘿卜素含量，備用。

1.3.3 β-胡蘿卜素抗氧化活性動力學參數測定

配制質量濃度分別為 80、100、120、140、160 μg/mL的β-胡蘿卜素溶液，并稱取DPPH 0.019 7 g，用無水乙醇溶解并定容至50 mL作儲備液。取DPPH儲備液10 mL稀釋成100 μmol/L DPPH自由基工作液（現配現用）。將1 mL樣品與3 mL 100 μmol/L DPPH自由基工作液混勻，分別在37℃和25℃下反應不同時間，于517 nm波長處測定吸光度。以DPPH自由基清除率（α）和半數效應濃度EC50評估β-胡蘿卜素樣品清除自由基的能力，按下式計算DPPH自由基清除率。

式中：A為DPPH自由基清除率，%；Ai為加入β-胡蘿卜素時溶液的吸光度；Aj為β-胡蘿卜素溶液在測定波長處的吸光度；A0為未加β-胡蘿卜素時溶液的吸光度。

1.3.4 數據處理

運用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，所有試驗均重復3次。

2 結果與討論

2.1 三孢布拉霉菌株發(fā)酵產β-胡蘿卜素

三孢布拉霉，有正菌和負菌兩種菌，負菌產β-胡蘿卜素能力強，正菌產β-胡蘿卜素能力弱，正菌和負菌一起融合后，產生三孢酸，誘導β-胡蘿卜素合成。負菌為主要的生產菌，而正菌在β-胡蘿卜素合成過程中起著一定的誘導作用。相對正菌，負菌更容易退化。因此，以三孢布拉霉負菌為出發(fā)菌株，進行定向傳代選育。

將待篩選的三孢布拉霉負菌與正菌進行混合培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵，生產β-胡蘿卜素。通過分步提取，獲得純度較高的β-胡蘿卜素。通過標準曲線測定β-胡蘿卜素含量，計算所得產量，如表1所示。

表1 不同菌株β-胡蘿卜素產量對比Table 1 The yield of β-carotene from different strains

根據試驗結果，4號菌株菌體干重為66.23 g/L，β-胡蘿卜素生物合成量為2.44 g/L，在篩選菌種中為最優(yōu)，因此挑選三孢布拉霉負菌4號菌株為最終目標菌株，與正菌混合培養(yǎng)發(fā)酵。同時，優(yōu)化發(fā)酵條件，通過加入不同劑量的植物油使菌株菌絲分散，加速菌株生長繁殖。確定最終種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基配方，獲得菌株后，通過提取，獲得β-胡蘿卜素，取部分樣品進行含量測定，其余備用。

2.2 反應溫度及β-胡蘿卜素質量濃度對β-胡蘿卜素抗氧化活性的影響

圖1 溫度對β-胡蘿卜素清除DPPH自由基的影響Fig.1 Effect of temperature on the kinetics of scavenging DPPH radical by β-carotene

使用提取的β-胡蘿卜素進行試驗，以對DPPH自由基清除率為抗氧化活性指標。結果如圖1所示，A～E分別表示 β-胡蘿卜素質量濃度為 80、100、120、140、160 μg/mL時，反應溫度分別在37℃和25℃條件下，β-胡蘿卜素清除DPPH自由基清除率曲線。

圖2中A、B分別表示反應溫度分別為37℃和25 ℃時，不同質量濃度（80、100、120、140、160 μg/mL）的β-胡蘿卜素清除DPPH自由基的清除率曲線。

圖2 β-胡蘿卜素質量濃度對清除DPPH自由基的影響Fig.2 Effect of concentration on the kinetics of scavenging DPPH radical by β-carotene

由圖1、圖2可見，溫度和初始質量濃度都對β-胡蘿卜素清除DPPH自由基有影響。同一質量濃度的β-胡蘿卜素在不同溫度下，反應達到平衡的時間不同。37℃時，反應達到平衡的時間約為30 min，而25℃時，（45±2）min時反應結束；溫度對β-胡蘿卜素清除DPPH自由基的速率（k）影響顯著（P<0.05），而對清除率（α）無顯著影響。同一反應溫度下，隨著β-胡蘿卜素質量濃度的不斷提高，其清除DPPH自由基的能力逐漸加強，表明在一定范圍內β-胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力與其濃度呈明顯的量效關系。因此要探討初始質量濃度和反應溫度對β-胡蘿卜素清除DPPH自由基活性的變化規(guī)律。

2.3 β-胡蘿卜素清除DPPH自由基活性半數效應濃度的測定

不同反應溫度下β-胡蘿卜素對DPPH自由基的清除曲線見圖3。

圖3 不同反應溫度下β-胡蘿卜素對DPPH自由基的清除曲線Fig.3 Scavenging curves of DPPH radical by β-carotene under different reaction temperatures

如圖3所示，不同反應溫度下，80μg/mL～160μg/mL范圍內隨著β-胡蘿卜素濃度的升高，清除率均增大。當反應進行到30 min時，37℃下反應達到平衡，最大清除率達到70.77%；25℃下反應尚未結束，最大清除率為55.80%。表2為不同反應溫度條件下反應進行到30 min時，β-胡蘿卜素清除DPPH自由基動力學的回歸方程及EC50，由表2可以得出反應溫度對EC50影響顯著（P<0.05），且EC50（37℃）

表2 β-胡蘿卜素清除DPPH自由基動力學的回歸方程及EC50Table 2 Regression equation and EC50of scavenging kinetics of DPPH radical by β-carotene

2.4 β-胡蘿卜素抗氧化動力學參數分析

假設β-胡蘿卜素在不同溫度下清除DPPH自由基的速率符合一級或二級反應動力學模型，將所測定的消除數據進行分析[15]。以160 μg/mL組為例，分別以ln（1-α）-t和1/（1-α）-t作圖，結果如圖4所示。

圖4 一級、二級反應動力學方程擬合結果Fig.4Kinetic curves of ln（1-α）-t and 1/（1-α）-t

由圖4可知，在反應溫度37℃和25℃條件下，ln（1-α）-t擬合曲線的 R2分別為 0.995 6 和 0.990 7；1/（1-α）-t擬合曲線的R2分別為0.977 8和0.977 0。ln（1-α）-t擬合曲線的R2高于1/（1-α）-t擬合曲線的R2，即一級動力學模型擬合的線性相關性較好。同時，其余4組濃度均可得出相同結論。由此可見，β-胡蘿卜素清除DPPH自由基的反應動力模型符合一級反應，可由公式 ln（1-α）=-kt求得反應速率常數k，式中：α表示DPPH自由基清除率，t為反應時間，min；k為擬一級反應速率常數，mg/（mL·min）。

根據阿侖尼烏斯公式 k=K0·exp（－Ea/RT），式中：k為反應速率常數；K0為方程常數；Ea為表觀活化能，kJ/mol；R為氣體常數，8.314 dm3·kPa/（K·mol）；T為絕對溫度，K[16]，對方程兩邊同時取對數，得到公式lnk=－Ea/RT+lnK0。以lnk對1/T繪制曲線，通過曲線的斜率和截距即可得到Ea的值，見表3。

表3 β-胡蘿卜素抗氧化動力學參數Table 3 Parameters for antioxidant kinetics of β-carotene

隨反應溫度的升高，反應速率常數k增大，說明溫度升高，反應速度加快，升溫有利于反應的進行；不同質量濃度的Ea差異不顯著，說明Ea不受初始質量濃度C0的影響。

3 結論

本研究通過培養(yǎng)發(fā)酵三孢布拉霉菌株生產β-胡蘿卜素，并對β-胡蘿卜素進行提取，以其為研究對象，采用DPPH法測定β-胡蘿卜素自由基清除率，考察了不同溫度條件下，不同濃度的β-胡蘿卜素抗氧化活性的不同，為充分開發(fā)利用這一天然資源提供科學依據。結果表明，相同濃度下，β-胡蘿卜素在37℃抗氧化活性達到平衡的時間為30 min，短于25℃時45 min的平衡時間，說明溫度越高，反應速度越快；在相同溫度下，β-胡蘿卜素濃度越高，抗氧化活性越強，當濃度達到160 μg/mL時，能夠達到70.77%的清除效率。同時，通過計算可得，隨反應溫度的升高，反應速率常數K增大，說明反應溫度對β-胡蘿卜素抗氧化活性有較大影響，溫度升高，反應速度加快，升溫有利于反應的進行，但不同質量濃度的Ea穩(wěn)定在31 kJ/mol左右，沒有顯著性差異，說明β-胡蘿卜素起始濃度對抗氧化活性沒有顯著影響。β-胡蘿卜素具有優(yōu)良的清除自由基的能力，在保健食品和醫(yī)藥工業(yè)等方面應用前景廣闊，此研究為β-胡蘿卜素功能產品的研究和開發(fā)提供理論基礎，可以進一步深入系統(tǒng)的進行探討。

[1]Mc Auley MT,Mooney KM.LDL-C levels in older people:Cholesterol homeostasis and the free radical theory of ageing converge[J].Med Hypotheses,2017,104:15-19

[2]Salar RK,Purewal SS,Sandhu KS.Bioactive profile,free-radical scavenging potential,DNA damage protection activity,and mycochemicals in Aspergillus awamori(MTCC 548)extracts:a novel report on filamentous fungi[J].3 Biotech,2017,7(3):164

[3]Ullah F,Iqbal N,Ayaz M,et al.DPPH,ABTS free radical scavenging,antibacterial and phytochemical evaluation of crude methanolic extract and subsequent fractions of Chenopodium botrys aerial parts[J].Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences,2017,30(3):761-766

[4]Guo C,Zhao L,Wang F,et al.β-Carotene from yeasts enhances laccase production of pleurotus eryngii var.ferulae in co-culture[J].Front Microbiol,2017,8:1101

[5]袁磊,劉曉庚,唐瑜.不同類胡蘿卜素清除自由基能力的比較[J].包裝與食品機械,2015,33(2):7-11

[6]錢明雪,李勝立,李凡,等.6種石斛多糖抗亞急性酒精性肝損傷作用的比較[J].中國藥學雜志,2015,50(24):2117-2123

[7]Chang HT,Chang YQ,Han RM,et al.Singlet fission reaction of light exposed β-carotene bound to bovine serum albumin.A novel mechanism in protection of light exposed tissue by dietary carotenoids[J].J Agric Food Chem,2017,65(29):6058-6062

[8]Praud C,Al Ahmadieh S,Voldoire E,et al.Beta-carotene preferentially regulates chicken myoblast proliferation withdrawal and differentiation commitment via BCO1 activity and retinoic acid production[J].Exp Cell Res,2017,358(2):140-146

[9]顧秋亞,余曉斌,解書懷.三孢布拉霉異性菌株接合孢子的形成與β-胡蘿卜素合成關系的研究[J].食品工業(yè)科技,2008,29(3):73-75

[10]劉星,劉姍姍,殷海松,等.三孢布拉霉高產β-胡蘿卜素菌株選育[J].飼料工業(yè),2016,37(10):47-50

[11]Li J,Shen J,Sun Z,et al.Discovery of several novel targets that enhance β-Carotene production in Saccharomyces cerevisiae[J].Front Microbiol,2017,6(8):1116-1119

[12]閆興,向夢雄,王常高,等.代謝調節(jié)劑對三孢布拉氏霉菌發(fā)酵的影響[J].湖北工業(yè)大學學報,2016,31(1):85-88

[13]Jimenez Escrig A,Jimenez Jimenez I,Sanchez Moreno C,et al.E－valuation of free radical scavenging of dietary carotenoids by the stable radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl[J].Journal of the Science of Food&Agriculture,2000,80(11):1686-1690

[14]鄭春紅,徐昌平,李曉梅,等.耐輻射動球菌類胡蘿卜素提取物的抗氧化活性研究[J].核農學報,2017,31(2):280-287

[15]李翠勤,郭蘇月,王鵬翔,等.脂肪二胺橋聯受阻酚清除DPPH·自由基的活性及動力學研究[J].化學通報,2015,78(9):810-814

[16]馮學珍,伍善廣,韋啟球,等.網地藻多糖清除DPPH·自由基活性的動力學研究[J].廣西植物,2017,37(5):647-652