李蘭芳，于娟

1.廣東省中醫(yī)院耳鼻喉科，廣東 廣州 510120；2.廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510120

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 選擇健康雄性SD大鼠46只，體質(zhì)量180～220 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：44002100006305。實(shí)驗(yàn)在廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室是SPF級。將實(shí)驗(yàn)動物按體質(zhì)量從小到大編號，隨機(jī)分為頭孢克洛組、模型組、利水通竅湯低劑量組、利水通竅湯中劑量組、利水通竅湯高劑量組各8只，正常對照組6只。實(shí)驗(yàn)中頭孢克洛組死亡1只、利水通竅湯低劑量組死亡2只、中劑量組死亡1只。

1.2 主要藥物與試劑 利水通竅湯藥物組成：茯苓20 g，路路通18 g，黃芩、金銀花、澤瀉、桑白皮各15 g，柴胡、石菖蒲各12 g，川芎、地龍、車前子、桔梗各10 g，甘草6 g，中藥材購自廣東省中醫(yī)院，然后由制劑室制成水煎劑(高劑量組1.5 g/mL、中劑量組1 g/mL、低劑量組0.5 g/mL)。綠膿桿菌內(nèi)毒素，購自Sigma公司，批號：084M4013；頭孢克洛緩釋片，禮萊蘇州制藥有限公司，批號061008；抗VEGF抗體，Boster公司，批號：AR1010。

1.3 動物模型建立 全部大鼠在電耳鏡下檢查排除外耳道及中耳感染。除正常對照組外，其它各組大鼠按參考文獻(xiàn)[10]的方法，沿下頜骨邊緣分離肌肉，下方可見聽泡，聽泡內(nèi)注入內(nèi)毒素建立急性分泌性中耳炎大鼠模型。48 h后電耳鏡觀察鼓膜。

1.4 動物模型判斷標(biāo)準(zhǔn) 正常對照組大鼠鼓膜透亮，鼓室無積液，錘骨柄和光錐清晰，造模后大鼠的鼓膜充血、渾濁，可有鼓室積液征，光錐消失。

1.5 干預(yù)方法 48 h后經(jīng)電耳鏡觀察證實(shí)造模成功后，頭孢克洛組、利水通竅湯各劑量組按每天1次灌胃給藥。利水通竅湯高、中、低劑量組灌胃利水通竅湯的濃度分別是1.5、1、0.5 g/mL，按每只大鼠1.05 mL/100 g灌胃；頭孢克洛組(頭孢克洛配置成0.01 g/mL的濃度)按1 mL/100 g灌胃，正常對照組和模型組灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)給藥7天。

1.6 蘇木素-伊紅染色（HE） 檢查聽泡 給藥結(jié)束后全部大鼠立即斷頭，解剖聽泡，10%甲醛固定，5%硝酸水溶液脫鈣，脫水后石蠟包埋切片，HE染色，進(jìn)行光鏡檢查。

1.7 免疫組化檢查VEGF表達(dá) 取大鼠中耳部位組織，脫水包埋切片后，抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，BSA或者血清封閉，加一抗、加二抗，DAB顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。Image pro-plus 6.0軟件分析免疫組化圖片：每組內(nèi)每張切片隨機(jī)挑選3個視野，200倍進(jìn)行拍照，圖像采集系統(tǒng)型號：Nikon eclipse CI。拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD)，以平均光密度值(OD)進(jìn)行各組的比較。

1.8 中性粒細(xì)胞計數(shù)與鼓室黏膜厚度測量 取大鼠中耳黏膜部位，中性粒細(xì)胞計數(shù)：目鏡上配計數(shù)格，在低倍鏡下于中耳黏膜下選取5個陽性細(xì)胞多的區(qū)域，在400倍鏡下計數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)，取5個高倍視野下的均值。

鼓室黏膜厚度：用測微計在光鏡下測量，每個標(biāo)本取5個不同位置進(jìn)行測量并取均值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠鼓室黏膜病理改變比較 見圖1。正常對照組：鼓室黏膜為單層上皮細(xì)胞，無明顯破壞，無明顯炎癥反應(yīng)。模型組：黏膜纖毛上皮水腫，伴少量淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜纖毛脫落，黏膜下層輕度水腫伴中等數(shù)量的炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞)浸潤。利水通竅湯低、中、高劑量組及頭孢克洛組：黏膜纖毛上皮水腫，部分細(xì)胞氣球樣變，伴少量淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜下層輕度水腫伴少量淋巴細(xì)胞浸潤，4個治療組鼓室黏膜厚度、黏膜下層水腫程度較模型組輕。

圖1 各組大鼠鼓室黏膜HE染色結(jié)果 (×200)

2.2 各組大鼠中耳鼓室黏膜厚度比較 見表1。與正常對照組比較，模型組大鼠中耳鼓室黏膜厚度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，利水通竅湯低、中、高劑量組和頭孢克洛組大鼠中耳鼓室黏膜厚度顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。利水通竅湯各劑量組與頭孢克洛組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠中耳鼓室黏膜厚度比較(±s)

表1 各組大鼠中耳鼓室黏膜厚度比較(±s)

與正常對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常對照組模型組利水通竅湯低劑量組利水通竅湯中劑量組利水通竅湯高劑量組頭孢克洛組n 6 8 6 7 8 7鼓室黏膜厚度(μm)41.30±8.59 158.18±9.27①125.53±6.75②128.52±9.57②111.22±9.06②111.55±9.90②

2.3 各組大鼠中耳黏膜中性粒細(xì)胞計數(shù)比較 見表2。與正常對照組比較，模型組大鼠中耳黏膜中性粒細(xì)胞計數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，利水通竅湯低、中、高劑量組和頭孢克洛組大鼠中耳黏膜中性粒細(xì)胞計數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。利水通竅湯各劑量組與頭孢克洛組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠中耳黏膜中性粒細(xì)胞計數(shù)比較(±s)

表2 各組大鼠中耳黏膜中性粒細(xì)胞計數(shù)比較(±s)

與正常對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常對照組模型組利水通竅湯低劑量組利水通竅湯中劑量組利水通竅湯高劑量組頭孢克洛組n 6 8 6 7 8 7中性粒細(xì)胞計數(shù)(個/m2)2.00±0.63 14.37±1.59①13.17±1.47②12.14±1.57②10.63±1.51②10.57±2.37②

2.4 各組大鼠中耳黏膜中VEGF的表達(dá)比較 見表3。與正常對照組比較，模型組大鼠中耳黏膜中VEGF的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，利水通竅湯低、中、高劑量組和頭孢克洛組大鼠中耳黏膜中VEGF的表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。利水通竅湯各劑量組與頭孢克洛組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 各組大鼠中耳黏膜中VEGF的表達(dá)比較(±s)

表3 各組大鼠中耳黏膜中VEGF的表達(dá)比較(±s)

與正常對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常對照組模型組利水通竅湯低劑量組利水通竅湯中劑量組利水通竅湯高劑量組頭孢克洛組n 6 8 6 7 8 7光密度值0.010±0.002 0.027±0.011①0.012±0.002②0.010±0.005②0.008±0.004②0.014±0.001②

3 討論

目前研究表明參與ASOM發(fā)病過程的炎癥介質(zhì)有血管活性腸肽、P物質(zhì)、組胺、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等，這些炎癥介質(zhì)都有擴(kuò)張血管、增加血管通透性的作用，進(jìn)而造成中耳滲液的潴留[1]。VEGF可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，是正常和異常血管新生的重要調(diào)節(jié)因子，在生理和病理性血管新生中起重要作用。VEGF受體特異性地分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞，VEGF通過與其特異性受體的結(jié)合，發(fā)揮生理功能：①促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂從而促進(jìn)新生血管形成；②增強(qiáng)血管通透性。李希平等[11]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素能誘導(dǎo)大鼠ASOM；VEGF可能參與了ASOM急性期的中耳炎癥反應(yīng)。VEGF在急性中耳炎大鼠的中耳黏膜中表達(dá)上調(diào)，甚至在分泌性中耳炎患者的中耳滲液中VEGF檢出率高達(dá)100%。因此本實(shí)驗(yàn)選用VEGF為指標(biāo)，反應(yīng)大鼠ASOM中耳黏膜的炎癥改變。

急性分泌性中耳炎是耳鼻喉科臨床上較常見的疾病之一，屬于中醫(yī)耳脹范疇，以起病急、耳內(nèi)脹悶微痛、耳閉不聰、鼓膜混濁內(nèi)陷等為特點(diǎn)。在治療ASOM上，中醫(yī)藥因其副作用小有著明顯優(yōu)勢。本研究應(yīng)用臨床常用方利水通竅湯，方中柴胡、石菖蒲、路路通以開耳竅之郁閉；黃芩、金銀花清熱解毒以利清竅；車前子、澤瀉、茯苓利水滲濕，肺朝百脈，肺氣不宣，多伴氣血郁阻，而血不利則為水，故方中佐以行氣活血之川芎、地龍等。諸藥并用，共奏宣肺行水通竅之功效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常對照組大鼠中耳黏膜VEGF的表達(dá)均較低，而在模型組中明顯上調(diào)，符合其病理表現(xiàn)，即炎性細(xì)胞浸潤及VEGF表達(dá)明顯改變。利水通竅湯各劑量組的VEGF表達(dá)比模型組下調(diào)，病理切片上可見炎性細(xì)胞浸潤較模型組減少，表明利水通竅湯可以抑制中耳黏膜中VEGF的表達(dá)，進(jìn)而減輕由內(nèi)毒素引發(fā)的中耳炎癥。利水通竅湯治療AOSM的機(jī)理可能是通過下調(diào)VEGF表達(dá)，減輕中耳黏膜水腫，降低炎性細(xì)胞在中耳黏膜中的浸潤，來抑制中耳炎癥。這一研究對闡明中藥對AS0M的分子作用機(jī)制、創(chuàng)新中藥新藥研發(fā)和豐富現(xiàn)代中醫(yī)理論具有重要意義。

本研究尚存在許多不足之處，主要有：①模型的問題：在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼓膜注射內(nèi)毒素制作大鼠ASOM模型時易破裂，后改為經(jīng)頸部正中切口，經(jīng)聽泡注射內(nèi)毒素制備模型，模型可能存在頸部術(shù)口感染的可能。②檢測指標(biāo)偏少：本實(shí)驗(yàn)所選取的檢測指標(biāo)偏少，若能選取多些的檢測指標(biāo)，會更有說服力。

[1]付發(fā)祥，宋蕾．變態(tài)反應(yīng)在分泌性中耳炎中的作用[J]．實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2011，8(5)：182-184.

[2]周桂英，鄧湖山，陳世漢，等．分泌性中耳炎與變態(tài)反應(yīng)的關(guān)系[J]．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2007，23(8)：1173-1174．

[3]唐安洲，周永，李杰恩，等．分泌性中耳炎咽鼓管功能障礙的臨床觀察[J]．中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2001，7(4)：217-219．

[4]陳穗俊，梁象逢，鄭億慶，等．白介素-2在分泌性中耳炎中的臨床意義[J]．中華耳科學(xué)雜志，2005，3(2)：93-95．

[5]謝明，周梁，金曉杰．白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-a在分泌性中耳炎滲出液中的表達(dá)及意義[J]．中華耳鼻咽喉科雜志，1998(6)：S37-39．

[6]段澤星，謝立群．VEGF在腫瘤生長和血管生成中的作用[J]．世界華人消化雜志，2010，18(27)：2894-2900．

[7]李京桂，林相國，許濤，等．VEGF家族及其在腫瘤生長中作用的研究[J]．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12(4)：777-779．

[8]王文歡，伍仁毅，孫國瑛，等．VEGF-C和VEGF-D在胃癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]．中南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，35(4)：335-340．

[9]李蘭芳．宣肺利水通竅湯治療急性分泌性中耳炎的療效觀察[J]．中外健康文摘，2011，45(8)：227-228．

[10]李希平，趙守琴，戴海江，等．腫瘤壞死因子-a在分泌性中耳炎動物模型中的表達(dá)[J]．中國耳鼻咽喉頭頸外科，2005，12(4)：247-249．

[11]李希平，戴海江，趙守琴，等．血管內(nèi)皮生長因子在實(shí)驗(yàn)性分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜的表達(dá)[J]．聽力學(xué)及言語疾病雜志，2013，21(4)：387-390．