何慧君，劉志娟

蘭州大學(xué)附屬第二醫(yī)院定西醫(yī)院，甘肅 蘭州 743000

腦卒中為臨床較為常見疾病，依據(jù)其發(fā)病機(jī)制可分為出血性卒中與缺血性卒中兩類。隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。人類大腦在缺氧缺血受損時，其神經(jīng)細(xì)胞會結(jié)合周邊支持細(xì)胞發(fā)生一系列生理與病理的連鎖反應(yīng)，其中最快出現(xiàn)的是免疫炎癥反應(yīng)，它在患者疾病發(fā)展中有兩面性，即在神經(jīng)受損結(jié)局中既有保護(hù)作用也有損害作用[1～2]?；颊吣X梗死后，機(jī)體腦組織不僅受到缺氧缺血等損害，炎癥介質(zhì)所分解的炎癥因子對腦部的傷害在患者預(yù)后和疾病嚴(yán)重程度方面有重要影響。相關(guān)研究顯示，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等促炎因子會加重腦組織損傷，而轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)及白細(xì)胞介素-10(IL-10)等抑炎因子則能夠促進(jìn)受損腦神經(jīng)功能恢復(fù)，對腦組織起保護(hù)作用[3～4]。因此，本文通過探究血塞通注射液及Nogo胞外肽端殘基 1-40(Nogo extra cellular peptide residues 1-40，NEP1-40)對腦梗死大鼠大腦皮層及血清中促炎因子與抑炎因子表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制，為臨床患者治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取雄性健康SD大鼠25只，體質(zhì)量(245.6±15.8)g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(京)2015-2016，生產(chǎn)批號：20160472。飼養(yǎng)條件：屏障環(huán)境動物實驗室室溫20～24℃，相對濕度在40%～50%之間，明暗交替12 h/12 h，自由獲取食物和水。依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分成5組，分別是模型組、NEP1-40組、血塞通組、假手術(shù)組及NEP1-40聯(lián)合血塞通組(P+N組)，每組5只。1.2 主要試劑及儀器 試劑：丙烯酰胺(美國Amresco公司，批號：0614)；過硫酸銨(美國Sigma公司，批號：A6910)；醫(yī)用X光膠片(日本富士公司，批號：SuperRX)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司，批號：ZLI-9645)；IL-1β一抗(英國Abcam公司，批號：ab8611)；TGF-β1一抗(英國Abcam公司，批號：ab06418)；TNF-β1及IL-10試劑盒(武漢博士德公司，批號：EK1672、EK0591)；TNF-α 及 IL-1β 試劑盒(上海Ameko公司，批號：AE8152Ra、AE8159Ra)；氯化鈉(北京雙鶴藥業(yè)公司)；血塞通(昆明制藥公司，批號：13JB10)；NEP1-40(美國 Sigma-Aldrich 公司)。

儀器：低溫冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司，型號：Fresco17)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠，型號：SW-CJ-1F)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，型號：MK3)；搖床(江蘇其林貝爾公司，型號：TS-8)；微波爐(中國格蘭仕公司，型號：P6951)。1.3 模型建立 在相對濕度45%、溫度為25℃室內(nèi)飼養(yǎng)，自由取水、飲食，喂養(yǎng)3天后，除假手術(shù)組外，其余4組大鼠依據(jù)改良Longa線栓栓塞法進(jìn)行手術(shù)。手術(shù)前大鼠禁食12 h，按照1 mL/100 g的劑量腹腔注入3.5%水合氯醛，取仰臥位置固定，正中位置切開，肌肉組織鈍性分離，右側(cè)頸總動脈(CCA)分離在視野外部，頸內(nèi)動脈(ICA)與頸外動脈(ECA)清楚顯現(xiàn)；夾閉ICA并結(jié)扎CCA與ECA近心端，以形成“Y”字封閉血管，剪一小口在CCA遠(yuǎn)心端插入尼龍栓線，沿血管方向進(jìn)入ICA動脈夾處，結(jié)扎一圈“活結(jié)”在開口上方，動脈夾松開，沿血管將栓線插入遇阻力停止，而后縫合皮膚、消毒。假手術(shù)組將皮膚切開，僅把頸部肌肉鈍性分離不栓塞線栓，縫合皮膚、消毒。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后對大鼠進(jìn)行TTC染色，若大腦切片右側(cè)出現(xiàn)連續(xù)白色梗死，對側(cè)為鮮紅色則說明造模成功。

1.4 干預(yù)方式 模型組和假手術(shù)組腹腔注射10 mg/(kg·d)的0.9%氯化鈉。血塞通組，把血塞通溶在0.9%氯化鈉內(nèi)，腹腔注入劑量為71 mg/(kg·d)；NEP1-40組，把 NEP1-40溶在0.9%氯化鈉內(nèi)，腹腔注入劑量為85 g/(kg·d)；P+N組為血塞通和NEP1-40聯(lián)合劑量，各組大鼠均連續(xù)干預(yù)28天。

1.5 樣本采集 干預(yù)28天后，3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉，取腹主動脈血，室溫靜置1 h，4℃離心機(jī)15 000 rmp離心15 min，取上清液，而后斷頭、剝腦，取梗死側(cè)大腦皮層液氮凍存?zhèn)溆?，后半全腦4%多聚甲醛固定以備用。

1.6 檢測指標(biāo)及方法 ①觀察大鼠術(shù)后體質(zhì)量和神經(jīng)功能評分改變狀況(依據(jù)Longa法：正常活動，沒有相關(guān)癥狀為0分；左側(cè)前肢體不能自由展開為1分；爬行時左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；爬行時向左側(cè)傾倒為3分；喪失意識，不能行走為4分)；②ELISA法檢測術(shù)后28天大鼠血清促炎因子IL-1β、TNF-α和抑炎因子TGF-β1、IL-10含量，具體步驟依據(jù)說明書進(jìn)行；③免疫組化：常規(guī)脫水石蠟包埋，腦切片厚度為5 μm，60℃拷片30 min，酒精水化5 min，加入枸櫞酸鈉行微波法組織抗原修復(fù)，PBS緩沖液沖洗，羊血清封閉，加入一抗NgR1、RhoA和ROCKⅡ 4℃過夜，DAB顯色，檢測大鼠腦組織內(nèi)IL-1β、TNF-α、TGF-β1、IL-10蛋白表達(dá)，使用Image pro plus分析，累積光密度值(IOD)進(jìn)行比較。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以(±s)表示，正態(tài)分布和方差齊性數(shù)據(jù)單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠各時間點體質(zhì)量比較 見表1。假手術(shù)組大鼠隨著時間體質(zhì)量逐漸增大，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠術(shù)后7、14、28天體質(zhì)量明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，NEP1-40組、血塞通組及P+N組大鼠術(shù)后7、14、28天體質(zhì)量顯著上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中P+N組效果最佳。

表1 各組大鼠各時間點體質(zhì)量比較(±s) g

表1 各組大鼠各時間點體質(zhì)量比較(±s) g

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組NEP1-40組血塞通組P+N組n 5 5 5 5 5體質(zhì)量手術(shù)后7天285.46±11.37 145.82±12.09①166.81±9.73②173.59±19.84②175.97±10.26②手術(shù)后14天329.48±23.19 143.72±15.61①209.38±40.65②178.50±20.26②263.51±20.97②手術(shù)后28天411.86±20.51 210.33±40.67①330.71±33.66②273.49±45.22②342.72±30.35②

2.2 各組大鼠各時間點神經(jīng)功能評分比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠術(shù)后7、14、28天神經(jīng)功能評分明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，NEP1-40組、血塞通組及P+N組術(shù)后7、14、28天神經(jīng)功能評分明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠各時間點神經(jīng)功能評分比較(±s) 分

表2 各組大鼠各時間點神經(jīng)功能評分比較(±s) 分

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組N EP1-40組血塞通組P+N組n 5 5 5 5 5手術(shù)后7天0.00±0.00 2.20±0.39①1.16±0.39②1.16±0.38②1.48±0.48②手術(shù)后14天0.00±0.00 1.31±0.48①0.82±0.39②0.81±0.37②0.65±0.48②手術(shù)后28天0.00±0.00 0.99±0.10①0.63±0.37②0.71±0.38②0.61±0.39②

2.3 各組大鼠血清促炎及抑炎因子含量比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量上升，IL-10含量下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，P+N組大鼠血清IL-β1含量下降；NEP1-40組、血塞通組及P+N組TNF-α含量下降，IL-10含量上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠血清促炎及抑炎因子含量比較(±s)

表3 各組大鼠血清促炎及抑炎因子含量比較(±s)

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組NEP1-40組血塞通組P+N組n 5 5 5 5 5 TNF-α(ng/L)9.84±8.43 27.04±9.65①21.10±10.59②20.05±12.88②13.97±9.75②IL-1β(ng/L)6.16±1.78 7.10±1.98 6.69±1.64 6.18±1.25 4.39±1.62②TGF-β1(pg/mL)1 048.20±225.41 1 610.75±159.64①1 649.76±350.19 1 729.52±300.47 1 770.47±70.56 IL-10(pg/mL)17.40±2.89 13.97±2.31①16.62±3.91②18.02±3.67②21.04±9.82②

2.4 各組大鼠腦組織炎癥因子蛋白表達(dá)比較 見表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、TGF-β1蛋白表達(dá)上升，IL-10蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，血塞通組及P+N組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)下降，TGF-β1、IL-10蛋白表達(dá)上升；NEP1-40組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)下降，IL-10蛋白表達(dá)上升；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表4 各組大鼠腦組織炎癥因子蛋白表達(dá)比較(±s) IO D

表4 各組大鼠腦組織炎癥因子蛋白表達(dá)比較(±s) IO D

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組N EP1-40組血塞通組P+N組n 5 5 5 5 5 TN F-α 140 593.61±77 942.19 4 266 971.55±129 472.01①123 475.01±62 097.41②148 005.15±59 712.03②136 972.49±62 003.44②IL-1β 68 102.15±33 204.64 144 029.29±30 227.51①61 749.38±16 007.45②93 157.20±19 473.22②64 397.10±16 201.94②TG F-β1 11 267.91±24 261.30 150 692.55±51 790.62①152 788.55±29 741.32 170 869.40±26 448.29②172 984.53±13 572.92②IL-10 129 872.64±45 117.23 90 572.61±33 472.15①130 578.52±59 723.11②140 159.21±58 423.84②131 454.29±63 752.08②

3 討論

本研究顯示，干預(yù)28天，模型組大鼠大腦皮層TNF-α和IL-1β表達(dá)比假手術(shù)組上升，說明大鼠大腦皮層在梗死進(jìn)展中有TNF-α和IL-1β參加，同時也驗證了其在永久性梗死內(nèi)所產(chǎn)生的負(fù)面影響。相關(guān)研究證明，大鼠腦梗死后會造成IL-1β表達(dá)迅速上升，在大鼠全身或者局部注入IL-1β會使大鼠腦受損程度加深[5～6]。TNF-α在腦梗死發(fā)生前期，其表達(dá)含量比較低，有研究顯示拮抗TNF-α能夠有效降低大鼠腦梗死面積[7]。Tarkowski E等[8]研究顯示，腦梗死患者血清內(nèi)IL-1β含量明顯低于腦脊液內(nèi)，說明梗死大腦可能直接分泌IL-1β并參加腦損傷。另外，劉衛(wèi)芳等[9]研究顯示，腦梗死患者神經(jīng)能力受損狀況與TNF-α和IL-1β上升緊密相關(guān)。IL-10有抑制促炎因子分泌作用，既往研究顯示，腦梗死患者體內(nèi)IL-10含量下降，而且和腦損傷情況呈正相關(guān)，相關(guān)動物實驗也證明了IL-10可使大鼠腦梗死面積下降[10～12]。TGF-β1對缺血性的腦受損也有保護(hù)作用，正常腦組織內(nèi)TGF-β1含量一般較低，腦梗死后血清內(nèi)TGF-β1含量上升，相關(guān)研究顯示拮抗TGF-β1后大鼠受損狀況會加重[13]。

血塞通主要成分是三七總皂苷，多用于胸痹心痛、腦絡(luò)瘀阻、腦血管類疾病和中風(fēng)偏癱等治療，臨床效果較好。唐婧株等[14]研究顯示，三七總皂苷可使腦梗死大鼠上升的IL-8、TNF-α、IL-6和IL-1β含量下降，對血腦屏障受損狀況改善顯著。多數(shù)相關(guān)研究對促炎因子研究較多，而抑炎因子研究較少，本研究表明血塞通可使腦梗死大鼠促炎因子TNF-α及IL-1β含量下降，同時使抑炎因子TGF-β1及IL-10含量上升。Nogo-66氨基酸肽端(Neurite outgrowth inhibitor-66，Nogo-66)為髓鞘抑制因子，它和特異性受體Nogo受體1(Nogo receptor 1，NgR1)親合性最高，NgR1受體為一種GPI錨定蛋白，缺乏胞內(nèi)域，需要借助其他受體形成NgR受體復(fù)合物才可將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi)。Nogo-66和NgR1受體復(fù)合物結(jié)合以后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi)，進(jìn)而激活下游重要通路，造成軸突生長椎塌陷。NEP1-40為Nogo-66受體拮抗劑，可以和NgR1結(jié)合發(fā)揮作用，且不會使下游信號通道激活[15～16]。本研究顯示，血塞通注射液、NEP1-40都可降低促炎因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，升高抑炎因子IL-10和TGF-β1的表達(dá)，而聯(lián)合用藥通過調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)，抑制促炎因子對機(jī)體損傷作用，進(jìn)而發(fā)揮出神經(jīng)保護(hù)作用，效果更佳。

綜上所述，血塞通注射液及NEP1-40是通過調(diào)整促炎、抑炎因子的表達(dá)，來加快腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。

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