陳立加，高卓維，林清，張雙喜

廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院，廣東 順德 528300

近幾年，腫瘤細(xì)胞的程序性壞死備受關(guān)注，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞死亡的主要方式之一，尤其是耐藥腫瘤細(xì)胞有可能通過程序性壞死被清除，程序性壞死有希望作為治療耐藥性腫瘤的新靶標(biāo)。魚藤素是近年來治療腫瘤研究中比較熱門的單體，而SGC7901/VCR細(xì)胞為常用的胃癌耐藥實驗細(xì)胞系[1～2]，本研究團(tuán)隊前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的魚藤素對胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞活力有不同程度的抑制作用。為進(jìn)一步探討魚藤素在胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞耐藥細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性壞死的作用，本研究以胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR為研究對象，進(jìn)行下列實驗。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞，由仇志坤博士饋贈。于南方醫(yī)科大學(xué)實驗室凍存復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)。

1.2 試驗藥物 魚藤素由仇志坤博士饋贈，由瑞士ALEXIS公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號：ALX350－118-M025)，純度為95.6%。用二甲基亞砜(DMSO)溶解配成10 mmol/L的儲存液，等量分裝，－20℃保存，使用前用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成各種濃度。

1.3 試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清(美國HyClone公司)；H-7650型透射電鏡(日本Hitachi公司)。

1.4 分組及給藥 將人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置對照組(Control)、魚藤素12 h組、魚藤素24 h組，魚藤素的濃度為250 μg/mL。

1.5 Hoechst/PI雙染熒光顯微鏡觀察胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR的凋亡與壞死 將5×108個的胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞種入6孔板，貼壁生長12 h后加入250 μg/mL濃度的魚藤素，繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h，然后用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1 mL 4%多聚甲醛4℃固定細(xì)胞10 min。棄固定液，再用冷PBS洗2遍，滴加150 μL Hoechst33342工作液和75 μL PI工作液(原液稀釋10倍)，室溫避光染色10 min，在相應(yīng)波長激發(fā)熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)并拍照記錄。藍(lán)色熒光和紅色熒光分別表示細(xì)胞凋亡和壞死。

1.6 透射電鏡觀察人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 將5×108個的人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞種入6孔板，貼壁生長12 h后加入250 μg/mL濃度的魚藤素(根據(jù)前期預(yù)實驗摸索出來的濃度)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h，用PBS洗滌2次后，棄上清，加1 mL 2.5%戊二酸懸浮細(xì)胞，移入1.5 mL EP管中，室溫下4 000 r/min離心15 min，固定細(xì)胞1 h；在PBS里漂洗1 h將戊二酸洗凈，用1%的鋨酸固定液固定30 min。梯度脫水：50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，90%乙醇10 min，90%丙酮10 min，100%丙酮3次各10 min。丙酮與環(huán)氧樹脂1∶1包埋2 h，再放入純包埋劑過夜。置62℃烤箱2天，進(jìn)行超薄切片，用醋酸鉛鈾雙染法進(jìn)行切片染色。在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的變化，照相并記錄實驗結(jié)果。

1.7 流式細(xì)胞計數(shù)法檢測人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞凋亡與壞死 將5×108個的人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞種入6孔板，貼壁生長12 h后加入加入250 μg/mL濃度的魚藤素，繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h，使用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為6×108個/mL，轉(zhuǎn)移至離心管，1 500 r/min離心10 min。去上清，PBS漂洗、離心2次后，用150 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入10 μLAnnexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶(PI)輕輕混勻，避光37℃反應(yīng)15 min，加入200 μL結(jié)合緩沖液后，立即用流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.8 Western blot檢測RIP1和RIP3蛋白表達(dá) 采用Western blot檢測細(xì)胞壞死信號通路激活中關(guān)鍵蛋白RIP1和RIP3。將8×108的胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞種入6孔板，貼壁生長12 h后加入250 μg/mL濃度的魚藤素，繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h，用冰冷PBS洗滌2遍，加入100 μL冰冷的RIPA裂解液(含1 mmol/LPMSF)，冰上震蕩30 min，收集裂解液，4℃，10 000轉(zhuǎn)離心10 min，收集上清。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford法對上清進(jìn)行蛋白定量。取30 μg蛋白樣品，12%SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)2 h至硝酸纖維素薄膜(0.45 μm PVDF)，放入5%牛奶封閉液中封閉1 h；RIP3或RIP1抗體4℃過夜。反復(fù)洗膜3次，將膜與堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)標(biāo)記的抗IgG抗體孵育，室溫輕搖1 h，洗膜后，加入ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)中曝光，用圖像分析測定各帶吸光度(A)值作定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包分析，計量資料以(±s)表示，組間兩兩比較采用Dunnett分析，多組間比較采用方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst/PI雙染色法熒光顯微鏡觀察 見圖1。與對照組比較，魚藤素12h組、魚藤素24 h組出現(xiàn)大量紅色壞死細(xì)胞，魚藤素組細(xì)胞壞死率明顯高于對照組細(xì)胞，凋亡率無顯著差異。

圖1 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞不同時間點凋亡和壞死結(jié)果

2.2 透射電鏡觀察人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化見圖2。為了驗證魚藤素對人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞壞死的誘導(dǎo)作用，我們采用透射電鏡檢測了細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。對照組細(xì)胞形態(tài)無明顯病理改變，魚藤素處理組可見一些細(xì)胞胞體變小、胞漿致密化，胞質(zhì)濃縮并呈空泡化，細(xì)胞核腫脹外突，或細(xì)胞核內(nèi)吞，染色質(zhì)凝聚成塊，核膜周邊聚集形成大量壞死小體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變疏松，線粒體結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞膜不完整。以上結(jié)果提示魚藤素可誘導(dǎo)人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞出現(xiàn)程序性壞死。

2.3 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞凋亡與壞死的結(jié)果比較 見圖3、表1。與對照組比較，魚藤素12 h組、魚藤素24 h組細(xì)胞凋亡率無顯著差異；細(xì)胞壞死率顯著升高(P＜0.05)；且隨著時間梯度增加細(xì)胞壞死率逐漸增多(P＜0.05)。

圖2 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

圖3 魚藤素250 μg/mL對人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞壞死的影響

表1 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞壞死的結(jié)果比較(±s)

表1 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞壞死的結(jié)果比較(±s)

與對照組比較，①P＜0.05；與魚藤素12 h組比較，②P＜0.05

組 別對照組魚藤素12 h組魚藤素24 h組壞死比例(%)15.88±0.76 29.89±1.89①48.54±3.48①②

2.4 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞的RIP1、RIP3蛋白表達(dá)比較 見圖4。與對照組比較，魚藤素12 h組細(xì)胞中RIP1和RIP3的蛋白表達(dá)水平有所增加，魚藤素24 h組顯著上升，提示魚藤素可能通過調(diào)控RIP1與RIP3的表達(dá)誘導(dǎo)胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞壞死。

圖4 250 μg/mL魚藤素12 h、24 h對人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞RIP1和RIP3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前，胃癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，化療是中晚期胃癌的重要治療手段。但臨床化療的主要障礙是腫瘤耐藥，它與細(xì)胞表面藥泵蛋白高表達(dá)介導(dǎo)的多藥耐藥及細(xì)胞凋亡通路被阻斷有關(guān)。而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死是成為逆轉(zhuǎn)多種腫瘤耐藥的潛在途徑[3]。程序性壞死是一種不依賴含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的可調(diào)控程序性細(xì)胞死亡途徑，具有與壞死相同的形態(tài)學(xué)特征及與凋亡相似的分子生物學(xué)特點。程序性壞死可能加速腫瘤細(xì)胞死亡或增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤治療的敏感性，從而在腫瘤靶向治療中發(fā)揮重要作用[4～6]。

細(xì)胞的程序性壞死由腫瘤壞死因子受體家族以及Toll-like的受體家族啟動，并通過和受體蛋白互作的兩個蛋白激酶RIP1和RIP3傳遞死亡信號[7～8]。受體相互作用蛋白1/3(receptorinteracting protein1/3，RIP1/3)是RIP家族的兩個重要成員，是程序性壞死通路中的關(guān)鍵信號分子，該通路參與多種生理病理途徑，包括生長發(fā)育、組織損傷、抗病毒免疫、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[9]。RIP可以通過激活核因子κB、腫瘤壞死因子等信號通路，調(diào)控細(xì)胞程序性壞死，是細(xì)胞壞死與凋亡相互轉(zhuǎn)換的分子開關(guān)[10～11]。RIP1的磷酸化和泛素化修飾作用決定了RIP1在促進(jìn)細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡的信號通路中起樞紐作用，并且RIP1激酶活化后募集RIP3，通過RIP同型相互作用基序相互作用形成淀粉樣信號復(fù)合物即壞死小體[12～14]。RIP1與RIP3的相互作用導(dǎo)致RIP3磷酸化，RIP3的二聚化也能使RIP3自磷酸化和MLKL活化導(dǎo)致細(xì)胞壞死[15]，研究證明，細(xì)胞程序性壞死(necrosis)同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及臨床的治療有著緊密的聯(lián)系[16～18]。

細(xì)胞增殖活性的抑制作用是篩選腫瘤誘導(dǎo)分化劑的基本指標(biāo)。因此筆者前期進(jìn)行了預(yù)實驗，篩選了不同藥物，發(fā)現(xiàn)魚藤素在不同濃度對胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞活力有不同程度的抑制作用且呈時間和濃度依賴性。因此，本項目以魚藤素為干預(yù)藥物進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，與對照組比較，魚藤素組細(xì)胞可見大量壞死細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率無明顯差異，但壞死率顯著升高(P＜0.05)。透射電鏡檢測發(fā)現(xiàn)，魚藤素組細(xì)胞可見細(xì)胞核腫脹外突，染色質(zhì)染色質(zhì)凝聚成塊，核膜周邊聚集形成大量壞死小體。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)魚藤素能增加細(xì)胞中RIP1和RIP3的蛋白表達(dá)水平。綜上所述，本研究提示魚藤素作用于人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞后，可誘導(dǎo)其出現(xiàn)細(xì)胞程序性壞死。

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