陳立加,高卓維,林清,張雙喜
廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院,廣東 順德 528300
近幾年,腫瘤細(xì)胞的程序性壞死備受關(guān)注,被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞死亡的主要方式之一,尤其是耐藥腫瘤細(xì)胞有可能通過程序性壞死被清除,程序性壞死有希望作為治療耐藥性腫瘤的新靶標(biāo)。魚藤素是近年來治療腫瘤研究中比較熱門的單體,而SGC7901/VCR細(xì)胞為常用的胃癌耐藥實驗細(xì)胞系[1~2],本研究團(tuán)隊前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的魚藤素對胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞活力有不同程度的抑制作用。為進(jìn)一步探討魚藤素在胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞耐藥細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性壞死的作用,本研究以胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR為研究對象,進(jìn)行下列實驗。
1.1 細(xì)胞系 人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞,由仇志坤博士饋贈。于南方醫(yī)科大學(xué)實驗室凍存復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)。
1.2 試驗藥物 魚藤素由仇志坤博士饋贈,由瑞士ALEXIS公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號:ALX350-118-M025),純度為95.6%。用二甲基亞砜(DMSO)溶解配成10 mmol/L的儲存液,等量分裝,-20℃保存,使用前用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋成各種濃度。
1.3 試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清(美國HyClone公司);H-7650型透射電鏡(日本Hitachi公司)。
1.4 分組及給藥 將人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置對照組(Control)、魚藤素12 h組、魚藤素24 h組,魚藤素的濃度為250 μg/mL。
1.5 Hoechst/PI雙染熒光顯微鏡觀察胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR的凋亡與壞死 將5×108個的胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞種入6孔板,貼壁生長12 h后加入250 μg/mL濃度的魚藤素,繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h,然后用冷PBS洗滌細(xì)胞2次,加入1 mL 4%多聚甲醛4℃固定細(xì)胞10 min。棄固定液,再用冷PBS洗2遍,滴加150 μL Hoechst33342工作液和75 μL PI工作液(原液稀釋10倍),室溫避光染色10 min,在相應(yīng)波長激發(fā)熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)并拍照記錄。藍(lán)色熒光和紅色熒光分別表示細(xì)胞凋亡和壞死。
1.6 透射電鏡觀察人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 將5×108個的人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞種入6孔板,貼壁生長12 h后加入250 μg/mL濃度的魚藤素(根據(jù)前期預(yù)實驗摸索出來的濃度),繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h,用PBS洗滌2次后,棄上清,加1 mL 2.5%戊二酸懸浮細(xì)胞,移入1.5 mL EP管中,室溫下4 000 r/min離心15 min,固定細(xì)胞1 h;在PBS里漂洗1 h將戊二酸洗凈,用1%的鋨酸固定液固定30 min。梯度脫水:50%乙醇10 min,70%乙醇10 min,90%乙醇10 min,90%丙酮10 min,100%丙酮3次各10 min。丙酮與環(huán)氧樹脂1∶1包埋2 h,再放入純包埋劑過夜。置62℃烤箱2天,進(jìn)行超薄切片,用醋酸鉛鈾雙染法進(jìn)行切片染色。在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核的變化,照相并記錄實驗結(jié)果。
1.7 流式細(xì)胞計數(shù)法檢測人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞凋亡與壞死 將5×108個的人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞種入6孔板,貼壁生長12 h后加入加入250 μg/mL濃度的魚藤素,繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h,使用0.25%胰酶消化細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為6×108個/mL,轉(zhuǎn)移至離心管,1 500 r/min離心10 min。去上清,PBS漂洗、離心2次后,用150 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入10 μLAnnexin V-FITC和5 μL的碘化丙啶(PI)輕輕混勻,避光37℃反應(yīng)15 min,加入200 μL結(jié)合緩沖液后,立即用流式細(xì)胞儀檢測分析。
1.8 Western blot檢測RIP1和RIP3蛋白表達(dá) 采用Western blot檢測細(xì)胞壞死信號通路激活中關(guān)鍵蛋白RIP1和RIP3。將8×108的胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞種入6孔板,貼壁生長12 h后加入250 μg/mL濃度的魚藤素,繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h,用冰冷PBS洗滌2遍,加入100 μL冰冷的RIPA裂解液(含1 mmol/LPMSF),冰上震蕩30 min,收集裂解液,4℃,10 000轉(zhuǎn)離心10 min,收集上清。以BSA為標(biāo)準(zhǔn),用Bradford法對上清進(jìn)行蛋白定量。取30 μg蛋白樣品,12%SDS-PAGE電泳,100 V轉(zhuǎn)2 h至硝酸纖維素薄膜(0.45 μm PVDF),放入5%牛奶封閉液中封閉1 h;RIP3或RIP1抗體4℃過夜。反復(fù)洗膜3次,將膜與堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)標(biāo)記的抗IgG抗體孵育,室溫輕搖1 h,洗膜后,加入ECL發(fā)光液,凝膠成像系統(tǒng)中曝光,用圖像分析測定各帶吸光度(A)值作定量分析。
1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包分析,計量資料以(±s)表示,組間兩兩比較采用Dunnett分析,多組間比較采用方差分析,計數(shù)資料采用χ2檢驗。
2.1 Hoechst/PI雙染色法熒光顯微鏡觀察 見圖1。與對照組比較,魚藤素12h組、魚藤素24 h組出現(xiàn)大量紅色壞死細(xì)胞,魚藤素組細(xì)胞壞死率明顯高于對照組細(xì)胞,凋亡率無顯著差異。
圖1 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞不同時間點凋亡和壞死結(jié)果
2.2 透射電鏡觀察人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化見圖2。為了驗證魚藤素對人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞壞死的誘導(dǎo)作用,我們采用透射電鏡檢測了細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。對照組細(xì)胞形態(tài)無明顯病理改變,魚藤素處理組可見一些細(xì)胞胞體變小、胞漿致密化,胞質(zhì)濃縮并呈空泡化,細(xì)胞核腫脹外突,或細(xì)胞核內(nèi)吞,染色質(zhì)凝聚成塊,核膜周邊聚集形成大量壞死小體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變疏松,線粒體結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞膜不完整。以上結(jié)果提示魚藤素可誘導(dǎo)人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞出現(xiàn)程序性壞死。
2.3 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞凋亡與壞死的結(jié)果比較 見圖3、表1。與對照組比較,魚藤素12 h組、魚藤素24 h組細(xì)胞凋亡率無顯著差異;細(xì)胞壞死率顯著升高(P<0.05);且隨著時間梯度增加細(xì)胞壞死率逐漸增多(P<0.05)。
圖2 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)
圖3 魚藤素250 μg/mL對人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞壞死的影響
表1 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞壞死的結(jié)果比較(±s)
表1 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞壞死的結(jié)果比較(±s)
與對照組比較,①P<0.05;與魚藤素12 h組比較,②P<0.05
組 別對照組魚藤素12 h組魚藤素24 h組壞死比例(%)15.88±0.76 29.89±1.89①48.54±3.48①②
2.4 各組胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞的RIP1、RIP3蛋白表達(dá)比較 見圖4。與對照組比較,魚藤素12 h組細(xì)胞中RIP1和RIP3的蛋白表達(dá)水平有所增加,魚藤素24 h組顯著上升,提示魚藤素可能通過調(diào)控RIP1與RIP3的表達(dá)誘導(dǎo)胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞壞死。
圖4 250 μg/mL魚藤素12 h、24 h對人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞RIP1和RIP3蛋白表達(dá)的影響
目前,胃癌是臨床常見的惡性腫瘤之一,化療是中晚期胃癌的重要治療手段。但臨床化療的主要障礙是腫瘤耐藥,它與細(xì)胞表面藥泵蛋白高表達(dá)介導(dǎo)的多藥耐藥及細(xì)胞凋亡通路被阻斷有關(guān)。而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性壞死是成為逆轉(zhuǎn)多種腫瘤耐藥的潛在途徑[3]。程序性壞死是一種不依賴含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的可調(diào)控程序性細(xì)胞死亡途徑,具有與壞死相同的形態(tài)學(xué)特征及與凋亡相似的分子生物學(xué)特點。程序性壞死可能加速腫瘤細(xì)胞死亡或增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤治療的敏感性,從而在腫瘤靶向治療中發(fā)揮重要作用[4~6]。
細(xì)胞的程序性壞死由腫瘤壞死因子受體家族以及Toll-like的受體家族啟動,并通過和受體蛋白互作的兩個蛋白激酶RIP1和RIP3傳遞死亡信號[7~8]。受體相互作用蛋白1/3(receptorinteracting protein1/3,RIP1/3)是RIP家族的兩個重要成員,是程序性壞死通路中的關(guān)鍵信號分子,該通路參與多種生理病理途徑,包括生長發(fā)育、組織損傷、抗病毒免疫、炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[9]。RIP可以通過激活核因子κB、腫瘤壞死因子等信號通路,調(diào)控細(xì)胞程序性壞死,是細(xì)胞壞死與凋亡相互轉(zhuǎn)換的分子開關(guān)[10~11]。RIP1的磷酸化和泛素化修飾作用決定了RIP1在促進(jìn)細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡的信號通路中起樞紐作用,并且RIP1激酶活化后募集RIP3,通過RIP同型相互作用基序相互作用形成淀粉樣信號復(fù)合物即壞死小體[12~14]。RIP1與RIP3的相互作用導(dǎo)致RIP3磷酸化,RIP3的二聚化也能使RIP3自磷酸化和MLKL活化導(dǎo)致細(xì)胞壞死[15],研究證明,細(xì)胞程序性壞死(necrosis)同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及臨床的治療有著緊密的聯(lián)系[16~18]。
細(xì)胞增殖活性的抑制作用是篩選腫瘤誘導(dǎo)分化劑的基本指標(biāo)。因此筆者前期進(jìn)行了預(yù)實驗,篩選了不同藥物,發(fā)現(xiàn)魚藤素在不同濃度對胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞活力有不同程度的抑制作用且呈時間和濃度依賴性。因此,本項目以魚藤素為干預(yù)藥物進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,與對照組比較,魚藤素組細(xì)胞可見大量壞死細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率無明顯差異,但壞死率顯著升高(P<0.05)。透射電鏡檢測發(fā)現(xiàn),魚藤素組細(xì)胞可見細(xì)胞核腫脹外突,染色質(zhì)染色質(zhì)凝聚成塊,核膜周邊聚集形成大量壞死小體。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)魚藤素能增加細(xì)胞中RIP1和RIP3的蛋白表達(dá)水平。綜上所述,本研究提示魚藤素作用于人胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞后,可誘導(dǎo)其出現(xiàn)細(xì)胞程序性壞死。
[1]陳玲,陳凱,楊錫貴,等.HOXD10基因轉(zhuǎn)染對人胃癌耐藥SGC7901/VCR細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2016,25(1):9-15.
[2]戴金鋒,呂賓,俞瑾,等.溫郁金正丁醇提取物逆轉(zhuǎn)胃癌SGC7901/VCR細(xì)胞多藥耐藥性的研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2014,29(11):3623-3626.
[3]鄧秀文,鄒文.誘導(dǎo)程序性壞死以規(guī)避腫瘤細(xì)胞耐藥的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2014,19(5):460-464.
[4]Horita H,F(xiàn)rankel AE,Thorburn A.Acute Myeloid Leukemia-Targe ted Toxin Activates Both Apoptotic and Necroptotic Death Mechanisms[J].PLoS One,2008,3(12):836.
[5]Han W,Ling L,Shuang Q,et al.Shikonin circumvents cancer drug resistance by induction of a necroptotic death[J].Molecular Cancer Therapeutics,2007,6(5):1641-1649.
[6]Nehs MA, Lin CI, Kozono DE, et al.Necroptosis is a novel mechanism of radiation-induced cell death in anaplastic thyroid and adrenocortical cancers[J].Surgery, 2011, 150(6):1032-1039.
[7]He S,Wang L,Miao L,et al.Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha[J].Cell,2009,137(6):1100-1111.
[8]Zhang DW, Shao J, Lin J, et al.RIP3, an Energy metabolism regulator that switches TNF-Induced cell death from apoptosis to necrosis[J].Science, 2009, 325(5938):332-336.
[9]Meylan E,Tschopp J.The RIP kinases:crucial integrators of cellular stress[J].Trends in Biochemical Sciences,2005,30(3):151-159.
[10]Moriwaki K,Chan FK.Necrosis-Dependent and Independent Signaling of the RIP kinases in Inflammation[J].Cytokine&Growth Factor Reviews,2014,25(2):167-174.
[11]Khan N,Lawlor KE,Murphy JM,et al. More to life than death:molecular determinants of necroptotic and nonnecroptotic RIP3 kinase signaling[J].Current Opinion in Immunology,2014,26:76-89.
[12]Zhang D,Lin J,Han J.Receptor-interacting protein(RIP)kinase family[J].Cellular&Molecular Immunology,2010,7(4):243-249.
[13]Chavezvaldez R, Martin LJ, Northington FJ.Programmed necrosis:a prominent mechanism of cell death following neonatal brain injury[J].Neurology Research International,2012,2012:257563.
[14]Li J, Mcquade T, Siemer AB, et al.The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis[J].Cell,2012,150(2):339-350.
[15]Cook WD,Moujalled DM,Ralph TJ,et al.RIPK1-and RIPK3-induced cell death mode is determined by target availability[J].Cell Death&Differentiation,2014,21(10):1600-1612.
[16]Horita H,F(xiàn)rankel AE,Thorburn A.Acute myeloid leukemiatargeted toxin activates both apoptotic and necroptotic death mechanisms[J].PLoS One,2008,3(12):836.
[17]Han W,Ling L,Shuang Q,et al.Shikonin circumvents cancer drug resistance by induction of a necroptotic death[J].Molecular Cancer Therapeutics,2007,6(5):1641-1649.
[18]Nehs MA, Lin CI, Kozono DE, et al.Necroptosis is a novel mechanism of radiation-induced cell death in anaplastic thyroid and adrenocortical cancers[J].Surgery, 2011, 150(6):1032-1039.