張廣玉，張玉峰，汪偉，王宇亮，孫曉娜，牛學(xué)恩，黨中勤

河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002

肝內(nèi)膽汁淤積屬中醫(yī)黃疸范疇，是一種部分或全部膽汁流出阻滯的綜合癥[1～2]。臨床主要表現(xiàn)為黃疸，以目睛黃染為重要特征，早期表現(xiàn)為血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)和谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Glutamyl transpeptidase，GGT)水平升高，進(jìn)而出現(xiàn)高膽紅素血癥，皮膚瘙癢，常伴有輕微的消化道癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝衰竭甚至死亡[3]。其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，一般認(rèn)為包括感染、代謝、免疫以及遺傳等，但目前為止尚未完全清楚。研究顯示，肝內(nèi)膽汁淤積主要是致病因子導(dǎo)致的毛細(xì)膽管和肝細(xì)胞器損傷，阻礙膽汁的排泌，使毛細(xì)膽管內(nèi)膽栓形成[4]。

利膽退黃湯摘錄于《古今名方》，由茵陳、敗醬草、板藍(lán)根、玉米須各30 g、梔子10 g、郁金12 g、金錢草60 g組成，主要用于清熱利濕，利膽疏肝，為傳統(tǒng)中藥方劑?，F(xiàn)代研究顯示，茵陳能增加膽汁中膽紅素等的排泄；梔子具有保肝作用，既可以加速血液中膽紅素的代謝，又可以提高葡萄糖脫氫酶的活力；敗醬草、金錢草、板藍(lán)根等對(duì)膽汁分泌與排泄具有一定的促進(jìn)作用，諸藥并用，共奏利膽退黃之功[5～6]。臨床觀察與實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，利膽退黃湯可以調(diào)節(jié)毛細(xì)膽管的功能狀態(tài)，明顯改善肝細(xì)胞對(duì)膽紅素的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)膽汁的排泄[7～8]。

鈉離子-?；悄懰釁f(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(Sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)主要介導(dǎo)結(jié)合膽汁酸的攝取，膽汁酸鹽輸出泵(BSEP)主要使膽汁酸經(jīng)肝細(xì)胞膽小管排入毛細(xì)膽管[9]。研究證明，高膽汁鹽濃度可降低NTCP的表達(dá)，發(fā)生肝內(nèi)膽汁淤積時(shí)，膽汁鹽濃度升高可導(dǎo)致NTCP表達(dá)的下調(diào)，而上調(diào)BSEP蛋白水平的表達(dá)，可促進(jìn)膽汁酸的代謝，避免肝臟受損。因此，當(dāng)肝細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)生改變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞攝取功能或轉(zhuǎn)運(yùn)功能的失常，進(jìn)而引起膽汁淤積，而膽汁酸對(duì)肝細(xì)胞膜、線粒體等產(chǎn)生損傷[10]，引起肝細(xì)胞損傷及肝功能異常。因此，本研究以ANIT制備肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型，通過分析大鼠血清指標(biāo)、肝臟組織中NTCP、BSEP蛋白表達(dá)，探討利膽退黃湯對(duì)膽汁淤積型黃疸大鼠的療效及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠48只，體質(zhì)量(210±10)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0009，飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫保持21～25℃，試驗(yàn)期間自由飲水、進(jìn)食。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 利膽退黃湯由茵陳、敗醬草、板藍(lán)根、玉米須各30 g、梔子10 g、郁金12 g、金錢草60 g組成，由河南省中醫(yī)院制劑中心提供，提取物濃縮至含生藥0.84 g/mL，備用。茵梔黃顆粒(魯南厚普制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z20030028)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 a-萘異硫氰酸鹽(ANIT)(美國Sigma公司)，大鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、直接膽紅素(DBil)、總膽紅素(TBil)和總膽汁酸(TBA)試劑盒(購于南京建成生物研究所)，總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒(購自中國北京鼎國生物技術(shù)有限公司)，NTCP、BSEP、p-actin—抗、二抗試劑盒(購自英國Abeam公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 CX7型全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(美國Beakman)，Blofuge28RS型高速冷凍離心機(jī)(德國賀利氏集團(tuán)公司)，RM2235型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(德國徠卡公司)，LEITDM型倒置熒光顯微鏡(德國徠卡)，F(xiàn)LUOR plus型多功能酶標(biāo)儀(瑞典Tecan公司)，stepone Plus型熒光定量PCR儀(美國ABI公司，olympus BX-51型病理圖像采集系統(tǒng)(日本奧林巴斯公司)，AEL-160電子分析天平(日本島津公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分成6組：對(duì)照組，模型組，陽性藥組，利膽退黃湯低、中、高劑量組，每組8只。

2.2 模型制備 ANIT溶于植物油中，濃度為2.0%。禁食12 h后，除對(duì)照組外，其余5組均一次性灌胃ANIT溶液(5 mL/kg)造模[11]，誘發(fā)大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積病變。造模48 h后，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利膽退黃湯低、中、高劑量組給藥量分別是10、20、40 g/(kg·d)，陽性藥組給予茵梔黃顆粒1.6 g/kg灌胃，同時(shí)對(duì)照組和模型組每天給予生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥7天。給藥7天后，禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采集膽汁、血液及肝臟組織。

2.3 大鼠血清學(xué)指標(biāo)ALT、ALP、γ-GT、TBil、DBil、TBA檢測(cè) 將采集血液置于離心管內(nèi)，靜置冰盒中6 h，低溫條件下以4 000 r/min離心15 min，取血清。采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清 ALT、ALP、AST、γ-GT、DBil、TBil及TBA。

2.4 大鼠肝臟組織中NTCP、BSEP蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用熒光定量檢測(cè)法檢測(cè)大鼠肝臟組織中NTCP、BSEP蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)：將冷凍肝臟組織置于預(yù)冷的研缽中，充分研磨成粉末狀，按Trizol試劑盒操作方法提取肝組織總RNA。按照試劑盒說明書，用提取的總RNA進(jìn)行cDNA第一鏈合成，再用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為50 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 2 min，(94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃再延伸2 min)，完成30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，獲得基因片段，分析各自表達(dá)結(jié)果。NTCP上游引物5'-CGTGCTTGTGGAAGAACCAG-3'，下游引物5'-CGGAATCA GCAAGGCACTCG-3'，片段長度190 bp；BSEP上游引物5'-TGAGCTAGTGTACGAAGCAC-3'，下游引物5'-CGAACTCAGG CAAGCACCGC-3'，片段長度132 bp。

2.5 大鼠肝臟組織病理切片 取肝臟組織約1 cm3小塊，用4%多聚甲醛固定，洗去固定液，梯度酒精進(jìn)行脫水，用二甲苯透明，再置于溶化的石蠟包埋，用石蠟切片機(jī)將組織切成厚度為5 mm的薄片。取薄片先用二甲苯脫蠟，再用蘇木精溶液進(jìn)行染色，透明后加蓋玻片封固，置于顯微鏡下觀察組織病理變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組比較采用LSD法進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(±s)表示。

3 結(jié)果

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較±s)

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較±s)

與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與陽性藥組比較，③P＜0.05

組 別對(duì)照組模型組陽性藥組利膽退黃湯低劑量組利膽退黃湯中劑量組利膽退黃湯高劑量組n 8 8 8 8 8 8 A LT(U/L)39.99±8.42 89.41±12.16①50.76±8.54 58.32±9.47②51.72±8.39②42.35±8.41②③A ST(U/L)40.27±7.44 83.86±12.72①49.87±19.43 58.36±10.31②47.25±11.84②43.59±9.22②③A LP(U/L)136.35±11.38 240.73±20.41①167.03±17.88 169.11±15.91②152.57±13.85②148.42±11.76②③γ-GT(U/L)20.66±4.71 52.34±6.04①33.27±5.73 31.24±7.52②25.06±6.62②③22.87±4.01②③TBil(μmol/L)3.59±1.54 10.01±1.98①6.36±1.27 4.83±1.11②③4.53±1.26②③4.08±1.07②③TBA(μmol/L)8.41±2.16 32.70±3.35①20.18±3.72 12.63±3.26②③11.51±3.30②③10.12±2.27②③D Bil(μmol/L)2.61±1.73 7.64±1.36①4.75±0.98 4.18±1.09②3.36±0.88②③3.19±1.01②③

3.1 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil、TBA水平均顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，利膽退黃湯低、中、高劑量組血清ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil、TBA顯著降低(P＜0.05)；與陽性藥組比較，利膽退黃湯高劑量組血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil、TBA水平顯著降低(P＜0.05)。

3.2 各組大鼠肝組織病理觀察結(jié)果比較 見圖1。對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索呈放射狀排列，大小均勻，肝竇不擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞完整，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞無變性、壞死，核深染、核膜完整；模型組大鼠可見肝細(xì)胞腫大，排列無序不規(guī)整，顯點(diǎn)狀或灶性壞死，輪廓不清，膽管上皮細(xì)胞增生，肝竇變大，可見大量炎細(xì)胞浸潤；與模型組比較，陽性藥組大鼠肝組織炎細(xì)胞浸潤減少，未見脂肪細(xì)胞，肝組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)恢復(fù)較好，肝細(xì)胞腫脹緩解，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見，肝竇正常；利膽退黃湯低、中、高劑量組大鼠肝組織病理炎細(xì)胞浸潤和脂肪細(xì)胞減少，肝細(xì)胞腫脹明顯改善，肝細(xì)胞排列比較規(guī)整，細(xì)胞大小大致相等；與模型組比較，利膽退黃湯低劑量組大鼠肝組織中細(xì)胞清晰可見，腫脹減輕，炎細(xì)胞浸潤減少，內(nèi)皮細(xì)胞較正常；與利膽退黃湯低劑量組比較，利膽退黃湯中劑量組大鼠肝組織病理改善明顯；與利膽退黃湯中劑量組比較，利膽退黃湯高劑量組大鼠肝組織病理改善較明顯；與陽性藥組比較，利膽退黃湯高劑量組大鼠肝組織病理改善較明顯。

圖1 各組大鼠肝組織病理切片(×400)

3.3 各組大鼠肝臟組織中NTCP、BSEP蛋白及mRNA表達(dá)見表2。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟組織中NTCP、BSEP蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，利膽退黃湯低、中、高劑量組大鼠肝組織中NTCP、BSEP蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與陽性藥組比較，利膽退黃湯高劑量組大鼠肝組織中NTCP蛋白表達(dá)和NTCP mRNA表達(dá)明顯升高，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而BSEP蛋白表達(dá)和BSEP mRNA表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)；利膽退黃湯低、中、高劑量組兩兩相比可知，高劑量效果明顯優(yōu)于低劑量，NTCP、BSEP蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)具有一定的劑量依賴。

表2 各組大鼠肝臟中NTCP、BSEP蛋白及mRNA表達(dá)(±s)

表2 各組大鼠肝臟中NTCP、BSEP蛋白及mRNA表達(dá)(±s)

與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與陽性藥組比較，③P＜0.05

組 別對(duì)照組模型組陽性藥組利膽退黃湯低劑量組利膽退黃湯中劑量組利膽退黃湯高劑量組n 8 8 8 8 8 8 NTCP蛋白3.268±0.133 1.792±0.107①6.118±0.117 4.031±0.142②③6.148±0.216②9.232±0.192②③NTCPmRNA 0.997±0.004 0.699±0.073①1.174±0.044 1.222±0.037②1.368±0.092②1.471±0.060②③BSEP蛋白2.673±0.062 1.049±0.055①2.916±0.026 2.451±0.049②2.539±0.051②2.617±0.046②BSEPmRNA 1.001±0.007 0.579±0.064①0.982±0.078 0.773±0.052②0.835±0.030②0.955±0.055②

4 討論

肝內(nèi)膽汁淤積是一種膽汁生成、分泌或排泄障礙產(chǎn)生的臨床綜合癥，主要是由膽汁酸、膽紅素等在肝臟、血液等組織內(nèi)聚集，影響脂肪和脂溶性維生素的吸收造成。TBA是膽汁中一類膽烷酸的總稱，可以促進(jìn)脂類的消化與吸收，當(dāng)肝內(nèi)膽汁淤積時(shí)，膽汁酸的腸肝循環(huán)被破壞，就會(huì)導(dǎo)致高血清膽汁酸。

TBA對(duì)肝病具有較高的特異性，尤其是在黃疸消退等方面具有重要的參考價(jià)值。ALT主要分布在肝臟等組織中，肝內(nèi)膽汁淤積時(shí)，肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、壞死等損傷[11～14]。ALP是含鋅蛋白，屬于膜結(jié)合性酶，主要分布于肝臟中，當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，ALP就會(huì)明顯升高，一般ALP的升高主要與肝內(nèi)膽汁淤積、骨病及腫瘤相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模后病理切片大鼠可見肝細(xì)胞腫大，排列無序不規(guī)整，顯點(diǎn)狀或灶性壞死，輪廓不清，膽管上皮細(xì)胞增生，肝竇變大，大量炎細(xì)胞浸潤，說明本實(shí)驗(yàn)中膽淤積動(dòng)物模型造模成功。給藥7天后利膽退黃湯3組大鼠血清ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil、TBA水平均呈現(xiàn)顯著降低，說明利膽退黃湯治療對(duì)血清膽紅素和膽汁酸的恢復(fù)效果明顯，能夠很好的改善肝功能；HE染色顯示大鼠肝組織病理炎細(xì)胞浸潤和脂肪細(xì)胞減少，肝細(xì)胞腫脹明顯改善，肝細(xì)胞排列比較規(guī)整，細(xì)胞大小大致相等，可以看出，利膽退黃湯能在不同程度上減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞具有一定的修復(fù)作用，對(duì)肝內(nèi)膽汁淤積的治療有效。與陽性藥組比較，利膽退黃湯高劑量組血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil、TBA水平顯著降低，表明利膽退黃湯在降低血清指標(biāo)方面的療效優(yōu)于茵梔黃顆粒。

NTCP主要介導(dǎo)結(jié)合膽汁酸的攝取，只在肝臟中表達(dá)。研究表明，高膽汁鹽濃度降低NTCP的表達(dá)，發(fā)生肝內(nèi)膽汁淤積時(shí)，膽汁鹽濃度升高可導(dǎo)致NTCP表達(dá)的下調(diào)[15～16]。BSEP是一種介導(dǎo)膽汁酸鹽分泌的肝臟特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白，是膽汁鹽肝腸循環(huán)的主要驅(qū)動(dòng)力[17～18]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟組織中NTCP、BSEP蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)均明顯降低，提示ANIT可能通過抑制NTCP、BSEP的表達(dá)，阻礙膽汁酸代謝，進(jìn)而誘發(fā)肝內(nèi)膽汁淤積，造成肝組織細(xì)胞的損傷。利膽退黃湯低、中、高劑量組大鼠肝組織中NTCP、BSEP蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)均明顯升高，提示利膽退黃湯可能是通過上調(diào)NTCP、BSEP的表達(dá)，提高肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸的攝取、排泄，來保護(hù)肝細(xì)胞，以緩解肝內(nèi)膽汁淤積病變。利膽退黃湯高劑量組NTCP蛋白表達(dá)和NTCP mRNA表達(dá)明顯高于陽性藥組，同時(shí)高劑量組BSEP蛋白表達(dá)和BSEP mRNA表達(dá)無差異性；利膽退黃湯低、中、高劑量組兩兩相比可知，高劑量效果明顯優(yōu)于低劑量，說明利膽退黃湯影響NTCP、BSEP蛋白及mRNA的表達(dá)具有一定的劑量依賴。

綜上所述，利膽退黃湯可改善ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積黃疸大鼠的病理變化，可能是通過上調(diào)肝細(xì)胞中NTCP、BSEP的表達(dá)，來改善血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil、TBA的水平，以改善膽汁淤積黃疸模型大鼠的肝膽功能。

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