姜立春， 趙麗萍，楊 萍， 王 婷， 李小芳， 朱 靜， 阮期平

(綿陽師范學(xué)院分子生物學(xué)與生物制藥重點實驗室，四川綿陽 621000)

木質(zhì)素(lignin)是一種廣泛存在于植物體中的、無定形的、分子結(jié)構(gòu)中含有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性高聚物，是由松柏醇、香豆素、芥子醇3種醇單體通過羥基或甲氧基取代的苯丙烷單體經(jīng)無序聚合而成的三維復(fù)雜結(jié)構(gòu)[1]。木質(zhì)素主要填充于纖維素構(gòu)架中，以增強植物體的機械強度，避免生物侵害和水的侵蝕，具有抗菌、抗氧化、抗吸收紫外線和阻燃等功能，同時具有較高的穩(wěn)定性，因而自然降解速率緩慢。在木本植物中，木質(zhì)素含量僅次于纖維素，是世界上第2位最豐富的有機物。

我國是秸稈資源最豐富的國家之一。據(jù)報道，我國農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量為6億～7億t，約占世界總產(chǎn)量的1/3。木質(zhì)纖維素是農(nóng)作物秸稈的主要成分，也是地球上數(shù)量最大的可再生能源物質(zhì)。植物體內(nèi)木質(zhì)素將纖維素緊緊包圍，一般的微生物很難進(jìn)入，因此很難分解纖維素，進(jìn)而導(dǎo)致秸稈資源開發(fā)利用困難[2]。數(shù)據(jù)表明，造紙工業(yè)每年要從植物中分離出約1.4億t纖維素，同時得到5 000萬t左右的木質(zhì)素副產(chǎn)品，但超過95%的木質(zhì)素以“黑液”直接排入江河或濃縮直接燒掉，不符合建設(shè)節(jié)約型經(jīng)濟(jì)體系的思路。木質(zhì)素的科學(xué)利用決定木質(zhì)素經(jīng)濟(jì)效益的可持續(xù)發(fā)展?，F(xiàn)今，環(huán)境污染和資源匱乏等問題不斷深化，天然高分子所具有的可再生、可降解等性質(zhì)也日益受到重視。因此，木質(zhì)素的高效降解成為國內(nèi)外的研究熱點。

國內(nèi)外已有的降解方法包括物理降解、化學(xué)降解、物理-化學(xué)降解、物理-生物降解、物理-化學(xué)-生物降解以及生物降解[3]。其中，生物降解法使用最多且效果最明顯。降解木質(zhì)素的微生物主要是真菌、細(xì)菌和放線菌，其中真菌占主導(dǎo)作用[4-5]。木質(zhì)素降解酶的研究主要集中在白腐菌酶系，最為重要的酶有3種，即木質(zhì)素過氧化物酶(lignin peroxidases，Lip)、錳依賴過氧化物酶(manganese perxidases，Mnp)和漆酶(laccase)[6]。目前，白腐真菌是唯一已知的在純培養(yǎng)條件下可將木質(zhì)素徹底分解的微生物，它能分泌胞外氧化酶來降解木質(zhì)素，其降解木質(zhì)素的能力優(yōu)于分解纖維素的能力，被認(rèn)為是迄今最有價值的木質(zhì)素降解微生物。其類屬中的蟲擬蠟菌(Ceriporiopsissubvermispora)[7]、產(chǎn)芽孢木質(zhì)素降解菌MN-8[8]、高溫木質(zhì)素降解菌(GeobacilluscaldoxylosilyticusJ16)[9]和綠色木霉Bax[10]等菌對木質(zhì)素的降解具有較強的選擇性。國內(nèi)外已有許多關(guān)于白腐菌篩選及其降解木質(zhì)素的研究，但因篩選方法具有局限性，造成優(yōu)良菌株漏篩甚至錯篩，不利于尋找新的木質(zhì)素高效降解菌株[10]。且在研究過程中大多數(shù)白腐菌在降解木質(zhì)素時選擇性較差，所以分離篩選優(yōu)良木質(zhì)素降解菌及其優(yōu)化發(fā)酵條件提高酶活性具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 校園周邊竹林地表土壤、地表下5 cm土壤及長有子實體的腐木。

1.1.2 培養(yǎng)基 初篩培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g、KH2PO40.5 g、NaCl 0.2 g、NH4NO31.0 g、MgSO40.2 g、CaCl20.2 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、MnSO4·H2O微量、竹粉10 g(鮮竹磨粉，過40目篩，65 ℃烘16 h)、瓊脂粉20 g，加蒸餾水定溶至1 L，121 ℃ 高壓滅菌20 min，倒平板，備用。

復(fù)篩培養(yǎng)基1：馬鈴薯200 g、酵母粉15～20 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、氯化鈉5 g、愈創(chuàng)木酚0.2 mL，蒸餾水定容到 1 L，pH值為7.0，瓊脂粉20 g，121 ℃高壓滅菌20 min，倒平板，備用。

復(fù)篩培養(yǎng)基2：馬鈴薯200 g、酵母粉15～20 g、蛋白胨 5 g、葡萄糖10 g、氯化鈉5 g、苯胺蘭0.1 g，蒸餾水定容到1 L，pH值為7.0，瓊脂粉20 g，121 ℃高壓滅菌20 min，倒平板，備用。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：K2HPO42 g、(NH4)2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、木質(zhì)素10 g，pH值6.0，蒸餾水定容到1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 初篩 將采集的樣品各稱取1 g于10 mL生理鹽水中洗滌，取洗滌液，共得到5種待用樣品。將上述1～5菌液分別進(jìn)行梯度稀釋10-3～10-6并涂布于初篩培養(yǎng)基上，每個平板涂布100 μL。將上述得到的菌落挑于復(fù)合營養(yǎng)初篩培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐次分離直到得到單菌落，將分離純化出的菌株保存、備用。

1.2.2 復(fù)篩 將初篩得到的單菌落，用滅過菌的牙簽挑取，并分別接種于上述復(fù)篩培養(yǎng)基1平板中和復(fù)篩培養(yǎng)基2平板中，根據(jù)培養(yǎng)基產(chǎn)生的現(xiàn)象篩選出菌株。

1.2.3 酶活性的測定

1.2.3.1 木質(zhì)素過氧化物酶活性測定 選用藜蘆醇作為底物，反應(yīng)體系如下：125 mmol/L酒石酸鈉緩沖液(pH值為3.0)3.2 mL，10 mmol/L藜蘆醇0.1 mL，酶液0.6 mL，加入 10 mmol/L H2O2溶液0.1 mL啟動反應(yīng)，測反應(yīng)最初3 min內(nèi)310 nm處D值的變化。以煮沸滅活15 min酶液反應(yīng)混合液作對照。酶活性定義為1 min使得反應(yīng)液吸光值變化0.1的酶量為1個酶活性單位(U)[11]。

1.2.3.2 錳過氧化物酶活性測定 50 mmol/L乳酸鈉緩沖液(pH值為4.5)3.4 mL，1.6 mmol/L MnSO4溶液 0.1 mL，0.4 mL的培養(yǎng)基濾出液，預(yù)熱至32 ℃加入 1.6 mmol/L H2O2溶液0.1 mL啟動反應(yīng)，測反應(yīng)最初 3 min 內(nèi)240 nm處吸光度變化。酶活性定義為1 min內(nèi)1 mL培養(yǎng)基濾液增加0.1個D值為1個酶活性單位[12]。

1.2.3.3 漆酶的酶活測定 取1.5 mL濃度為50 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH值為4.5)，1 mL濃度為 0.4 mmol/L 的愈創(chuàng)木酚和1 mL粗酶液，放在25 mL試管中振蕩混勻，預(yù)熱至32 ℃反應(yīng)5 min，反應(yīng)結(jié)束100 ℃煮沸滅活5 min，立即冷卻，然后加蒸餾水至20 mL，混勻，測定470 nm下10 min內(nèi)ΔD，470 nm消光系數(shù)ε=49 600 mol/(L·cm)。酶活性定義1 L反應(yīng)液1 min使ΔD470 nm值改變0.1為1 U[13]。

1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 形態(tài)觀察 菌株在高氏一號培固體養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)36 h后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，放于4 ℃冰箱中保存。挑取單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4.2 生理生化鑒定 參照文獻(xiàn)[14]中的方法對菌株BP01進(jìn)行生理生化試驗檢測。依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，對分離到的菌株BP01進(jìn)行初步鑒定[15]。

1.2.4.3 基因組提取和16S rRNA基因擴增 參考Rainey等的方法[16]提取細(xì)菌總DNA，略有修改，用1.0%瓊脂糖電泳檢測。

PCR反應(yīng)體系：16.25 μL、ddH2O、2.5 μL 10×PCR buffer、2 μL dNTPs(各2.5 mmol/L)、1.0 μL F27正向引物(5′-AG AGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)(10 μmol/L)、1.0 μL R1492反向引物(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)(10 μmol/L)、2 μL模板、0.25 μLTaqDNA聚合酶(5 μg/μL)，反應(yīng)總體積為20 μL。擴增循環(huán)體系：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，其產(chǎn)物回收純化后與pMD-19T載體連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選陽性重組子，郵寄至上海英俊生物技術(shù)公司測序，核酸序列用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4.4 16S rRNA序列分析與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 通過測序獲得的16S rRNA序列用NCBI中BLAST搜索與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性分析，從而獲得相應(yīng)菌株16S rRNA序列，在Clustal X(1.8)程序包中進(jìn)行多重序列比對排列分析。利用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]。

1.2.5 菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.2.5.1 時間 將待優(yōu)化菌種接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，接種量為5%。置于32 ℃、160 r/min搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄其生長狀況，待菌液培養(yǎng)至其菌絲一定量時，開始測定木質(zhì)素降解酶系中的Lip活性，并每過12 h測定記錄1次，測定 5～7 d。作出Lip活性隨培養(yǎng)時間變化的變化曲線，找出Lip最佳產(chǎn)酶活時間，并綜合確定優(yōu)化的最佳培養(yǎng)時間。

1.2.5.2 碳源及濃度 分別以葡萄糖、麥麩、蔗糖、馬鈴薯浸出液、可溶性淀粉和玉米粉作為液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的唯一碳源，碳源的質(zhì)量濃度為20 mg/mL，于32 ℃、160 r/min下?lián)u床培養(yǎng)上述已經(jīng)確定的最佳培養(yǎng)時間，后進(jìn)行Lip活性的測定，綜合比較選擇酶活性較大的碳源。將已經(jīng)選出的最佳碳源分別設(shè)置濃度為5、10、15、20、30、40 mg/mL，于上述條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，測定最佳培養(yǎng)時間的Lip活性，綜合比較選出最佳碳源的最適酶活性濃度。

1.2.5.3 氮源及濃度 分別以牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉和尿素作為液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的唯一氮源，氮源的質(zhì)量濃度為1 g/L，于32 ℃、160 r/min下?lián)u床培養(yǎng)上述已經(jīng)確定的最佳培養(yǎng)時間，后進(jìn)行Lip活性的測定。其中培養(yǎng)基碳源選擇筆者已經(jīng)確定的最佳碳源及其濃度，綜合比較選擇酶活性較大的氮源。將已經(jīng)選出的最佳氮源分別設(shè)置濃度為0.5、1、2、4、6、8 g/L，于上述條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，測定最佳培養(yǎng)時間的Lip酶活性，綜合比較選出最佳氮源的最適酶活性濃度。

1.2.5.4 不同pH值對產(chǎn)酶條件的影響 分別設(shè)定pH值為5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，將菌株于160 r/min的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。碳源、氮源分別選擇已優(yōu)化出的最佳碳源、氮源及其相應(yīng)的濃度，于確定的最佳培養(yǎng)時間進(jìn)行Lip活性的測定，綜合比較選擇酶活性最高時的pH值。

1.2.5.5 溫度 分別設(shè)定溫度為20、25、32、37、40、45 ℃，將菌株于160 r/min的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。碳源、氮源和pH值分別選擇已優(yōu)化的最佳碳源、氮源及其相應(yīng)的濃度和pH值，于確定的最佳培養(yǎng)時間進(jìn)行Lip活性的測定，綜合比較選擇酶活性最高時的溫度。

1.2.5.6 不同裝液量對產(chǎn)酶條件的影響 于250 mL的三角瓶中分別裝液30、50、80、100、120 mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，置于最佳溫度160 r/min下進(jìn)行搖床培養(yǎng)。其中，碳源、氮源、溫度、pH值分別選擇已優(yōu)化的最佳碳源、氮源、溫度和pH值，并于確定的最佳培養(yǎng)時間進(jìn)行Lip活性的測定，綜合比較選擇酶活性最高時的裝液量。

1.2.5.7 綜合最佳條件進(jìn)行培養(yǎng)測定 在確定的最佳碳源和氮源及其最佳濃度、溫度、pH值、裝液量下，將菌恒溫 160 r/min 下?lián)u床培養(yǎng)相應(yīng)時間后測定Lip活性，與上各單因素測定酶活性比較在綜合條件下其酶活性是否有大的改進(jìn)，從而可以了解菌產(chǎn)酶條件的優(yōu)化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選結(jié)果

2.1.1 初篩 通過平板稀釋法初步篩選出有木質(zhì)素降解作用的菌株18株進(jìn)行復(fù)篩，其中苯胺藍(lán)脫色圈直徑≥ 30 mm 的2株，脫色圈直徑在20～30 mm的3株，其余13株菌脫色圈相對較小，可能降解作用較低，其中BP01的降解能力最強，其脫色圈直徑為35.0 mm，且愈創(chuàng)木酚苯胺藍(lán)脫色圈直徑也達(dá)到了20 mm(表1)。因此，選BP01進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化試驗與16S rDNA的序列測定來確定該菌株的分類地位。

2.1.2 復(fù)篩 通過對初篩得到的18株菌進(jìn)行木質(zhì)素過氧化物酶活性測定，其中菌株BP01木質(zhì)素過氧化物酶與錳過氧化物酶活性為266.33、58.12 U/L，為18株菌中最高的；漆酶活性相對較低(表2)。因此，隨后的木質(zhì)素的降解條件優(yōu)化以木質(zhì)素過氧化物酶作為指標(biāo)。

表1 木質(zhì)素降解菌初篩結(jié)果

表2 18株菌木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶活性

2.2 鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)觀察 菌株在含有木質(zhì)素的營養(yǎng)瓊脂固體平板上生長，出現(xiàn)了透明圈，無可溶性色素。有臭味，乳白色，濕潤，菌落大而扁平，邊緣不整齊呈鋸齒狀，表面粗糙，半透明，正反面顏色相同，生長快，易挑起，不產(chǎn)生色素。通過形態(tài)觀察，初步判定為細(xì)菌。經(jīng)革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色為紫色，呈陽性。

2.2.2 生理生化反應(yīng) 該菌株能分解葡萄糖，產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，V.P試驗為陽性反應(yīng)，甲基紅試驗為陰性，吲哚試驗陽性反應(yīng)，有吲哚生成，淀粉水解呈陽性，過氧化氫酶檢測呈陽性，有氣泡生成，不能利用明膠，硝酸鹽還原試驗呈陽性，不產(chǎn)硫化氫。根據(jù)BP01菌株的形態(tài)特征和生理生化特征鑒定的結(jié)果，對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，初步得出菌株BP01與類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)細(xì)菌很相近。

2.2.3 菌株BP01序列測定 測序后得到菌株BP01序列長度為1 516 bp，其序列如下：

A C G G T T A C C T T G T T A C G A C T T C A C C C C A A T C A T C T A C C C C A C C T T C G A C G G C T G G C T C C T T G C G G T T A C C C C A C C G G C T T C G G G T G T T G T A A A C T C T C G T G G T G T G A C G G G C G G T G T G T A C A A G A C C C G G G A A C G T A T T C A C C G C G G C A T G C T G A T C C G C G A T T A C T A G C A A T T C C G A C T T C A T G C A G G C G A G T T G C A G C C T G C A A T C C G A A C T G A G A C C G A C T T T G T T G G G A T T G G C T C C A C C T C G C G G T T T C G C G A C C C G T T G T A T C G G C C A T T G T A G T A C G T G T G T A G C C C A G G T C A T A A G G G G C A T G A T G A T T T G A C G T C A T C C C C A C C T T C C T C C G G T T T G T C A C C G G C A G T C A T C C T A G A G T G C C C A C C C A A A G T G C T G G C A A C T A A G A T C A A G G G T T G C G C T C G T T G C G G G A C T T A A C C C A A C A T C T C A C G A C A C G A G C T G A C G A C A A C C A T G C A C C A C C T G T C T C C T C T G T C C C G A A G G A A A G T C C T A T C T C T A G G A C G G T C A G A G G G A T G T C A A G A C C T G G T A A G G T T C T T C G C G T T G C T T C G A A T T A A A C C A C A T A C T C C A C T G C T T G T G C G G G T C C C C G T C A A T T C C T T T G A G T T T C A G T C T T G C G A C C G T A C T C C C C A G G C G G A A T G C T T A A T G T G T T A A C T T C G G C A C C A A G G G T A T C G A A A C C C C T A A C A C C T A G C A T T C A T C G T T T A C G G C G T G G A C T A C C A G G G T A T C T A A T C C T G T T T G C T C C C C A C G C T T T C G C G C C T C A G C G T C A G T T A C A G C C C A G A A A G T C G C C T T C G C C A C T G G T G T T C C T C C A C A T C T C T A C G C A T T T C A C C G C T A C A C G T G G A A T T C C A C T T T C C T C T T C T G T A C T C A A G C T T T G C A G T T T C C A T T G C G A C T C G A A G T T G A G C T C C G A G T T T A A A C A A C A G A C T T A C A A G G C C G C C T G C G C G C G C T T T A C G C C C A A T A A T T C C G G A C A A C G C T T G C C C C C T A C G T A T T A C C G C G G C T G C T G G C A C G T A G T T A G C C G G G G C T T T C T T C T C A G G T A C C G T C A C C T A T G G A G C A G T T A C T C T C C A T A G C G T T C T T C C C T G G C A A C A G A G C T T T A C G A T C C G A A A A C C T T C A T C A C T C A C G C G G C G T T G C T C C G T C A G A C T T T C G T C C A T T G C G G A A G A T T C C C T A C T G C T G C C T C C C G T A G G A G T C T G G G C C G T G T C T C A G T C C C A G T G T G G C C G A T C A C C C T C T C A G G T C G G C T A T G C A T C G T C G C C T T G G T G A G C C G T T A C C C C A C C A A C T A G C T A A T G C A C C G C A G G T C C A T C C A T A A G T G G C A G A T T G C T C C G C C T T T C C C A A C T C G G C C A T G C G A C C A A A T T G C G T A T C C G G T A T T A G C A T C C G T T T C C G A A T G T T A T C C C A G T C T T A T G G G C A G G T T A C C C A C G T G T T A C T C A C C C G T C C G C C G C T A A C C A C G C G T T T C C C G A A G G A A A C G C T A G G T C C G C T C G A C T T G C A T G T A T T A G G C A C G C C G C C A G C G T T C G T C C T G A G C C A T G A T C A A A C T C T

2.2.4 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 測序獲得的菌株BP01的16S rDNA序列，將測得的序列與數(shù)據(jù)庫中已注冊的16S rDNA序列用BLAST搜索進(jìn)行序列相似性比較分析。將Genbank中與菌株BP01相似性較高的12個菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(圖1)，供試菌株的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬的標(biāo)準(zhǔn)菌株同源相似度大部分在97%以上。通常當(dāng)2個細(xì)菌的16S rDNA的相似性大于95%時，可將其歸為同一屬[18]，而同源性大于96%的序列均來自類芽孢桿菌屬，初步將此菌株歸為類芽孢桿菌屬。同時BP01在系統(tǒng)發(fā)育樹上與類芽孢桿菌(Paenibacillusxinjiangensisstrain B538)B538(登錄號為NR_043221)聚集在同一個分支中，且16S rDNA序列的同源相似性最為99%。結(jié)合其形態(tài)特征及生理生化特性與類芽孢桿菌屬較為一致，因此菌株BP01為類芽孢桿菌屬，命名為Paenibacillussp. BP01。

2.3 產(chǎn)酶優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 BP01培養(yǎng)時間 將BP01接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量為2%)，置于32 ℃、160 r/min搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并記錄其生長狀況，每12 h測定記錄1次，共5 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BP01的酶活性在0～72 h逐漸增大，在72 h時達(dá)到最大，當(dāng)培養(yǎng)時間超過72 h其酶活性隨著時間的增大而減小(圖2)。因此，確定培養(yǎng)時間確定為72 h。

2.3.2 BP01最佳碳源的確定 以葡萄糖、麥麩、蔗糖、馬鈴薯浸出液、可溶性淀粉(質(zhì)量濃度為2 g/100 mL)作為唯一碳源，將BP01接種后的三角瓶于32 ℃、160 r/min搖床上培養(yǎng)2 d，對酶活性進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BP01是在葡萄糖作為唯一碳源條件下培養(yǎng)，具有最大的酶活性(4.21 U/mL，圖3)。因此，葡萄糖為BP01產(chǎn)酶最佳碳源。

將最佳碳源葡萄糖分別設(shè)置濃度為10、15、20、30、40 mg/mL 于上述條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，測定培養(yǎng)2 d后的Lip活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)葡萄糖的濃度為15 mg/mL時，其酶活性達(dá)到最大，為4.49 U/mL(圖4)。因此，選擇15 mg/mL作為最佳碳源葡萄糖的最適濃度。

2.3.3 BP01最佳氮源的選擇 以牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸銨、酵母粉、尿素作為產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中的唯一氮源，氮源的質(zhì)量濃度為1 g/L；碳源選擇15 g/L葡萄糖將接種 BP01 的三角燒瓶于32 ℃、160 r/min下?lián)u床培養(yǎng)2 d，對Lip活性進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BP01在酵母粉為氮源的條件下培養(yǎng)，酶活性最大時為4.32 U/mL(圖5)。因此，將酵母粉作為產(chǎn)酶培養(yǎng)的最佳氮源。

將最佳氮源酵母粉分別設(shè)置濃度為 0.5、1、2、4、6、8 mg/mL，于上述條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)2 d，測定Lip的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酵母粉濃度為6 mg/mL時，其酶活性最大為5.48 U/mL(圖6)。因此選擇6 mg/mL作為最佳氮源酵母粉的最佳濃度。

2.3.4 BP01 pH值的選擇 將產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，加入15 g/L葡萄糖、6 g/L酵母粉，將BP01接種后的三角瓶于32 ℃、160 r/min下?lián)u床培養(yǎng) 2 d，培養(yǎng)基相應(yīng)成分及濃度使用前面已經(jīng)優(yōu)化出來的結(jié)果，測定Lip活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值=7時BP01的酶活性最大，為4.93 U/mL(圖7)。因此，選擇pH值=7作為產(chǎn)酶最佳的pH值，過酸過堿對產(chǎn)酶都有一定的影響。

2.3.5 BP01溫度的選擇 將恒溫?fù)u床的溫度分別設(shè)置為28、32、37、40、45 ℃，加入15 g/L葡萄糖、6 g/L酵母粉，培養(yǎng)基的pH值調(diào)至為7，將BP01接種后的三角瓶于160 r/min下?lián)u床培養(yǎng) 2 d，測定Lip活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為37 ℃時，其酶活性最大，為5.57 U/mL(圖8)。因此，選擇37 ℃作為最佳的產(chǎn)酶溫度。

2.3.6 BP01裝液量選擇 于250 mL的三角瓶中分別裝40、60、80、120 mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，加入15 g/L葡萄糖、6 g/L酵母粉，pH值調(diào)至7，將BP01接種后的三角瓶置于37 ℃、160 r/min 下進(jìn)行搖床培養(yǎng)2 d，測定Lip活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裝液量為100 mL時，其酶活性最大(圖9)。因此，選擇 100 mL 作為產(chǎn)酶的最佳裝液量。

2.3.7 BP01綜合最佳條件培養(yǎng) 綜合前面的優(yōu)化結(jié)果，即在15 g/L葡萄糖、6 g/L酵母粉、pH值=7、37 ℃和裝液量為 100 mL 的條件下，將接種BP01后的三角瓶置于160 r/min搖床上進(jìn)行搖床培養(yǎng)3 d，取部分6 000 r/min離心10 min得到取上清液為粗酶液。測定Mnp活性達(dá)到了6.47 U/mL，對于所測的這個酶活性雖然不是在整個試驗過程中酶活性最高的數(shù)據(jù)，但是對于試驗之初還是較大的提高，起到了一定的優(yōu)化作用。

3 結(jié)論

從腐木上的子實體篩選出菌株能選擇性降解木質(zhì)素的菌株BP01，通過生理生化鑒定試驗及16S rDNA序列分析對菌株進(jìn)行鑒定試驗確定菌株BP01為類芽孢桿菌屬。在 BP01 產(chǎn)酶特性研究中，對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究及條件優(yōu)化，經(jīng)測定，菌株BP01在碳源(葡萄糖)15 g/L、氮源(酵母粉)6 g/L、溫度為37 ℃、pH值=7.0、裝液量100 mL的條件下培養(yǎng) 72 h，其產(chǎn)過氧化物酶(Lip)活性達(dá)到最高，為6.47 U/mL。這將為深入研究木質(zhì)素的生物降解及其開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

：

[1]宋曉雪. 嗜堿木質(zhì)素降解菌株篩選鑒定與生長條件優(yōu)化[D]. 大連：大連理工大學(xué)，2013：1-10.

[2]石 倩. 農(nóng)作物秸稈木質(zhì)素降解研究現(xiàn)狀[J]. 農(nóng)業(yè)科技與裝備，2013(3)：73-74.

[3]李 軼，劉雨秋，谷士艷，等. 玉米秸稈纖維降解的預(yù)處理工藝條件篩選[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，44(1)：99-103.

[4]王 敏. 白腐菌降解木質(zhì)素研究進(jìn)展[J]. 衡水學(xué)院學(xué)報，2011，13(1)：51-53.

[5]胡雪竹. 木質(zhì)素降解酶的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(11)：6326-6328，6363.

[6]張 宇，許敬亮，李 東，等. 木質(zhì)素降解菌Ceriporiopsissubvermispora的研究進(jìn)展[J]. 武漢理工大學(xué)學(xué)報，2009(10)：104-108.

[7]李紅亞，李術(shù)娜，王樹香，等. 產(chǎn)芽孢木質(zhì)素降解菌MN-8的篩選及其對木質(zhì)素的降解[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47(2)：324-333.

[8]晉果果，翁海波，李萍萍，等. 高溫木質(zhì)素降解菌GeobacilluscaldoxylosilyticusJ16的篩選及其產(chǎn)酶發(fā)酵性質(zhì)研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27(8)：334-339.

[9]姜明國，黎海菲，陸冠穎，等. 木質(zhì)素降解菌Bax的篩選及特性研究[J]. 生物技術(shù)通報，2011(3)：200-203.

[10]王茂成. 木質(zhì)素降解真菌的篩選鑒定及相關(guān)酶活性研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2013：1-9.

[11]Ming T，Kirk T K. Lignin peroxidase of Phanerochaete chrysosporium[J]. Methods in Enzymology，1988，161(1)：238-249.

[12]謝 君，任 路，李 維，等. 白腐菌液體培養(yǎng)產(chǎn)木質(zhì)纖維索降解酶的研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2000，37(期缺失)：161-166.

[13]崔艷紅，張海棠，孟慶輝，等. 白腐真菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的條件及酶學(xué)性質(zhì)的研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，33(2)：43-47.

[14]陳 堅，劉 和，李秀芬. 環(huán)境微生物實驗技術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：19-59.

[15]黎滿香，林榮高，薛立群，等. 湖南豬源糞腸球菌的分離鑒定及16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2011，31(9)：1290-1294.

[16]Rainey F A，Wardrainey N，Kroppenstedt R M，et al. The genusNocardiopsisrepresents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage：proposal of Nocardiopsaceae fam nov[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1996，46(4)：1088-1092.

[17]Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al. MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30(12)：2725-2729.

[18]楊蘇聲. 細(xì)菌分類學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：1-7.