韓運(yùn)華， 石 磊

(1.吉林化工學(xué)院，吉林吉林 132022； 2.吉林石化公司有機(jī)合成廠，吉林吉林 132021)

黃芪是應(yīng)用非常廣泛的藥食兩用傳統(tǒng)中藥材，為豆科植物膜莢黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge]和蒙古黃芪[A.membranaceus(Fisch.) Bunge var.mongholicus(Bunge) Hsiao]的干燥根[1]，東北是黃芪的主產(chǎn)區(qū)之一。黃芪的傳統(tǒng)應(yīng)用部位是根部，黃芪根主要用于氣虛乏力、內(nèi)熱消渴、表虛自汗等病癥的治療[2]，關(guān)于黃芪根的藥理活性及化學(xué)成分的研究已有較多文獻(xiàn)資料[3-5]。黃芪黃酮是黃芪根中的一類(lèi)重要活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、抗突變等多種生理活性，主要含有毛蕊異黃酮及苷、芒柄花素、芒柄花苷等活性成分[6-8]。文獻(xiàn)資料表明多種天然黃酮類(lèi)化合物均具有較好的抗氧化性能、增強(qiáng)人體免疫力、抗衰老等多種生理作用[9-13]。目前，我國(guó)主要利用黃芪的根部，大部分黃芪的地上部分即黃芪莖葉被作為廢物丟棄，未被有效利用，使黃芪這一天然資源嚴(yán)重浪費(fèi)，而黃芪莖中含有許多黃酮類(lèi)化合物，而黃芪總黃酮是黃芪抗氧化、清除自由基的主要活性成分[14-15]，而在很多人類(lèi)疾病病原體中自由基起著重要的作用[16]，人體內(nèi)如果有大量自由基的生成會(huì)引起癌癥、糖尿病等眾多疾病[17-19]，會(huì)加快人體的衰老過(guò)程[20]，所以引起了人們對(duì)黃芪莖的研究興趣，目前市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了添加黃芪莖粉的畜禽飼料，飼料中添加黃芪莖粉后，對(duì)雞、兔具有明顯的促生長(zhǎng)作用和增強(qiáng)免疫能力，能夠提高畜禽的生產(chǎn)性能和重大疾患的防治[21]。大孔吸附樹(shù)脂是一種具有多孔性、比表面積大的高分子吸附劑，已廣泛應(yīng)用于天然植物中黃酮類(lèi)化合物的富集、純化[22-23]。本試驗(yàn)針對(duì)黃芪莖總黃酮的大孔樹(shù)脂純化工藝開(kāi)展試驗(yàn)研究，達(dá)到減少資源浪費(fèi)，提高農(nóng)民收益的目的，為黃芪莖的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑 黃芪莖購(gòu)于吉林省均林中草藥種植有限公司；蕓香苷對(duì)照品(供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；大孔吸附樹(shù)脂(ADS-17、XDA-8、LSA-21、LSA-10、AB-8、LX-36、D-101、LSA-33型，西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司)；DPPH·(分析純，上海如吉生物科技有限公司)；對(duì)氨基苯磺酸(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鹽酸萘乙二胺(分析純，天津市化學(xué)試劑研究所有限公司)；過(guò)硫酸鉀、維生素C(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為市售分析純化學(xué)試劑；水為重蒸餾水。

1.1.2 儀器與設(shè)備 TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHA-B型水浴恒溫振蕩器(金壇市科析儀器有限公司)；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；XMTD-8222型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)，取平均值，數(shù)據(jù)分析采用Origin 6.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]繪制蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線[24]。稱(chēng)取干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷9.5 mg，精確稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為 0.188 9 mg/mL 的對(duì)照品溶液，備用。精確吸取蕓香苷對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入0.1 mol/L 的AlCl3溶液5.0 mL，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液2.5 mL，60%乙醇定容。40 ℃水浴反應(yīng)15 min，冷至室溫，以相應(yīng)的顯色劑溶液為空白，按照紫外可見(jiàn)分光光度法，在406 nm處測(cè)定其吸光度。以蕓香苷對(duì)照品溶液的吸光度為縱坐標(biāo)，其質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：D=27.16C-0.001 1，r=0.999 4。結(jié)果表明蕓香苷進(jìn)樣質(zhì)量濃度在0.003 778～0.037 78 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

精確吸取黃芪莖提取液、大孔樹(shù)脂吸附后的溶液和解吸液各適量，分別置于25 mL容量瓶中。按上述方法在406 nm處測(cè)定上述溶液的吸光度，計(jì)算樹(shù)脂對(duì)黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率及比解吸量、解吸率和浸膏中總黃酮的含量[25]。計(jì)算公式如下：

比吸附量(mg/g)=(C0×V0-C1×V1)/m0；

吸附率=[(C0×V0-C1×V1)/(C0×V0)]×100%；

比解吸量(mg/g)=(V2×C2)/m0；

解吸率={(V2×C2)/[(C0×V0-C1×V1)]}×100%；

干浸膏總黃酮含量=(m2/m1)×100%。

式中：C0為黃芪莖提取液總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C1為大孔樹(shù)脂吸附后溶液總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為解吸液中黃芪莖總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V0為黃芪莖提取液體積，mL；V1為吸附后溶液體積，mL；V2為解吸液體積，mL；m0為樹(shù)脂的稱(chēng)樣量，g；m1為解吸液干燥后固體的稱(chēng)樣量，mg；m2為解吸液中總黃酮的測(cè)定量，mg。

2.2 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理

稱(chēng)取LSA-21、ADS-17、LX-36、XDA-8、LSA-10、AB-8、D-101、LSA-33等各種型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂適量，分別加入到玻璃柱中，參照文獻(xiàn)[26]進(jìn)行預(yù)處理，密封備用[26]。

2.3 黃芪莖提取液的制備

稱(chēng)取粉碎的黃芪莖30 g，按料液比1 ∶10(g ∶mL)加入70%乙醇水溶液，回流提取2次，每次2 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度1.18～1.22(60 ℃)的稠膏，加蒸餾水定容至250 mL容量瓶中，備用。

2.4 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

2.4.1 靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn) 稱(chēng)取8種已預(yù)處理好的濕樹(shù)脂各2 g，分別置于具塞錐形瓶中，隨后分別加入黃芪莖提取液30 mL，在水浴恒溫振蕩器中25 ℃振蕩2 h，靜置48 h，過(guò)濾，將過(guò)濾后的不同樹(shù)脂分別置于具塞錐形瓶中，各加入80%乙醇水溶液50 mL，在水浴恒溫振蕩器中25 ℃振蕩2 h，靜置48 h，過(guò)濾。分別吸取各樹(shù)脂吸附后的溶液、解吸液各適量，分別加入至25 mL容量瓶中，按“1.3.1”節(jié)方法在406 nm處測(cè)定上述各溶液的吸光度，計(jì)算各樹(shù)脂對(duì)黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率[27]。結(jié)果(表1)表明，吸附率與解吸率的乘積大于85%的樹(shù)脂有3種，分別為 LSA-21、AB-8、D-101，因此選擇上述3種樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，進(jìn)一步選擇更加合適的樹(shù)脂。

2.4.2 靜態(tài)平衡吸附特征試驗(yàn) 稱(chēng)取“2.4.1”節(jié)試驗(yàn)中篩選出的對(duì)黃芪莖總黃酮比吸附量、 比解吸量較好的3種樹(shù)脂(AB-8、D-101、LSA-21)各4 g于100 mL錐形瓶中，加入50 mL總黃酮質(zhì)量濃度為0.640 5 mg/mL的黃芪莖提取液，在水浴恒溫振蕩器中25 ℃振蕩，分別于10、30、60、90、120、180、240、300、360、420 min取樣測(cè)定上清液的總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂的比吸附量。然后向吸附420 min的樹(shù)脂中加入50 mL的80%乙醇水溶液，在水浴恒溫振蕩器中25 ℃振蕩0.5、1、2、3、4、6、8 h，吸取解吸液適量，測(cè)定解吸液的總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂的比解吸量[28]。分別以3種樹(shù)脂(LSA-21、AB-8、D-101)的比吸附量、比解吸量為縱坐標(biāo)，以吸附時(shí)間、解吸時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制各樹(shù)脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

表1 大孔樹(shù)脂的選擇試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，AB-8型樹(shù)脂對(duì)黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，在吸附時(shí)間為6 h時(shí)比吸附量為7.888 mg/g、吸附率為98.51%，LSA-21、D-101型2種樹(shù)脂對(duì)黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率在0～4 h內(nèi)均隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，4 h后都基本達(dá)到吸附平衡，D-101型樹(shù)脂對(duì)黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率分別為7.283 mg/g、90.95%，LSA-21型樹(shù)脂對(duì)黃芪莖總黃酮的比吸附量、吸附率分別為7.465 mg/g、93.23%，吸附效果依次為AB-8>LSA-21>D-101。對(duì)吸附7 h的3種樹(shù)脂進(jìn)行解吸，結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖2可知，3種樹(shù)脂對(duì)黃芪莖總黃酮的解吸性能存在一定差異，在0～8 h內(nèi)，3種樹(shù)脂對(duì)黃芪莖總黃酮的比解吸量及解吸率均隨著解吸時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。當(dāng)解吸時(shí)間為8 h時(shí)，LSA-21、D-101、AB-8型樹(shù)脂的比解吸量及解吸率分別為7.017 mg/g、6.355 mg/g、6.762 mg/g，93.89%、86.31%、84.72%。因此綜合權(quán)衡上述吸附與解吸的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，LSA-21型樹(shù)脂在這3種樹(shù)脂中具有比解吸量大、解吸率高等優(yōu)點(diǎn)，是本試驗(yàn)中最合適純化黃芪莖總黃酮的樹(shù)脂。

2.5 樹(shù)脂的吸附試驗(yàn)

2.5.1 LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂的吸附等溫線 稱(chēng)取12份LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂，每份4 g，分別置于100 mL錐形瓶中，各加入50 mL總黃酮質(zhì)量濃度不同的黃芪莖提取液，在水浴恒溫振蕩器中25 ℃振蕩24 h，吸取上清液適量，測(cè)定其總黃酮質(zhì)量濃度，計(jì)算樹(shù)脂的比吸附量、吸附率[28]。以 LSA-21樹(shù)脂的比吸附量及吸附率為縱坐標(biāo)，黃芪莖總黃酮的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制吸附等溫線，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著黃芪莖總黃酮的質(zhì)量濃度的增加，比吸附量逐漸增加，但吸附率卻逐漸降低， 當(dāng)黃芪莖總黃酮的質(zhì)量濃度>0.635 mg/mL 時(shí)，比吸附量增加幅度較小，但吸附率的下降幅度增大，因?yàn)樯蠘涌傸S酮的質(zhì)量濃度太低，樹(shù)脂的比吸附量較小，不能完全發(fā)揮樹(shù)脂的作用，使樹(shù)脂嚴(yán)重浪費(fèi)且生產(chǎn)效率低下，而當(dāng)總黃酮的質(zhì)量濃度達(dá)到一定程度后，樹(shù)脂的比吸附量雖然持續(xù)增加，但增加趨勢(shì)減緩，而且吸附率下降幅度增大，所以總黃酮的質(zhì)量濃度太高，會(huì)造成樣液的浪費(fèi)。綜合考慮LSA-21樹(shù)脂吸附黃芪莖總黃酮最大有效上樣液的質(zhì)量濃度為0.635 mg/mL左右，即生藥濃度為0.12 g/mL。

2.5.2 LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂的泄漏曲線 稱(chēng)取LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂15 g，濕法裝柱，加入315 mL總黃酮質(zhì)量濃度為0.639 1 mg/mL的黃芪莖提取液，以1.0 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，每15 mL為1個(gè)流份，共21個(gè)，測(cè)定每個(gè)流份的總黃酮質(zhì)量濃度。以流份體積為橫坐標(biāo)，總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制泄漏曲線[29]。以流份的體積為橫坐標(biāo)，流份中的總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制泄漏曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著黃芪莖提取液上樣體積的增加，流出液中的總黃酮質(zhì)量濃度也逐漸增加，吸附率逐漸降低，當(dāng)流出液收集到第7個(gè)流份(105 mL)的時(shí)候，流出液中的總黃酮質(zhì)量濃度已超過(guò)黃芪莖提取液總黃酮質(zhì)量濃度的10%，而且吸附率下降幅度增大，結(jié)果表明此時(shí)已達(dá)到泄漏點(diǎn)，建議本試驗(yàn)中黃芪莖提取液的上樣體積與樹(shù)脂質(zhì)量之比(mL ∶g)為7 ∶1，即生藥量/樹(shù)脂(g/g)為0.84。

2.5.3 上樣吸附流速的影響 吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.643 0 mg/mL的黃芪莖提取液，每份105 mL，分別加入到6根15 g的樹(shù)脂柱中，分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min 的流速進(jìn)行吸附，收集流出液，記錄體積，計(jì)算比吸附量、吸附率。由表2可知上樣液的吸附流速對(duì)樹(shù)脂的比吸附量、吸附率有影響，隨著吸附流速的加快，比吸附量、吸附率均逐漸越低，在吸附速率為0.5～1.5 mL/min 范圍內(nèi)，比吸附量、吸附率變化不明顯，吸附流速越慢耗費(fèi)的時(shí)間也就越長(zhǎng)，生產(chǎn)周期就越長(zhǎng)，為了既保持理想的比吸附量、吸附率又盡量縮短吸附時(shí)間，綜合考慮將上樣液吸附流速確定為1.5 mL/min。

表2 上樣吸附流速的試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.5.4 黃芪莖提取液pH值的影響 吸取7份總黃酮質(zhì)量濃度為0.635 7 mg/mL的黃芪莖提取液，每份105 mL，分別調(diào)pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，然后加入到7根15 g的樹(shù)脂柱中，以1.0～1.5 mL/min的流速進(jìn)行吸附，收集流出液，記錄體積，計(jì)算比吸附量、吸附率。由表3可知，黃芪莖提取液pH值在2～6范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，樹(shù)脂的比吸附量、吸附率緩慢降低，變化相對(duì)較小，而當(dāng)pH值大于6之后，隨著pH值的繼續(xù)升高，樹(shù)脂的比吸附量、吸附率明顯降低，變化較大?？赡芤?yàn)辄S芪莖提取液中的黃酮類(lèi)物質(zhì)屬于弱酸性化合物，酸性化合物在酸性溶液中易吸附，所以在pH值在2～6范圍內(nèi)吸附效果比較理想，而提取液的pH值為5.5～6，所以樣品液pH值不需調(diào)節(jié)，后續(xù)試驗(yàn)直接以初始提取液進(jìn)行。

表3 黃芪莖提取液pH值的試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.6 樹(shù)脂的解吸試驗(yàn)

2.6.1 解吸液乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.638 1 mg/mL的黃芪莖提取液，每份105 mL，分別加入到6根15 g的樹(shù)脂柱中，控制吸附流速為1.0～1.5 mL/min 進(jìn)行吸附，收集流出液，記錄體積，計(jì)算比吸附量、吸附率。然后分別用0%、10%、30%、50%、70%、90%乙醇水溶液50 mL進(jìn)行解吸，計(jì)算比解吸量、解吸率。試驗(yàn)結(jié)果(表4)表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，樹(shù)脂的比解吸量、解吸率呈現(xiàn)先逐漸升高的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，比解吸量、解吸率最大，達(dá)到2.583 mg/g、64.69%?？赡苁怯捎邳S芪莖中的黃酮類(lèi)成分水溶性較小、而脂溶性較大，所以出現(xiàn)了隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，樹(shù)脂的比解吸量、解吸率逐漸升高的現(xiàn)象。

表4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.6.2 解吸液解吸流速的影響 吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.645 2 mg/mL的黃芪莖提取液，每份105 mL，分別加入到6根15 g的樹(shù)脂柱中，按“2.5.4”節(jié)方法進(jìn)行吸附，計(jì)算比吸附量、吸附率。然后用90%乙醇水溶液分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min的流速進(jìn)行解吸，計(jì)算比解吸量、解吸率。由表5可知，隨著解吸流速的增加，樹(shù)脂的比解吸量、解吸率逐漸降低。因?yàn)榻馕魉龠^(guò)快，解吸性能較差，解吸不完全。但是解吸流速過(guò)慢，解吸耗費(fèi)的時(shí)間也就越長(zhǎng)，則會(huì)使生產(chǎn)周期延長(zhǎng)，增加生產(chǎn)成本。而本次試驗(yàn)結(jié)果表明解吸流速在0.5～1.0 mL/min范圍內(nèi)時(shí)總黃酮的比解吸量、解吸率變化不大，但當(dāng)解吸流速 >1.0 mL/min 時(shí)總黃酮的比解吸量、解吸率明顯下降。所以將解吸流速確定為 1.0 mL/min，既能使樹(shù)脂的比解吸量、解吸率比較理想，又盡量縮短了生產(chǎn)周期。

表5 解吸流速的試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.6.3 解吸液pH值的影響 吸取6份總黃酮質(zhì)量濃度為0.647 3 mg/mL的黃芪莖提取液，每份105 mL，分別加入到6根15 g的樹(shù)脂柱中，按“2.5.4”節(jié)方法進(jìn)行吸附，計(jì)算比吸附量、吸附率。然后分別用pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的90%乙醇水溶液以1.0 mL/min的流速進(jìn)行解吸，計(jì)算比解吸量、解吸率。由表6可知，隨著解吸液pH值的升高，樹(shù)脂的比解吸量及解吸率逐漸增大，當(dāng)pH值大于8之后，隨著pH值的繼續(xù)升高，樹(shù)脂的比解吸量及解吸率變化較小?？赡芤?yàn)辄S芪莖提取液中的黃酮類(lèi)物質(zhì)屬于弱酸性化合物，所以更容易被堿性的解吸液洗脫。所以將解吸液調(diào)至pH值為8，以獲得較高的比解吸量及解吸率。

2.6.4 解吸終點(diǎn)的考察 吸取總黃酮質(zhì)量濃度為 0.637 7 mg/mL 的黃芪莖提取液105 mL，加入到15 g的樹(shù)脂柱中，按“2.5.4”節(jié)方法進(jìn)行吸附，計(jì)算比吸附量、吸附率。然后用90%乙醇水溶液以1.0mL/min的流速進(jìn)行解吸，每15 mL為1個(gè)流份，共收集12個(gè)流份，測(cè)定每份解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度，以解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，解吸液體積為橫坐標(biāo)作圖，確定解吸終點(diǎn)。在該項(xiàng)試驗(yàn)中，黃芪莖總黃酮的比吸附量為4.013 mg/g、吸附率為89.90%。以解吸液體積為橫坐標(biāo)，以每份解吸液中總黃酮的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制趨勢(shì)圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知隨著解吸液體積的增加，解吸液中的總黃酮質(zhì)量濃度逐漸降低，當(dāng)收集到第5個(gè)流份時(shí)，比解吸量、解吸率分別為4.049 mg/g、90.70%，當(dāng)收集到第8個(gè)流份時(shí)，比解吸量、解吸率分別為4.229 mg/g、94.74%，而且第8個(gè)流份以后解吸液中總黃酮質(zhì)量濃度變化較小?？紤]到解吸液體積越大生產(chǎn)成本也就越高，綜合考慮建議本試驗(yàn)中解吸終點(diǎn)為75 mL，即解吸液體積與樹(shù)脂質(zhì)量之比(mL ∶g)為5 ∶1。

表6 解吸液pH值的試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.7 工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn)及黃芪莖脫脂對(duì)純化的影響

稱(chēng)取3份已預(yù)處理的LSA-21型樹(shù)脂各30 g，濕法裝柱，分別加入黃芪莖提取液210 mL，按“2.5.4”節(jié)方法進(jìn)行吸附，計(jì)算比吸附量、吸附率。然后用3.41 BV的pH值為8.0的90%乙醇水溶液以1.0 mL/min的流速進(jìn)行解吸。分別吸取90 mL黃芪莖提取液、解吸液，水浴濃縮，放入干燥箱中于 60 ℃ 干燥至恒質(zhì)量。稱(chēng)取干燥至恒質(zhì)量的黃芪莖干浸膏0.16 g，精確稱(chēng)定，加60%乙醇20 mL，超聲溶解，過(guò)濾，濾液置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇定容，作為供試品溶液，備用。吸取供試品溶液適量于25 mL容量瓶中，按“2.1”節(jié)含量測(cè)定方法測(cè)定干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。

稱(chēng)取粉碎的黃芪莖適量，加入到圓底燒瓶中，按料液比(g ∶mL)1 ∶5加入石油醚(60～90 ℃)，水浴加熱回流2次，每次1 h，過(guò)濾，將脫脂后的黃芪莖放于干燥箱中于60 ℃烘干。稱(chēng)取脫脂后的干燥黃芪莖，按“2.3”節(jié)方法制備黃芪莖提取液，然后按照最佳工藝條件進(jìn)行吸附-解吸，分別計(jì)算比吸附量、吸附率、比解吸量、解吸率及黃芪莖干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。

由表7可知，經(jīng)LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂處理黃芪莖提取液后，黃芪莖總黃酮的比吸附量平均為4.012 mg/g、吸附率平均為88.77%，比解吸量平均為3.645 mg/g、解吸率平均為0.85%。干浸膏中總黃酮含量由4.82%提高到11.04%，總黃酮的富集倍數(shù)為2.29倍。由表7數(shù)據(jù)同時(shí)可知，將黃芪莖用石油醚脫脂后，可以使樹(shù)脂對(duì)黃芪莖總黃酮的比吸附量、比解吸量及干浸膏中總黃酮含量略有提高，但吸附率及解吸率沒(méi)有變化。其中干浸膏中總黃酮含量由平均11.04%提高到12.81%?？赡芤?yàn)橛檬兔衙撝幚砗?，除去了黃芪莖中的葉綠素等脂溶性物質(zhì)，結(jié)果使提取液中的總黃酮質(zhì)量濃度有所提高，從而使干浸膏中總黃酮含量略有提高。

表7 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.8 乙酸乙酯萃取試驗(yàn)

將“2.7”節(jié)所得的黃芪莖干浸膏混合，測(cè)定其總黃酮的含量，然后用已經(jīng)干燥過(guò)的濾紙包好，將濾紙包放在索氏抽提器內(nèi)，按料液比1 ∶40(g ∶mL)加入乙酸乙酯，回流抽提4 h，水浴濃縮回收乙酸乙酯，稠膏放入干燥箱中于60 ℃干燥至恒質(zhì)量，然后按“2.7”節(jié)方法測(cè)定，計(jì)算乙酸乙酯萃取干浸膏中總黃酮的質(zhì)量。試驗(yàn)結(jié)果表明“2.7”節(jié)所得的黃芪莖干浸膏的總黃酮含量為12.05%，經(jīng)乙酸乙酯萃取后干浸膏中的總黃酮含量提高到24.37%。

2.9 體外抗氧化活性試驗(yàn)

2.9.1 清除ABTS陽(yáng)離子自由基試驗(yàn) ABTS陽(yáng)離子自由基水溶液于734 nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰，當(dāng)在其溶液中加入抗氧化劑時(shí)，ABTS陽(yáng)離子自由基被清除，溶液吸光度變小，可以得出供試品對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除效果，該方法常用于表征天然產(chǎn)物體外抗氧化活性。稱(chēng)取干燥的黃芪莖總黃酮(“2.8”節(jié)產(chǎn)物)、蕓香苷、維生素C適量，以50%乙醇為溶劑，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的供試品溶液。吸取不同質(zhì)量濃度的供試品溶液各0.1 mL，分別置于10 mL具塞試管中，按文獻(xiàn)[30]操作，在734 nm處測(cè)其吸光度D空白、D。按照下式計(jì)算黃芪莖總黃酮、蕓香苷、維生素C對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率[30]。

ABTS陽(yáng)離子自由基清除率=[(D空白-D)/D空白]×100%。

式中：D空白為ABTS自由基陽(yáng)離子工作液在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度；D為供試品溶液與ABTS自由基陽(yáng)離子工作液反應(yīng)后的吸光度。

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)作圖，得到各供試品質(zhì)量濃度與ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，隨著各供試品質(zhì)量濃度的增加，對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率均逐漸升高，維生素C的清除率最高，黃芪莖總黃酮的清除率最低，當(dāng)質(zhì)量濃度為 0.6 mg/mL 時(shí)，黃芪莖總黃酮、蕓香苷、維生素C對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率分別為74.48%、84.09%、90.07%。

2.9.2 清除亞硝酸鹽試驗(yàn) 在一定的條件下，亞硝酸鈉與對(duì)氨基苯磺酸及鹽酸萘乙二胺反應(yīng)生成的紅色絡(luò)合物在 538 nm 波長(zhǎng)處有特征吸收峰。在其他條件相同的情況下，可以通過(guò)在538 nm處吸光度的大小反映供試品清除亞硝酸鹽能力的高低。吸取“2.9.1”節(jié)試驗(yàn)中不同質(zhì)量濃度的供試品溶液各 1.0 mL， 置于10 mL具塞試管中， 分別加 10 μg/mLNaNO2溶液2.5 mL，在37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，取出后立即加入0.5 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置15 min后加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.25 mL，加入蒸餾水7 mL，混勻，靜置15 min。50%乙醇作空白，于538 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Di[31]。其他條件不變，不加供試品溶液，按照上步試驗(yàn)，于538 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度D0。按照下式計(jì)算黃芪莖總黃酮、蕓香苷、維生素C對(duì)亞硝酸鹽的清除率：

亞硝酸鹽清除率=[(D0-Di+Dj)/D0]×100%。

式中：Di為加入供試品溶液的吸光度；Dj為供試品溶液的本底值；D0為不加供試品溶液的對(duì)照值。

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、清除率為縱坐標(biāo)作圖，得到各樣品質(zhì)量濃度與亞硝酸鈉清除率的關(guān)系。由圖7可知，隨著各供試品質(zhì)量濃度的升高，對(duì)亞硝酸鹽的清除率均逐漸上升，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.6 mg/mL時(shí)黃芪莖總黃酮、蕓香苷、維生素C對(duì)亞硝酸鹽的清除率分別達(dá)到93.29%、90.09%、95.03%，其清除能力維生素C>黃芪莖總黃酮>蕓香苷，但總體而言三者對(duì)亞硝酸鹽的清除能力相差不明顯。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以總黃酮的比吸附量、吸附率和比解吸量、解吸率為考察指標(biāo)，對(duì)大孔吸附樹(shù)脂純化黃芪莖總黃酮的工藝條件進(jìn)行了探索，比較了ADS-17、XDA-8、LSA-21、LSA-10、AB-8、LX-36、D-101、LSA-33等8種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黃芪莖總黃酮的分離純化效果，結(jié)果表明，LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂比較適合純化黃芪莖中的黃酮類(lèi)化合物，它對(duì)黃芪莖總黃酮的比吸附量平均為4.012 mg/g、吸附率平均為88.77%，比解吸量平均為3.645 mg/g、解吸率平均為0.85%。通過(guò)靜態(tài)、動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)，考察了黃芪莖總黃酮在LSA-21型樹(shù)脂上的吸附特性，確定LSA-21型樹(shù)脂純化黃芪莖總黃酮的工藝條件為：提取液控制其生藥濃度為0.12 g/mL；黃芪莖提取液的上樣體積與樹(shù)脂質(zhì)量之比(mL ∶g)為7 ∶1，即生藥量/樹(shù)脂(g/g)為0.84；吸附流速控制為1.5 mL/min；解吸液為90%乙醇水溶液；解吸流速控制為1.0 mL/min；解吸液pH值為8；解吸液體積與樹(shù)脂質(zhì)量之比(mL ∶g)為5 ∶1。在上述純化工藝條件下，黃芪莖提取液經(jīng)LSA-21型大孔吸附樹(shù)脂純化后，黃芪莖干浸膏中總黃酮含量由4.82%提高到11.04%，總黃酮含量提高了約1.29倍，黃芪莖采用石油醚脫脂后，黃芪莖干浸膏中總黃酮含量可以提高到12.81%，乙酸乙酯萃取后黃芪莖干浸膏中總黃酮含量由12.05%提高到24.37%。體外抗氧化活性的試驗(yàn)結(jié)果表明：黃芪莖總黃酮對(duì)亞硝酸鹽、ABTS陽(yáng)離子自由基均具有清除活性，而且均隨著其質(zhì)量濃度的增加，清除活性均明顯增強(qiáng)。上述試驗(yàn)結(jié)果為黃芪莖總黃酮在食品、飲料、制藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了工作基礎(chǔ)。

：

[1]楊金泉，何海波. 黃芪的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2010，23(2)：148-150.

[2]王 平，梁逸曾. HPLC-DAD-MS研究黃芪的化學(xué)成分[J]. 中草藥，2011，42(2)：226-229.

[3]邱勇波，劉 錦，武 飛. 黃芪化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2011，20(5)：435-436.

[4]高 薔，高文遠(yuǎn)，滿淑麗. 黃芪中有效成分藥理活性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志，2012，37(21)：3203-3205.

[5]仝 欣. 黃芪主要活性成分的藥理作用[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(5)：1246-1249.

[6]陳建真，呂圭源，葉 磊，等. 黃芪黃酮的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(10)：1314-1316.

[7]劉小花，崔 芳，張夢(mèng)婷，等. HPLC法同時(shí)測(cè)定黃芪中的5種黃酮類(lèi)成分的含量——一種新的應(yīng)用于藥學(xué)實(shí)驗(yàn)分析方法[J]. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2016，33(2)：24-27.

[8]王 波，周 圍，劉小花，等. 基于超高效合相色譜對(duì)黃芪中5種主要黃酮類(lèi)化合物的快速檢測(cè)[J]. 分析化學(xué)，2016，44(5)：731-739.

[9]Itidel C，Chokri M，Mohamed B，et al.Antioxidant activity，total phenolic and flavonoid content variation among Tunisian natural populations ofRhustripartita(Ucria) Grande andRhuspentaphyllaDesf.[J]. Industrial Crops and Products，2013，51：171-177.

[10]Saint T，Thitima L，Nuanchawee W，et al.Eriosemachinense：a rich source of antimicrobial and antioxidant flavonoids[J]. Phytochemistry，2013，96(12)：353-359.

[11]Xu Q，Shen Y Y，Wang H F，et al. Application of response surface methodology to optimise extraction of flavonoids from fructus sophorae[J]. Food Chemistry，2013.138(4)：2122-2129.

[12]馮欣欣，于文會(huì)，柏慧敏，等. 沙棘黃酮抗衰老作用及對(duì)大鼠非特異性免疫功能的影響研究[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2015，34(5)：5-9.

[13]劉軍海，李志洲，王俊宏，等. 桂花殘?jiān)锌傸S酮的提取及抗氧化作用研究[J]. 中國(guó)飼料，2015，(10)：24-28.

[14]畢志明，余慶濤，李 萍，等. 蒙古黃芪地上部分的黃酮類(lèi)成分[J]. 中國(guó)天然藥物，2007，5(4)：263-264.

[15]Lin L Z，He X G，Michael L，et al. Liquid chromatogphy-electrospry ionization mass spectrometry study of the flavonoids of the rootsAstragalusmonoholicusandA.membranaceus[J]. J Chromatogr(A)，2000，876(1/2)：87-95.

[16]SharmaP，Singh R P. Evaluation of antioxidant activity in foods with special reference to TEAC method[J]. American Journal of Food Technology，2013，8(2)：83-101.

[17]Rop O，Ercisli S，Mlcek J. Antioxidant and radical scavenging activities in fruits of 6 sea buckthorn (HippophaerhamnoidesL.) cultivars[J]. Turkish Journal of Agriculture and Forestry，2014，38(2)：224-232.

[18]Spitaler M M，Graier F.Vascular targets of redox signaling in diabetes mellitus[J]. Diabetologia，2002，45(4)：476-494.

[19]Gorogawa S，Kajimoto Y，Umayahara Y.Probucol preserves pancreatic beta-cell function through reduction of oxidative stress in type 2 diabetes[J]. Diabetes Res Clin Pract. 2002，57(1)：1-10.

[20]Hu H L，F(xiàn)orsey R J，Blades T J.Antioxidant may contribute in the fight against aging：aninvitromodel[J]. Mech Ageing DeV，2000，121(1/2/3)：217-230.

[21]王鳳霞，李清艷，張洪德. 黃芪莖葉粉對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能及免疫器官指數(shù)的影響[J]. 中國(guó)家禽，2009，31(9)：53-54.

[22]楊 喆，萬(wàn) 山，張喬會(huì)，等. 大孔樹(shù)脂純化山杏核殼總黃酮的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)，2015，36(10)：38-42.

[23]陳 晶，李 琪，黃春萍，等. 枇杷花總黃酮、總?cè)频拇罂讟?shù)脂制備工藝[J]. 食品科學(xué)，2015，36(18)：58-63.

[24]王曉林，鐘方麗，薛健飛，等. 微波協(xié)同酶法提取刺玫葉總黃酮工藝研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，30(4)：246.

[25]鐘方麗，王曉林，王志敏，等. 大孔吸附樹(shù)脂法純化玉竹總黃酮工藝研究[J]. 食品與機(jī)械，2013，29(1)：131-134.

[26]王曉林，薛健飛，陳 帥，等. 大孔樹(shù)脂法純化錦燈籠宿萼總黃酮的工藝[J]. 食品科學(xué)，2014，35(14)：58-61.

[27]甘芝霖，倪元穎，郭 悅，等. 大孔樹(shù)脂分離純化玫瑰果多酚及其抗氧化性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2015，31(24)：298-304.

[28]王曉林，金龍哲，鐘方麗，等. 聚酰胺純化刺玫果總黃酮的工藝研究[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2017，51(2)：189-194.

[29]易海燕，何桂霞，歐陽(yáng)文，等. 大孔吸附樹(shù)脂分離純化藤茶總黃酮的研究[J]. 中草藥，2011，42(1)：74-77.

[30]盧圣樓，符家珍，劉 紅，等. 神秘果葉多酚的超聲波提取工藝及其抗氧化能力[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2014，34(5)：145-151.

[31]李長(zhǎng)虹，秦小梅，張璐璐，等. 枇杷核揮發(fā)油化學(xué)成分及體外抗氧化活性研究[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，48(1)：58-61.