鐘金鳳， 伍維高， 吳支要， 湯小朋

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南衡陽 421005； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410000)

近年來，隨著生豬養(yǎng)殖的飛速發(fā)展，豬場(chǎng)仔豬的免疫抑制性疾病頻頻發(fā)生。這類疾病致使仔豬群處于免疫抑制狀態(tài)，不僅導(dǎo)致豬群疫苗免疫接種失敗，而且阻礙仔豬正常生長(zhǎng)，給生豬生產(chǎn)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。為進(jìn)一步研究這類免疫抑制性疾病，構(gòu)建穩(wěn)定的仔豬免疫抑制模型模擬生產(chǎn)中免疫低下現(xiàn)象顯得尤為關(guān)鍵。

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，簡(jiǎn)稱CTX)，全稱P-[N，N-雙(β-氯乙基)]-1-氧-3-氮-2-磷雜環(huán)己烷-P-氧化物，是一種非特異性體液和細(xì)胞免疫毒性抑制劑[1]，是眾多的構(gòu)建免疫抑制模型的藥物之一。因其作用機(jī)制復(fù)雜，用環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫抑制模型時(shí)，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)?？v觀文獻(xiàn)，主要有3種指導(dǎo)方案，第一種是連續(xù)多次施藥，如馮焱等用0、40、80、160 mg/kg的劑量連續(xù)3 d腹腔注射1日齡的雛雞構(gòu)建模型[2]；Harada等以15 mg/kg的劑量連續(xù) 5 d 腹腔內(nèi)注射的方式構(gòu)建豬的免疫抑制模型[3]。第二種是間隔多次施藥，如Huyan等采用50～200 mg/kg分2次注射，一次在第1天，另一次在第4天[4]。第三種施藥方式是單次用藥，Derbyshire采用100 mg/kg的劑量對(duì)5周齡無特定病原體仔豬腹腔注射構(gòu)建免疫抑制模型[5]。文獻(xiàn)表明采用以上方式均能成功構(gòu)建免疫抑制模型，但在實(shí)際生產(chǎn)中，多次施藥頗費(fèi)人力物力，對(duì)動(dòng)物應(yīng)激大。如文獻(xiàn)所述，單次用藥效果理想，建議用單次用藥替代多次用藥，但未有文獻(xiàn)對(duì)此問題進(jìn)行詳細(xì)研究。為此，本研究以斷奶仔豬為研究對(duì)象，擬采用等劑量的環(huán)磷酰胺單次用藥和連續(xù)用藥方式來觀察免疫抑制效果，為構(gòu)建免疫抑制模型提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試劑

于2015年12月在湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行試驗(yàn)。選取健康、體質(zhì)量一致的杜×長(zhǎng)×大三元雜交仔豬35日齡斷奶仔豬40頭，隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，A組為對(duì)照組；B組環(huán)磷酰胺使用劑量為60 mg/kg，連續(xù)3 d注射；C組劑量為 90 mg/kg，從試驗(yàn)第2天起，連續(xù)2 d注射；D組劑量為 180 mg/kg，試驗(yàn)第3天一次注射完畢。對(duì)照組和試驗(yàn)組未注射環(huán)磷酰胺時(shí)，注射等劑量生理鹽水，自由飲水和采食，試驗(yàn)進(jìn)行21 d。試驗(yàn)所需環(huán)磷酰胺為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司制造，批號(hào)14030525。紅細(xì)胞裂解液、FITC、PE-Cy5、PE標(biāo)記的鼠抗羊的CD3、CD4、CD8抗體為eBioscience公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)日糧

基礎(chǔ)日糧參照NRC[6]仔豬營(yíng)養(yǎng)需要配制成粉料，其具體配方及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)，%)

注：預(yù)混料為1 kg全價(jià)料提供：維生素A 2 200 IU，維生素D3200 IU，維生素E 16 mg，維生素K 1 mg，膽堿200 mg，泛酸6 mg，維生素B22 mg，葉酸0.3 mg，煙酸25 mg，維生素B11.6 mg，維生素B66 mg，生物素0.08 mg，維生素B120.01 mg，Cu 6 mg，F(xiàn)e 100 mg，Zn 100 mg，Mn 20 mg，I 0.14 mg，Se 0.3 mg。消化能根據(jù)原料組成計(jì)算所得，其余為實(shí)測(cè)值。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)仔豬采用群飼，飼喂干粉料，3次/d，時(shí)間為 08：00、14：00、18：00，每次以吃飽略剩料為宜，自由飲水。其他飼養(yǎng)管理和免疫程序按常規(guī)進(jìn)行。

1.4 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

分別于試驗(yàn)開始和結(jié)束當(dāng)天的清晨進(jìn)行空腹稱質(zhì)量，計(jì)算平均日增質(zhì)量；平均日采食量及料質(zhì)量比；記錄腹瀉情況(每日在10：00和18：00觀察2次豬糞便情況，每次30 min，以糞便黏不成形和含水量≥70%視為腹瀉)。

1.5 白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)

環(huán)磷酰胺注射完畢后的7、14、21 d，于清晨用EDTA無菌真空采血管從仔豬前腔靜脈采血2 mL，采用血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血細(xì)胞檢測(cè)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定淋巴細(xì)胞

100 μL EDTA抗凝血全血加入10 μL單克隆抗體(FITC-CD3，PE-Cy5-CD4，PE-CD8)，室溫下避光孵育20 min，加入紅細(xì)胞裂解液10 min后，于1 500 r/min速度下離心 5 min 后棄上清，加入1 mL磷酸緩沖液后離心，棄上清，細(xì)胞重懸于含有1%多聚甲醛的磷酸緩沖液中，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。用標(biāo)準(zhǔn)的濾波器組合在488 nm波長(zhǎng)的氬離子激光照射細(xì)胞，每個(gè)樣品共計(jì)10 000個(gè)淋巴細(xì)胞。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件中的One-Way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)情況的一般觀察

注射環(huán)磷酰胺的仔豬(B、C、D組)表現(xiàn)出嗜睡、乏力、不愿活動(dòng)、被毛豎立、無光澤，且在注射藥物后第2～4天均有此類表現(xiàn)，第5～7天癥狀加重，第8～10天最為明顯，然后逐漸變好，至無異常表現(xiàn)。試驗(yàn)組出現(xiàn)不同程度的腹瀉，其中B組有2頭仔豬因水樣便出現(xiàn)脫水，繼發(fā)感染伴高溫，分別于試驗(yàn)進(jìn)行14 d死亡，其余仔豬腹瀉自愈。

2.2 環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

環(huán)磷酰胺對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響見表2。B、C、D組的第21天體質(zhì)量、平均日增質(zhì)量、料質(zhì)量比顯著低于對(duì)照A組(P<0.05)，B、C、D組間差異不顯著(P>0.05)。平均日采食量各組間差異不顯著(P<0.05)。

2.3 環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量的影響

環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬外周血白細(xì)胞數(shù)量的影響，見表3。試驗(yàn)B、C、D組7 d時(shí)的白細(xì)胞顯著低于對(duì)照A組(P<0.05)，B組顯著低于C組、D組(P<0.05)。14 d時(shí)，B組、D組顯著低于A組、C組，B組、D組間無差異(P>0.05)。21 d時(shí)，各組間無差異(P>0.05)。

2.4 環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響，見表4。7 d 時(shí)，B、C、D組顯著低于A組(P<0.05)，B組又顯著低于C組、D組(P<0.05)；14 d時(shí)，A組、B組、D組顯著低于C組(P<0.05)，A組、B組、D組間差異不顯著(P>0.05)；21 d時(shí)，A組、B組、C組顯著高于D組(P<0.05)，A組、B組、C組間差異不顯著(P>0.05)。

2.5 環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響

環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬外周血CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的影響，見圖1。隨著環(huán)磷酰胺的注射，仔豬CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞在注射后7 d試驗(yàn)B、C、D組顯著低于對(duì)照A組(P<0.05)，B組、C組、D組間差異不顯著(P>0.05)；14 d仔豬CD4+T細(xì)胞中，B組、C組、D組比A組顯著降低(P<0.05)；B組、C組、D組間差異不顯著(P>0.05)。21 d A組、B組、C組、D組間差異均不顯著(P>0.05)，試驗(yàn)各組CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞有所恢復(fù)。

表2 環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

表3 環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬白細(xì)胞的影響

注：#表示B組在21 d時(shí)只有8頭。下表同。

表4 環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬淋巴細(xì)胞的影響

3 討論

3.1 環(huán)磷酰胺對(duì)斷奶仔豬被毛的影響

本研究肌肉注射環(huán)磷酰胺后3 d便觀察到試驗(yàn)動(dòng)物被毛輕微豎立，光澤度欠佳，停藥后得以逐漸恢復(fù)。Novotná等研究表明環(huán)磷酰胺用藥后3 d，雞毛囊真皮乳頭和基質(zhì)細(xì)胞之間的暗帶呈現(xiàn)零亂皺褶狀，皺褶處附著致密的沉著物，沉著物內(nèi)側(cè)充滿小突起[7]。真皮乳頭細(xì)胞周圍的膠原纖維排列紊亂，異染色質(zhì)沿核膜邊緣集結(jié)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，毛球基質(zhì)細(xì)胞間隙變小，甚至消失，相鄰細(xì)胞有橋粒連接，細(xì)胞核張力絲雜亂排列。如果采集試驗(yàn)仔豬的皮膚和被毛，在顯微鏡下觀察其毛囊結(jié)構(gòu)和鱗片排列情況，試驗(yàn)結(jié)果將更加全面。

3.2 環(huán)磷酰胺對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，注射環(huán)磷酰胺組的料肉比和平均日增質(zhì)量比對(duì)照組低，這與Han等的研究結(jié)果[8]有一致性。這與環(huán)磷酰胺對(duì)腸道上皮細(xì)胞的損傷有關(guān)，仔豬消化道各段從內(nèi)向外可分為4層，即黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層，最內(nèi)層為黏膜層，黏膜層主要由上皮細(xì)胞和分散其間的杯狀細(xì)胞組成，是吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要部位。黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接，但不斷更新，其細(xì)胞周轉(zhuǎn)在所有組織中最高，大約3～10 d可從隱窩向絨毛移行，到達(dá)腸絨毛頂端并脫落，隨糞便排出體外，屬快速增殖組織。環(huán)磷酰胺分解物——去甲氮芥可引起組蛋白H2A的變異體H2A.X 和 P53的磷酸化， 引起DNA受損[9]。

機(jī)體中快速生長(zhǎng)組織的DNA和蛋白質(zhì)更新較快，因此受損嚴(yán)重[10]，所以對(duì)胃腸道的消化和吸收功能影響甚大。

3.3 環(huán)磷酰胺對(duì)仔豬外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺可降低仔豬外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，在7 d時(shí)表現(xiàn)尤甚。Harada等用環(huán)磷酰胺腹腔注射約克豬后，外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在2～12 d顯著低于對(duì)照組[3]，本研究結(jié)果與之存在一致性。呈現(xiàn)此現(xiàn)象可能與成髓細(xì)胞有絲分裂活動(dòng)受抑制和淋巴細(xì)胞尤其是B淋巴細(xì)胞有絲分裂靜止有關(guān)[11]；本研究中另一個(gè)值得注意的現(xiàn)象，即B、C組白細(xì)胞在21 d反彈性升高，顯著高于對(duì)照組，B、C組的淋巴細(xì)胞也存在類似的表現(xiàn)，即B、C組下降至最低處，然后反彈高于正常值，而D組的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均緩慢上升，這與徐宏貴等的研究結(jié)果[12]有類似之處。這可能是由于少量多次的注射方式對(duì)造血功能損傷及抑制程度輕，對(duì)GO期造血干細(xì)胞殺滅作用弱，致使骨髓內(nèi)殘存的造血干細(xì)胞迅速代償性增殖，促使淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量迅速增加，并釋放到外周血中。而一次性大劑量注射環(huán)磷酰胺嚴(yán)重破壞了骨髓造血干細(xì)胞代謝池，使之代償能力受損，故回升緩慢[13]。

由此可見，小劑量多次注射對(duì)外周血淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞的影響有較大幅度影響，而單次大劑量注射則影響平穩(wěn)。

3.4 環(huán)磷酰胺對(duì)外周血T細(xì)胞亞群的影響

為進(jìn)一步考察環(huán)磷酰胺對(duì)斷奶仔豬免疫抑制機(jī)理，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血的CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞百分含量，以探尋環(huán)磷酰胺對(duì)T細(xì)胞的影響。

CD3+是外周血中代表成熟T淋巴細(xì)胞最好標(biāo)志物之一，CD4+是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能最重要的樞紐細(xì)胞；CD8+亞群為免疫反應(yīng)中的直接殺傷性細(xì)胞，CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分含量直接反應(yīng)機(jī)體的免疫機(jī)能。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，試驗(yàn)各組CD3+、CD4+、CD8+在試驗(yàn)7 d時(shí)顯著降低，與楊憲勇、李霞等的研究結(jié)果[14-15]一致，這可能是環(huán)磷酰胺通過死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Fas/Fas L介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起成熟T細(xì)胞數(shù)目減少。第二種可能是通過Bax/Bcl-2(B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白/B淋巴細(xì)胞瘤-2)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，細(xì)胞脂肪變性與氧應(yīng)激使Bcl-2相關(guān)X蛋白(bcl-2 assaciated x protein，Bax)合成增多且轉(zhuǎn)移至線粒體外膜形成同源二聚體，引起線粒體PT孔打開，釋放細(xì)胞色素C，誘發(fā)細(xì)胞凋亡；而分布于線粒體外膜的Bcl-2可與Bax結(jié)合，避免Bax同源二聚體形成，抑制PT孔開放，體現(xiàn)抗凋亡作用。CTX能顯著增加成年雄性Wistar大鼠心臟組織BaxmRNA表達(dá)水平(P<0.05)，而降低抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)(P<0.05)[16]。單劑量150 mg/kg CTX作用活體小鼠，第2天紅細(xì)胞生成受到影響，凋亡增大，細(xì)胞密度減少[17]。也可能是環(huán)磷酰胺依賴能抑制一種周期素依賴性激酶4(CDK4)，導(dǎo)致細(xì)胞停滯在G1期[10]，具體原因有待進(jìn)一步研究。總之，環(huán)磷酰胺可抑制T細(xì)胞的成熟、增殖與分化。

4 小結(jié)

一定劑量的環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致仔豬生長(zhǎng)性能降低，改變免疫細(xì)胞濃度，就本試驗(yàn)而言，少量多次(60 mg/kg 3 d和 90 mg/kg 2 d)和1次大劑量(180 mg/kg)能改變機(jī)體白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞濃度，抑制T細(xì)胞的成熟、增殖與分化，具有免疫抑制作用，能構(gòu)成免疫抑制模型。由于一次大劑量(180 mg/kg)操作簡(jiǎn)便，且免疫抑制效果穩(wěn)定，推薦使用。

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[1]鐘金鳳，方熱軍. 環(huán)磷酰胺免疫抑制機(jī)制及在動(dòng)物模型上的應(yīng)用[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志，2016(10)：1541-1546.

[2]馮 焱，趙恒壽，劉佳斌，等. 環(huán)磷酰胺對(duì)肉仔雞免疫機(jī)能的影響[J]. 飼料博覽(技術(shù)版)，2007，19(10)：31-34.

[3]Harada K，Muramatsu M，Suzuki S，et al. Evaluation on the pathogenicity ofErysipelothrixtonsillarumfor pigs by immunosuppression with cyclophosphamide or dexamethasone[J]. Research in Veterinary Science，2011，90(1)：20-22.

[4]Huyan X H，Lin Y P，Gao T，et al. Immunosuppressive effect of cyclophosphamide on white blood cells and lymphocyte subpopulations from peripheral blood of Balb/c mice[J]. International Immunopharmacology，2011，11(9)：1293-1297.

[5]Derbyshire J B. The effect of immunosuppression with cyclophosphamide on an experimental porcine enterovirus infection in piglets[J]. Canadian Journal of Comparative Medicine，1983，47(2)：235-237.

[6]NRC. Nutrient requirements of swine[M]. 11th ed. Washington D C：National Academy Press，2012：40-47.

[7]Novotná B，Jelínek R. Mutagenic and teratogenic effects of cyclophosphamide on the chick embryo：chromosomal aberrations and cell proliferation in affected and unaffected tissues[J]. Teratogenesis，Carcinogenesis，and Mutagenesis，1990，10(4)：341-350.

[8]Han J，Liu Y L，F(xiàn)an W，et al. DietaryL-arginine supplementation alleviates immunosuppression induced by cyclophosphamide in weaned pigs[J]. Amino Acids，2009，37(4)：643-651.

[9]Kumar D，Tewari-Singh N，Agarwal C，et al. Nitrogen mustard exposure of murine skin induces DNA damage，oxidative stress and activation of MAPK/Akt-AP1 pathway leading to induction of inflammatory and proteolytic mediators[J]. Toxicology Letters，2015，235(3)：161-171.

[10]Lee J，Lim K T. Protection against cyclophosphamide-induced myelosuppression by ZPDC glycoprotein (24 ku)[J]. Immunological Investigations，2013，42(1)：61-80.

[11]Mackie E J. Immunosuppressive effects of cyclophosphamide in pigs[J]. American Journal of Veterinary Research，1981，42(2)：189-194.

[12]徐宏貴，方建培，黃紹良，等. 環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠骨髓造血干/祖細(xì)胞作用及機(jī)制研究[J]. 中國(guó)小兒血液與腫瘤雜志，2007，12(3)：106-110.

[13]馬增春，譚洪玲，肖成榮，等. 環(huán)磷酰胺損傷小鼠骨髓造血的機(jī)制[C]. 全國(guó)藥物毒理學(xué)會(huì)議，2007：332-333.

[14]楊憲勇. 應(yīng)用環(huán)磷酰胺構(gòu)建C57BL/6J小鼠免疫抑制模型[J]. 中國(guó)組織工程研究，2012，40(16)：7486-7489.

[15]李 霞，李殿俊，富東旭. 免疫抑制劑對(duì)小鼠胸腺及外周血、脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的影響[J]. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，39(4)：325-326，330.

[16]Asiri Y A. Probucol attenuates cyclophosphamide-induced oxidative apoptosis，p53 and Bax signal expression in rat cardiac tissues[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2010，3(5)：308-316.

[17]Juaristi J A，Aguirre M V，Todaro J S，et al. EPO receptor，Bax and Bcl-x(L) expressions in murine erythropoiesis after cyclophosphamide treatment[J]. Toxicology，2007，231(2/3)：188-199.