梅菊芬， 徐德良， 湯茶琴， 周靜峰， 邵元海

(無錫市茶葉品種研究所/江蘇省茶樹種質(zhì)改良與推廣工程技術(shù)中心，江蘇無錫 214125)

光合作用產(chǎn)物是人類賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)，光捕獲是植物光合作用的重要過程。在高等植物中，捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白(light harvesting chlorophyll a/b binding protein，LHC)是光捕獲中的重要功能蛋白，其與葉綠素a/b形成復(fù)合體，將光能迅速傳到光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的反應(yīng)中心，使光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，促進(jìn)光合反應(yīng)的進(jìn)行[1]。PSⅠ和PSⅡ都含有各自的LHC，即LHCⅠ和LHCⅡ。其中，LHCⅡ在類囊體膜上的含量最為豐富，它所結(jié)合的葉綠素約占類囊體膜上色素量的50%，目前研究較多，也是結(jié)構(gòu)較清楚的一類膜蛋白[1-3]。LHCⅡ被認(rèn)為是一類結(jié)構(gòu)相似、進(jìn)化相關(guān)、由核基因家族(Lhcb)編碼的蛋白，與色素所形成的色素蛋白復(fù)合體家族，含有保守的葉綠素結(jié)合(chlorophyllbinding，CB)結(jié)構(gòu)域，它們除進(jìn)行光能的捕獲與傳遞外，還廣泛參與了激發(fā)能在PSⅠ和PSⅡ之間的調(diào)節(jié)與分配、類囊體膜結(jié)構(gòu)的維持、光保護(hù)以及對各種環(huán)境的應(yīng)答等[4]。LHCⅡ主要由6種色素蛋白復(fù)合體組成，分別由Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5和Lhcb6編碼，其組成了4種蛋白亞復(fù)合物，LHCⅡa、LHCⅡb、LHCⅡc、LHCⅡd。其中，LHCⅡb為主體LHCⅡ，包括LHCB1、LHCB2、LHCB3；其他3種合稱為微量LHCⅡ，分別為LHCⅡa(LHCB4)、LHCⅡc(LHCB5)、LHCⅡd(LHCB6)[1]。

LHCB4別稱CP29，是PSⅡ內(nèi)部天線葉綠素a/b結(jié)合亞復(fù)合體，其為次要捕光色素蛋白，較其他蛋白復(fù)合體更接近PSⅡ核心復(fù)合物，其編碼基因?yàn)長hcb4[1]。目前已從擬南芥、秈稻、楊樹、菠菜、銀杏等多種高等植物中克隆了Lhcb4基因，并研究了其在各種生態(tài)環(huán)境下的表達(dá)情況[5-10]。

近年，茶樹育種目標(biāo)傾向葉色多樣化，白化或紫化等特異葉色品種的選育成為茶樹新品種選育的熱點(diǎn)。研究表明，光是誘導(dǎo)茶樹花青素形成的主要原因[11]，光合作用與花青素的合成之間是否存在一定關(guān)系有待于研究。本研究從紫芽中篩選到下調(diào)表達(dá)基因片段，Blastx比對為Lhcb4的部分基因片段。以該基因片段為探針，在NCBI中Blast檢索茶樹中與探針序列相似性較高的ESTs，然后利用DNAstar進(jìn)行序列拼接，得到茶樹葉綠素a/b結(jié)合蛋白CP29基因(CsLhcb4)，利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析，為后續(xù)研究CsLhcb4與花青素代謝的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

筆者所在研究組從紫芽中篩選的差異表達(dá)基因片段(D-ZY-5)，經(jīng)Blastx比對為Lhcb4的部分基因片段。

1.2 方法

1.2.1 茶樹CsLhcb4基因的電子克隆 以差異篩選的EST基因片段為查詢探針，利用NCBI中的Blastn工具，搜索茶樹EST數(shù)據(jù)庫(taxid：4442)，得到具有高度同源性(選擇相似性大于等于90%，覆蓋率大于100 bp)的EST序列，再利用DNAStar進(jìn)行重疊區(qū)域拼接和組裝，構(gòu)建重疊序列群。以重疊序列群為信息標(biāo)簽，進(jìn)一步檢索比對，搜索高度同源序列，并拼接組裝，直至沒有發(fā)現(xiàn)高度同源序列。在非冗余數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，確認(rèn)新基因序列，獲得茶樹CsLhcb4的cDNA序列。

1.2.2 茶樹CsLhcb4基因及蛋白質(zhì)序列的生物信息學(xué)鑒定 以NCBI的ORFfinder和Conserved Domain Database功能對擴(kuò)增的基因序列進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯及其保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。以Expasy的在線分析軟件對蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)(ProtParam tool)、疏水性(ProtScale)、二級(jí)結(jié)構(gòu)(SOPMA)和三維結(jié)構(gòu)分析預(yù)測(SWISS-MODEL)，同時(shí)利用在線分析工具分析無序區(qū)域(foldindex)、亞細(xì)胞定位(TargetP 1.1 Server)及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(NetPhos 3.1 Server)。利用NCBI的PSI-BLAST進(jìn)行蛋白序列同源比對，利用DNAman軟件進(jìn)行同源蛋白的氨基酸多序列比對并用Mega構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsLhcb4基因克隆及序列分析

以篩選的EST基因片段為查詢探針，利用Blastn對茶樹EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，得到2個(gè)高度同源的EST序列(FS954792.1和JK993206.1)，利用DNAStar對序列進(jìn)行重疊區(qū)域拼接和組裝，在以拼接的重疊序列群進(jìn)行檢索，得到高度同源的EST序列(FS960161.1)，重復(fù)拼接得到茶樹CsLhcb4基因cDNA序列，長度為1 085 bp。經(jīng)ORFfinder分析，該基因包含1個(gè)858 bp的ORF，編碼1個(gè)含285個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。

2.2 茶樹CP29蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用NCBI在線分析軟件Conserved Domain Database(CDD)對蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果(圖1)顯示，在茶樹葉綠素a/b連接蛋白CP29的氨基酸序列第13個(gè)和第285個(gè)之間存在光系統(tǒng)Ⅱ光捕獲復(fù)合體結(jié)構(gòu)域(PLN00187)，編碼蛋白屬于葉綠素a/b連接蛋白超家族成員。

2.3 茶樹CP29蛋白同源比對及序列進(jìn)化分析

在NCBI中的Blastp中采用PSI-Blast方法在refseq數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行氨基酸序列同源比對，結(jié)果顯示，有478個(gè)蛋白與茶樹CP29蛋白同源，一致性最大為89%，最小為32%，這些蛋白包括假定未知的蛋白、預(yù)測的蛋白、功能已鑒定的蛋白，它們都有葉綠素a/b結(jié)合蛋白超家族結(jié)構(gòu)域(PLN00187)，相對保守。在功能已鑒定的蛋白中，茶樹CP29蛋白與陸地棉CP29.1(NP001314598.1)、歐洲大葉楊CP29(XP002323575.1)、大豆CP29(NP001304343.1)、擬南芥(NP187506.1)、深山南芥(XP002873005.1)、玉米(NP001105502.1)、衣藻(XP001697193.1)、綠藻(XP005646225.1)一致性分別是87%、87%、87%、83%、83%、82%、51%、47%，這表明植物葉綠素a/b連接蛋白CP29序列在不同植物之間具有一定程度的序列分化。利用DNAman軟件將茶樹與這8個(gè)植物的CP29蛋白進(jìn)行多重比較分析，序列一致性為74.19%(圖2)。Mega構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹表明，高等植物的CP29區(qū)別于藻類，在進(jìn)化距離上較近；茶樹與大豆、歐洲大葉楊和陸地棉進(jìn)化距離最近，聚為一類(圖3)。

2.4 茶樹CP29蛋白理化性質(zhì)分析

CsLhcb4編碼的蛋白質(zhì)分子式為C1 427H2 180N366O407S4，分子量為31.1 ku，理論等電位點(diǎn)5.79。亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)占比最大，分別為11.2%和10.9%，芳香族氨基酸[苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)]33個(gè)，占比11.6%。負(fù)電荷殘基[天冬氨酸(Asp)+谷氨酸(Glu)]數(shù)為31個(gè)，正電荷殘基[精氨酸(Arg)+賴氨酸(Lys)]數(shù)為27個(gè)，脂溶系數(shù)為84，總平均疏水性為-0.099。不穩(wěn)定系數(shù)31.69，該蛋白為穩(wěn)定蛋白。無序區(qū)域預(yù)測結(jié)果表明，其存在1個(gè)無序區(qū)域1～50位氨基酸處，不可折疊性0.194，對蛋白折疊、表達(dá)水平干擾較小。

2.5 茶樹CP29蛋白疏水性分析

用ProtScale軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性/親水性分析(圖4)，正值越大表示越疏水，負(fù)值越大表示越親水，介于+0.5～-0.5之間的主要為兩性氨基酸。結(jié)果表明，Glu191疏水性最強(qiáng)，疏水性參數(shù)為2.789；Leu206和Asp207親水性最強(qiáng)，疏水性參數(shù)為-2.333。蛋白中約在183～197區(qū)域疏水性最強(qiáng)，其次是245～256、144～157區(qū)域具有較強(qiáng)的疏水性；在199～219區(qū)域親水性最強(qiáng)，其次在38～54、227～232區(qū)域具有較強(qiáng)的親水性。該蛋白的親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，預(yù)測該蛋白為親水蛋白，與ProtParam分析結(jié)果一致。

2.6 茶樹CP29蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測

結(jié)合TargetP亞細(xì)胞定位預(yù)測(表1)，蛋白定位于葉綠體。CP29為植物PSⅡ3種次要捕光色素蛋白之一，蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果符合其功能預(yù)測。

表1 茶樹CP29蛋白亞細(xì)胞定位

2.7 茶樹CP29蛋白磷酸化修飾位點(diǎn)及分析

磷酸化是蛋白翻譯前修飾的最常見的形式之一，在調(diào)節(jié)從基因表達(dá)到信號(hào)和代謝調(diào)控等所有細(xì)胞功能中都起作用[4]。CP29的磷酸化可能與植物的抗逆有關(guān)[12-13]，其磷酸化可能是調(diào)節(jié)光能的捕獲及激發(fā)能向反應(yīng)中心傳遞的一種方式，也是一種新的光保護(hù)機(jī)制。利用NetPhos 3.1預(yù)測茶樹CP29蛋白磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果(表2)顯示，CP29蛋白磷酸化位點(diǎn)有23個(gè)，其中Thr 9個(gè)，絲氨酸(Ser)10個(gè)，Tyr 4個(gè)。

2.8 茶樹CP29蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析

利用SOPMA在線預(yù)測蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是其主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中115個(gè)氨基酸可能形成無規(guī)則卷曲，占40.35%，97個(gè)氨基酸可能形成α-螺旋，占34.04%，49個(gè)氨基酸可能形成延伸鏈，占17.19%，24個(gè)氨基酸可能形成β-轉(zhuǎn)角，占8.42%，不含其他二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.9 茶樹CP29蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模及分析

利用swiss-model在線對其進(jìn)行建模，從PDB(蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫)中獲得63個(gè)同源蛋白序列，選擇其中的3jcu.1菠菜PSⅡ-LHCⅡ超分子復(fù)合物，與靶標(biāo)序列比對結(jié)果作模板，其序列一致性為88.51%，獲得其三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)。三級(jí)結(jié)構(gòu)從N端開始形成8端螺旋結(jié)構(gòu)，至C端形成較長的延伸鏈。建模結(jié)果估值(OMQE)為0.75，介于0～1之間，接近1，建模結(jié)果處于接受水平。但是QMEAN4值為-3.95，其理想值為1，因此建模結(jié)果并不十分理想。

3 討論與結(jié)論

LHC蛋白是高等植物光合作用過程中的重要功能蛋白，本研究以在紫芽中下調(diào)表達(dá)的基因片段(D-ZY-5)為查詢探針，通過電子克隆的方式得到編碼茶樹CP29蛋白基因的cDNA序列，命名為CsLhcb4，長度為1 085 bp，ORF為 858 bp，編碼285個(gè)氨基酸，分子量為31.1 ku。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明其編碼氨基酸序列第13個(gè)和第285個(gè)之間存在光系統(tǒng)Ⅱ光捕獲復(fù)合體結(jié)構(gòu)域(編號(hào)PLN00187)，屬于葉綠素a/b連接蛋白超家族成員。亞細(xì)胞定位于葉綠體上，與蛋白預(yù)測的功能相吻合。

表2 茶樹CP29蛋白磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測

氨基酸同源序列分析表明，克隆的茶樹CsLhcb4編碼氨基酸與這些序列相似性為32%～89%，總體上相對保守，屬于葉綠素a/b結(jié)合蛋白CP29。構(gòu)建進(jìn)化樹表明，茶樹與高等植物陸地棉、綠豆和煙草進(jìn)化距離最近，聚為一類。

二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是茶樹CP29的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋是一種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，能維持蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。三維結(jié)構(gòu)分析表明，基于茶樹CP29與菠菜PSⅡ-LHCⅡ超分子復(fù)合物(3jcu.1)序列同源性為88.51%，利用Swiss-Model中的同源建模法構(gòu)建茶樹CP29的三維結(jié)構(gòu)，構(gòu)建模型為單體形式。

氨基酸序列親水性/疏水性分析結(jié)果顯示，該蛋白的親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，預(yù)測該蛋白為親水蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為31.69，該蛋白為穩(wěn)定蛋白，能穩(wěn)定保持其與葉綠素a/b形成的復(fù)合體，傳輸光能，促進(jìn)光合作用。

在高等植物中，CP29在LHCⅡ中分子量最大，結(jié)構(gòu)最簡單，光譜值相對簡單，結(jié)合6個(gè)葉綠素a、2個(gè)葉綠素b和2個(gè)類胡蘿卜素分子，其結(jié)構(gòu)及功能研究相對明確[14-15]。研究表明，CP29是植物光系統(tǒng)Ⅱ天線蛋白不可或缺的結(jié)構(gòu)組成，在非光化學(xué)淬滅(NPQ)作用中至關(guān)重要，其缺失會(huì)造成光系統(tǒng)Ⅱ結(jié)構(gòu)變化，并影響光保護(hù)作用[16-18]。CP29的磷酸化可能與植物的抗逆性有一定關(guān)系，低溫、強(qiáng)光等逆境能誘導(dǎo)CP29的磷酸化，其磷酸化可在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生，并通過可逆磷酸化調(diào)節(jié)和決定LHCⅡ在2個(gè)光系統(tǒng)之間的親和性和LHCⅡ的狀態(tài)遷移[19]。

本研究通過電子克隆方式得到在高花青素茶樹中下調(diào)表達(dá)的葉綠素a/b結(jié)合蛋白CP29基因，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測其理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步研究CP29在高花青素茶樹代謝中的作用奠定了基礎(chǔ)。CP29是否通過光保護(hù)作用或磷酸化等來影響花青素的代謝有待于進(jìn)一步研究。

捕光色素蛋白有14類，最初序列上的相似性卻表明這些色素蛋白都起始于1個(gè)相同的原始基因，原始基因能夠編碼1個(gè)含跨膜螺旋的蛋白[4]。高等植物的PSⅡ外周光捕獲蛋白都在非光化學(xué)淬滅(NPQ)下發(fā)揮其作用，起到光保護(hù)作用[17]。因此，在CP29的研究基礎(chǔ)上繼續(xù)對高花青素茶樹捕光色素蛋白的表達(dá)及功能進(jìn)行研究具有一定的意義。

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