韓林賀， 丁安明， 孔英珍

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081)

果膠是存在于植物細(xì)胞胞間層以及初生細(xì)胞壁和次生細(xì)胞壁中一類成分復(fù)雜的多糖，是植物中一大類主要以半乳糖醛酸組成骨架結(jié)構(gòu)的酸性多糖所形成的復(fù)合體的統(tǒng)稱，也是雙子葉植物和除玉米外的單子葉植物細(xì)胞壁的主要組成成分，約占細(xì)胞壁組成的30%～40%[1]。根據(jù)果膠多糖大分子的成分與構(gòu)成的不同，主要可以分為以下3類：同聚半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，簡稱HG)，Ⅰ型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan Ⅰ，簡稱RG Ⅰ)和Ⅱ型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan Ⅱ，簡稱RG Ⅱ)，這3類聚糖是果膠多糖組分的主要多糖[2-4]。細(xì)胞壁中的果膠對維持細(xì)胞壁穩(wěn)定和抗壓能力有一定的作用，也是植物應(yīng)對病原體侵害的重要屏障。果膠的甲酯化和去酯化能夠引起植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能特性的改變，在果實(shí)成熟軟化、器官脫落和衰老[5-7]、花粉發(fā)育、花粉管生長[8-10]和抗逆性[11-12]等方面具有重要作用。果膠去甲酯化形成的果膠酸，會與胞外的Ca2+結(jié)合形成果膠酸鹽，使植物細(xì)胞壁硬化，導(dǎo)致植物細(xì)胞生長緩慢。同時(shí)，去甲酯化形成的甲醇和氫離子，會影響其他果膠水解酶的活性[13-14]。果膠去甲酯化的過程是由果膠甲酯酶(pectin methyl ester enzyme，簡稱PME)催化完成的，PME的活性同時(shí)又受果膠甲酯酶抑制劑(pectin methyl ester enzyme inhibitor，簡稱PMEI)的調(diào)控。Sénéchal等通過對PME17、PMEI4在擬南芥中的共表達(dá)分析和PMEI4突變體的特征分析，發(fā)現(xiàn)PMEI17和PMEI4相互作用；后來通過對體外PME/PMEI復(fù)合體生物化學(xué)特征進(jìn)行詳細(xì)分析，發(fā)現(xiàn)在一定的pH值范圍內(nèi)，PME3的酶活性直接受PMEI7調(diào)控[15-16]。PMEI廣泛存在于高等植物以及一些能降解植物細(xì)胞壁的微生物如細(xì)菌、真菌中[17]。目前人們僅對擬南芥、石松類以及桃、獼猴桃等高等植物的PMEI基因家族進(jìn)行了相關(guān)結(jié)構(gòu)分析和功能研究。Hothorn等于2004年獲得了擬南芥PMEI的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由4條反向平行的α螺旋組成，分別為α1、α2、α3、α4，構(gòu)成PMEI的活性區(qū)域；在氮末端區(qū)域有3條短的彎曲的α螺旋，分別為αa、αb、αc，維持PMEI結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。PMEI蛋白序列中有4個(gè)極為保守的半胱氨酸，分別位于α2、α3、αa、αb上[18]。Di Matteo等根據(jù)已獲得的獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑氨基酸序列，人工合成其基因序列，在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)獲得純化的PMEI蛋白，將其與從番茄中提取的PME組合，獲得二者復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)[19]。梅曉宏等發(fā)現(xiàn)，在新鮮果蔬汁中加入PMEI可以阻止果膠形成果膠酸鹽吸附果肉，防止果蔬汁變質(zhì)[20]。根據(jù)Juge等的研究，PMEI成員參與果膠新陳代謝，影響谷類植物細(xì)胞壁多糖的形成[21-22]，從而影響韌皮纖維的伸長。相關(guān)研究表明，PMEI參與果實(shí)的形成過程，番茄中的SolyPMEI在果實(shí)的發(fā)育過程中特異表達(dá)[23]，葡萄中的VvPMEI1也參與果實(shí)的成熟過程[24]。用水楊酸(SA)處理辣椒6 h后，辣椒細(xì)胞內(nèi)的PMEI含量顯著升高，表明PMEI與水楊酸信號調(diào)節(jié)有關(guān)[25-26]。在用雙氧水處理水稻幼苗 48 h 后，辣椒幼苗體內(nèi)PMEI含量顯著升高，表明其與植物體抗氧化作用有關(guān)[27]。因此，對植物中PMEI的特性及生物學(xué)功能進(jìn)行研究具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)也是進(jìn)行生物學(xué)研究的重要模式植物，但是對煙草PMEI基因家族的研究鮮見報(bào)道。煙草的主要收獲器官是葉片，葉片細(xì)胞壁中的多糖聚合物不僅維持煙葉在生長發(fā)育過程中的形態(tài)，還影響煙葉的物理特性、加工特性以及煙葉的吸食質(zhì)量。煙葉細(xì)胞壁中的果膠含量與煙葉平衡含水率、填充力、燃燒性呈正相關(guān)，與煙葉厚度、葉質(zhì)重及香氣、余味、雜氣得分、評吸總分呈負(fù)相關(guān)[28-30]。因此，研究煙草PMEI家族基因?qū)z甲酯化過程的調(diào)控作用及其對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響具有重要意義。本研究以普通煙草PMEI家族(NtPMEI)為研究對象，采用生物信息學(xué)手段對其基因家族各成員之間的進(jìn)化關(guān)系及其基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、基因本體(gene ontology，簡稱GO)分析、組織表達(dá)等進(jìn)行研究，以期為研究煙草中PMEI家族的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

普通煙草品種紅花大金元(簡稱HD)，于溫室種植，自然條件下培養(yǎng)至成熟期。取幼苗期的根、莖、葉、葉脈和成熟期的根、莖、葉、葉脈及花芽，經(jīng)處理后于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 NtPMEI家族序列鑒定與理化性質(zhì)分析

基于Wang等報(bào)道的擬南芥71個(gè)PMEI家族成員的序列[31]，利用序列相似性分析，預(yù)測煙草基因組PMEI家族。從TAIR數(shù)據(jù)庫(http：//www.arabidopsis.org/)下載擬南芥PMEI家族蛋白全長序列，從Pfam數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)下載PMEI家族蛋白結(jié)構(gòu)域序列(Pfam ID：PF04043)。將兩類序列在煙草基因組數(shù)據(jù)庫(http：//218.28.140.17/)和NCBI數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行Blastp檢索(e值≤10-15)，獲得普通煙草的PMEI類似序列，人工去除冗余序列，作為NtPMEI家族的候選序列。結(jié)合Pfam數(shù)據(jù)庫[32]中PMEI結(jié)構(gòu)域保守序列(序列號PF04043)和SMART在線分析軟件(http：//smart.embl-heidelberg.de/)[33]對候選序列進(jìn)行PMEI結(jié)構(gòu)域分析，剔除不含有該結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列，最終鑒定出90條NtPMEI家族蛋白序列。利用ExPASyProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)對所得煙草PMEI家族蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析[34]。

1.3 NtPMEI蛋白序列保守域與進(jìn)化分析

利用Muscle程序[35]對擬南芥和普通煙草PMEI家族的蛋白序列進(jìn)行多序列比對，參數(shù)選為默認(rèn)值?；诒葘Y(jié)果，利用MEGA6.0軟件[36]，采用鄰接法(neighbor-joining，簡稱NJ)構(gòu)建擬南芥和普通煙草PMEI家族進(jìn)化樹，Bootstrap檢驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為1 000。利用MEME4.11.2(Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation)[37]在線平臺(http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)對90個(gè)NtPMEI家族蛋白進(jìn)行保守基序分析，最大motif檢索值定為20。利用Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW在線平臺(http：//www.genome.jp/tools/clustalw/)進(jìn)行多序列比對，Output Format格式設(shè)置為FASTA格式。利用BoxShade Server在線平臺(http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)，將各蛋白保守區(qū)域進(jìn)行可視化。選取結(jié)構(gòu)域保守的蛋白序列為目標(biāo)序列，在SWISS-MODEL網(wǎng)站(http：//swissmodel.expasy.org/interactive)上查找三維結(jié)構(gòu)模板，根據(jù)覆蓋率、一致性百分比、試驗(yàn)可靠性選擇最適的三維結(jié)構(gòu)模板。

1.4 NtPMEI蛋白編碼基因的表達(dá)模式分析與驗(yàn)證

為分析所預(yù)測的候選NtPMEI基因的表達(dá)模式，在煙草基因組數(shù)據(jù)庫(http：//218.28.140.17/)中下載煙草基因組組織表達(dá)數(shù)據(jù)，利用R語言Bioconductor程序?qū)D(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使數(shù)據(jù)均一化，利用MeV本地軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。選擇部分候選NtPMEI基因進(jìn)行組織特異性表達(dá)驗(yàn)證，使用TRANS Kit提取總RNA，參照說明書步驟，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit合成第一鏈cDNA，作為PCR擴(kuò)增模板。以煙草管家基因actin(GenBank登錄號為EU938079.1)作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系：10 μL 2×FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)、0.6 μL正反向引物(10 μmol/L)、1 μL模板cDNA、7.8 μL ddH2O(RNase free)。在熒光定量PCR儀Applied Biosystem 7500(ABI7500)上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，程序如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)，加溶解曲線；每個(gè)樣品重復(fù)3次。用7500 software v2.0.1對結(jié)果進(jìn)行分析，并對相對表達(dá)量進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtPMEI家族蛋白序列鑒定及進(jìn)化分析

利用擬南芥PMEI家族71條蛋白全長序列和保守結(jié)構(gòu)域序列，在煙草基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastp比對，獲得105條煙草PMEI家族候選序列。結(jié)合Pfam數(shù)據(jù)庫中PMEI結(jié)構(gòu)域保守序列(序列號PF04043)和SMART在線程序，對候選序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，去除不含有PMEI結(jié)構(gòu)域的序列，在普通煙草基因組中共鑒定出90條PMEI蛋白序列。根據(jù)煙草注釋信息中基因在染色體上的位置，對90個(gè)成員進(jìn)行重新編號，以便后續(xù)研究(表1)。

將得到的90個(gè)NtPMEI家族成員全長蛋白序列與擬南芥PMEI家族71個(gè)成員進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析(圖1)，根據(jù)擬南芥的分類方式將NtPMEI家族成員分為5個(gè)亞家族(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，各個(gè)亞家族分別含有17、6、2、8、57個(gè)NtPMEI成員(圖1、表1)。通過分析NtPMEI蛋白編碼基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)基因不含有內(nèi)含子。其中，第Ⅱ、Ⅲ亞家族成員均不含有內(nèi)含子，第Ⅰ亞家族中的NtPMEI1、NtPMEI42分別含有6、5個(gè)內(nèi)含子，第Ⅳ亞家族中有3個(gè)成員各含有1個(gè)內(nèi)含子，第V亞家族中有1/2的成員含有內(nèi)含子(表1)。

2.2 NtPMEI家族蛋白理化性質(zhì)分析

對獲得的NtPMEI家族成員蛋白序列進(jìn)行理化特征分析，表1結(jié)果顯示，NtPMEI蛋白序列平均長度在284個(gè)氨基酸左右，其中序列最長的NtPMEI37和最短的NtPMEI17都屬于第Ⅴ亞家族，分別由685、108個(gè)氨基酸殘基組成。不同亞家族之間的氨基酸序列長度變化呈現(xiàn)不同規(guī)律，第Ⅱ亞家族蛋白序列長度大多在200個(gè)氨基酸左右；第Ⅴ亞家族有30%以上成員的蛋白序列長度在500個(gè)氨基酸以上。NtPMEI家族成員蛋白分子量變化范圍在11.72～75.63ku之間，變化范圍較大。NtPMEI家族成員理論等電點(diǎn)變化范圍較大，介于 3.99～10.55 之間。第Ⅰ亞家族成員理論等電點(diǎn)大多介于 4.45～6.99，只有1個(gè)蛋白的理論等電點(diǎn)為8.64，說明該家族成員蛋白序列中多為酸性氨基酸；第Ⅲ亞家族的2個(gè)成員理論等電點(diǎn)均為4.26，在酸性范圍內(nèi)，說明該亞家族成員蛋白序列中含有較多的酸性氨基酸。

表1 NtPMEI家族理化性質(zhì)分析

續(xù)表1

基因名稱亞家族染色體定位氨基酸數(shù)量(個(gè))分子量(ku)等電點(diǎn)內(nèi)含子數(shù)量(個(gè))亞細(xì)胞定位擬南芥同源基因煙草序列號NtPMEI30ⅤChr0520622.968.200CWAT4G25260Ntab0897290NtPMEI31ⅤChr0516418.049.520ChloAT1G62770Ntab0897310NtPMEI33ⅤChr0512814.035.160ChloAT2G01610Ntab0145490NtPMEI36ⅤChr0658363.947.231CWAT2G47030Ntab0936920NtPMEI37ⅤChr0668575.634.652ChloAT5G27870Ntab0977780NtPMEI38ⅤChr0620622.888.230CWAT4G25260Ntab0787520NtPMEI39ⅤChr0621724.119.770ChloAT1G62770Ntab0787510NtPMEI41ⅤChr0719721.659.340ChloAT5G20740Ntab0298990NtPMEI45ⅤChr0919721.608.130NuclAT4G25250Ntab0442870NtPMEI46ⅤChr1058765.056.871CWAT2G47030Ntab0968090NtPMEI47ⅤChr1122123.936.890ChloAT1G14890Ntab0448270NtPMEI48ⅤChr1120322.277.621ChloAT5G20740Ntab0496350NtPMEI49ⅤChr1255760.978.361VacuAT5G27870Ntab0719690NtPMEI54ⅤChr1418821.119.670ChloAT5G20740Ntab0820670NtPMEI56ⅤChr1654760.277.451ChloAT5G49180Ntab0751610NtPMEI59ⅤChr1757562.949.761NuclAT5G04960Ntab0042420NtPMEI60ⅤChr1757462.549.541NuclAT5G04960Ntab0042410NtPMEI62ⅤChr2021423.849.240ChloAT1G62770Ntab0415240NtPMEI63ⅤChr2021023.449.550CWAT1G62770Ntab0415270NtPMEI64ⅤChr2419521.489.140CWAT3G62820Ntab0948330NtPMEI68Ⅴscaffold_13121023.449.620CWAT1G62770Ntab0118820NtPMEI69Ⅴscaffold_13121323.809.250ChloAT1G62770Ntab0118870NtPMEI70Ⅴscaffold_15319421.719.850ChloAT5G20740Ntab0195860NtPMEI71Ⅴscaffold_27457363.346.941CWAT2G47030Ntab0485760NtPMEI72Ⅴscaffold_31757363.346.941CWAT2G47030Ntab0561510NtPMEI73Ⅴscaffold_34119520.9810.550ChloAT5G62350Ntab0595600NtPMEI75Ⅴscaffold_43422724.567.880ChloAT2G01610Ntab0684860NtPMEI77Ⅴscaffold_70919521.0110.020ChloAT5G62350Ntab0843700NtPMEI78Ⅴscaffold_72220623.337.590ChloAT1G14890Ntab0851410NtPMEI79Ⅴscaffold_74421123.129.510ChloAT1G62770Ntab0863320NtPMEI80Ⅴscaffold_80556462.437.701CWAT2G47030Ntab0894650NtPMEI81Ⅴscaffold_105955860.968.481VacuAT5G27870Ntab0025690NtPMEI82Ⅴscaffold_115419421.055.890ChloAT2G01610Ntab0063700NtPMEI83Ⅴscaffold_120257662.9010.092CytoAT5G04960Ntab0081000NtPMEI87Ⅴscaffold_211421022.959.480ChloAT1G62770Ntab0354790NtPMEI89Ⅴscaffold_262415216.649.350ChloAT3G62820Ntab0462850NtPMEI90Ⅴscaffold_399120622.968.220CWAT4G25260Ntab0658260

注：CW表示細(xì)胞壁，Nucl表示細(xì)胞核，Mito表示線粒體，Chlo表示葉綠體，Cyto表示細(xì)胞質(zhì)，E.R.表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，Vacu表示液泡，Plas表示質(zhì)粒。

從上述分析結(jié)果可以看出，NtPMEI同一亞家族中蛋白成員及其編碼基因在結(jié)構(gòu)和理化特征上均比較相似，從側(cè)面反映了系統(tǒng)發(fā)育分析的可靠性。

2.3 NtPMEI家族保守基序分析及PMEI結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用MEME4.11.2在線程序?qū)tPMEI家族90個(gè)成員蛋白序列進(jìn)行保守基序(motif)分析，以便進(jìn)一步了解NtPMEI家族中蛋白氨基酸序列的保守性，共鑒定出8個(gè)保守基序(圖2)。

使用Pfam和SMART對每個(gè)保守基序進(jìn)行注釋分析，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)保守基序與PMEI結(jié)構(gòu)域重合，分別為motif2、motif7、motif8。對擬南芥PMEI蛋白序列進(jìn)行保守基序分析，同樣鑒定出PMEI結(jié)構(gòu)域序列對應(yīng)3個(gè)相同的保守基序，分別為motif2、motif7、motif8(圖3)，與煙草PMEI的保守基序相同，證明了對煙草序列進(jìn)行保守基序分析結(jié)果的可靠性。與二級結(jié)構(gòu)相比較，這3個(gè)保守基序分別對應(yīng)PMEI的活性區(qū)域和氮末端螺旋區(qū)域。因此，推測煙草中moti2、moti7組成NtPMEI的活性區(qū)域，motif8維持NtPMEI結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

以第Ⅳ亞家族為例，將其成員NtPMEI15、NtPMEI58、NtPMEI65與擬南芥AtPMEI1進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)煙草和擬南芥的PMEI結(jié)構(gòu)域序列相似，都有4個(gè)極保守的半胱氨酸殘基(圖4-A)。選擇PMEI結(jié)構(gòu)保守的NtPMEI65進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，與擬南芥PMEI的三維結(jié)構(gòu)(圖4-B)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)煙草的PMEI結(jié)構(gòu)同樣由4條長的反向平行的α螺旋和3條短的α螺旋組成(圖4-C)。

2.4 NtPMEI家族的表達(dá)模式分析

從普通煙草高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中提取PMEI基因家族在煙草10個(gè)組織的表達(dá)量數(shù)據(jù)，包括播種后種子、葉脈、葉片(離體24 h)、愈傷組織、幼根、幼葉、成熟根、成熟葉、花芽、莖。對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用R語言將數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，繪制熱圖。

由圖5可以看出，有28個(gè)NtPMEI成員在所有組織中均沒有表達(dá)，其余62個(gè)成員分別在不同時(shí)期、不同組織中有所表達(dá)，約占整個(gè)亞家族的68.9%，表明大部分NtPMEI成員參與煙草的生長發(fā)育過程。其中有11個(gè)成員在所有組織中都有表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)量有明顯差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同亞家族成員在不同組織中的表達(dá)情況有較大差異，具有一定的組織特異性。第Ⅱ、Ⅲ亞家族成員在各組織中的表達(dá)量很低；第Ⅰ亞家族中有3個(gè)成員在所選取的10個(gè)組織中未有表達(dá)，其他成員在不同組織中均有表達(dá)，在幼根、花芽和莖中表達(dá)數(shù)較多；第Ⅳ亞家族成員在葉脈、莖中的表達(dá)量較高；第Ⅴ亞家族成員廣泛參與植物各階段的發(fā)育，其中在葉脈、幼葉、幼根和莖中的表達(dá)量較高。分析在幼根、成熟根中表達(dá)的基因發(fā)現(xiàn)，在幼根中表達(dá)量較高的基因在成熟根中絕大多數(shù)也有表達(dá)而且表達(dá)量相對較高，但相比在成熟根中的表達(dá)量較低。結(jié)果分析表明，NtPMEI基因家族在不同組織中的表達(dá)存在差異，這可能與基因的表達(dá)模式以及基因在組織中特異性表達(dá)和環(huán)境因素有關(guān)。

為驗(yàn)證基因芯片數(shù)據(jù)分析的可靠性，本研究選取煙草8個(gè)不同時(shí)期的組織提取RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA，進(jìn)行5個(gè)NtPMEI基因在其中的表達(dá)量驗(yàn)證。圖6顯示NtPMEI1、NtPMEI11、NtPMEI12、NtPMEI18和NtPMEI84在煙草(HD)幼苗期根、莖、葉、葉脈和成熟期根、莖、葉、葉脈及花芽中的表達(dá)情況?？傮w上看出，這5個(gè)基因在所選取的組織中均有表達(dá)，在不同組織中的表達(dá)量存在明顯差異，但表達(dá)趨勢和芯片數(shù)據(jù)大體一致。NtPMEI1、NtPMEI11和NtPMEI12 在花芽中的表達(dá)量相對較高，而NtPMEI1、NtPMEI11在成熟期的葉中幾乎不表達(dá)；NtPMEI12在幼苗期的莖和成熟期的葉中幾乎不表達(dá)，在幼苗期的葉脈中表達(dá)量也很低；NtPMEI18在成熟期的根、葉脈中表達(dá)量相對較高；NtPMEI84在幼苗期的葉中表達(dá)量相對較高。比較各基因在幼苗根、成熟根中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，除NtPMEI12外，其他4個(gè)基因在成熟根中的表達(dá)量均呈下調(diào)趨勢。

3 討論

前人研究表明，PMEI家族在植物果實(shí)成熟軟化、器官脫落和衰老、花粉發(fā)育、花粉管生長和抗逆性等多個(gè)生長發(fā)育階段均發(fā)揮重要作用。煙草是分子生物學(xué)研究的模式植物，中國煙草基因組計(jì)劃的完成，為煙草基因組PMEI家族的鑒定和進(jìn)一步的功能研究提供了便利。本研究采用生物信息學(xué)方法，從普通煙草基因組中鑒定出90條NtPMEI基因家族成員。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明，煙草PMEI家族分成5個(gè)亞家族，同一亞家族成員都能較好地聚為一類，并且相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域類型與前人研究的基本一致。對基因中內(nèi)含子和外顯子的組成進(jìn)行分析，可為基因在進(jìn)化分析研究中提供重要證據(jù)[38]。本研究對候選NtPMEI基因家族各成員的內(nèi)含子數(shù)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)NtPMEI基因家族各成員的基因結(jié)構(gòu)中都不包含內(nèi)含子，部分基因包含1～2個(gè)內(nèi)含子，只有NtPMEI1、NtPMEI42分別含有6、5個(gè)內(nèi)含子，表明NtPMEI基因家族各基因間保守性較高，該基因家族進(jìn)化程度比較高。通過將煙草PMEI結(jié)構(gòu)域保守序列與擬南芥PMEI序列作多序列比對分析，發(fā)現(xiàn)煙草PMEI序列中也含有4個(gè)極保守的半胱氨酸殘基，形成2個(gè)二硫鍵，維持PMEI的三維結(jié)構(gòu)[39]。通過以第Ⅳ亞家族中的NtPMEI65為例作三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)煙草PMEI的三級結(jié)構(gòu)和擬南芥極為相似。

組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在不同組織中均有NtPMEI成員進(jìn)行表達(dá)，說明該基因家族成員廣泛參與了煙草的生長發(fā)育過程。Wolf等的研究發(fā)現(xiàn)，AtPMEI1(AT1G48020)和AtPMEI2(AT3G17220)對促進(jìn)花粉及花粉管的形成具有一定的作用[40-41]。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，煙草中的NtPMEI3、NtPMEI19、NtPMEI50和NtPMEI53與AtPMEI1、AtPMEI2基因高度同源，推測這4個(gè)基因在煙草中也能夠影響花粉和花粉管的形成與發(fā)育。部分NtPMEI基因的驗(yàn)證結(jié)果也同樣表明，所選取的5個(gè)NtPMEIs在普通煙草的花都中有表達(dá)，表明這幾個(gè)基因參與花的發(fā)育過程。相關(guān)研究表明，PMEI基因的敲除和過表達(dá)都會對擬南芥的生理特性產(chǎn)生影響。Peaucelle等通過對AtPMEI3轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)AtPMEI3過表達(dá)會引起分生組織中同聚半乳糖醛酸(HGA)高度甲酯化， 并且影響葉序的發(fā)育[42]。煙草中的NtPMEI41、NtPMEI48、NtPMEI54和NtPMEI70與AtPMEI3基因高度同源，推測這4個(gè)基因在煙草中過表達(dá)也會影響分生組織中HGA的甲酯化程度和葉序的發(fā)育。Müller等發(fā)現(xiàn)，AtPMEI5在擬南芥中過表達(dá)會引起不正常的發(fā)育形態(tài)，如發(fā)芽率升高、莖卷曲和器官融合[43-44]。通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，NtPMEI基因家族中NtPMEI14、NtPMEI34、NtPMEI35、NtPMEI61和NtPMEI65與AtPMEI5高度同源，推測這5個(gè)基因在煙草中過表達(dá)也會導(dǎo)致植株的不正常發(fā)育。An等發(fā)現(xiàn)，辣椒中的CaPMEI1(A5X5I9)基因與水楊酸(SA)信號調(diào)節(jié)有關(guān)，能夠響應(yīng)逆境脅迫[26]。通過序列相似性比對分析，發(fā)現(xiàn)煙草中的NtPMEI4、NtPMEI22和NtPMEI23與A5X5I9基因高度同源，推測這3個(gè)基因在煙草中與抗非生物脅迫有關(guān)。Saez-Aguayo等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥種皮表皮細(xì)胞中的AtPMEI6(AT2G47670)通過抑制同聚半乳糖醛酸的甲酯化，從而提高種皮黏液質(zhì)的分泌[45]，通過序列相似性比對分析發(fā)現(xiàn)，煙草中的NtPMEI64、NtPMEI89與AtPMEI6基因高度同源，推測這2個(gè)基因在煙草中可能行使相似的功能。

綜上，本研究對普通煙草基因組中的90個(gè)PMEI家族成員進(jìn)行了進(jìn)化分析、蛋白理化性質(zhì)和功能域分析，確定了其在染色體上的位置，并通過分析芯片數(shù)據(jù)和熒光定量試驗(yàn)驗(yàn)證了部分成員的組織表達(dá)模式。通過本研究，對煙草PMEI家族成員有了初步了解，為今后PMEI家族成員的功能研究奠定了基礎(chǔ)。為了更好地了解煙草PMEI家族成員的結(jié)構(gòu)和功能，下一步將對相關(guān)基因進(jìn)行克隆、表達(dá)模式分析、功能驗(yàn)證等，探索其在煙草生長發(fā)育中的作用。

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