陳亞利，歐陽軍，孟晶茜，劉 丁，張文吉,崔琴琴,趙瑛瑛

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是一種尿酸合成增加和(或)尿酸排泄減少所引起的代謝性疾病。近年來，隨著人們生活水平提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，HUA發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢(shì)，HUA可通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等途徑引起腎小球硬化及腎間質(zhì)腎纖維化[1]。研究[2-3]表明，轉(zhuǎn)錄生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)高表達(dá)是導(dǎo)致HUA腎損害的重要環(huán)節(jié)，HUA可誘導(dǎo)上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，趨化炎癥細(xì)胞誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控一些細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白基因的表達(dá)，參與HUA腎損害的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)及細(xì)胞增殖等過程[4-6]。姜黃素是一種從姜黃提取出來的植物多酚，具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化作用。研究[7]發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病等慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展中，姜黃素可通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等過程發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。但目前關(guān)于姜黃素對(duì)HUA腎臟保護(hù)作用的研究較少，本研究擬通過建立HUA大鼠模型，觀察姜黃素對(duì)HUA大鼠腎臟組織中TGF-β1及NF-κB表達(dá)的影響，探討姜黃素腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，200～250 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證書編號(hào)：43004700032287。每籠4只，予12 h光照、12 h黑暗交替，溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%，自由飲水及進(jìn)食。氧嗪酸鉀、羧甲基纖維素鈉和姜黃素(美國Sigma公司)，兔抗鼠TGF-β1抗體(英國Abcam公司)，兔抗鼠NF-κB 抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2HUA模型制備及處理方法大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、氧嗪酸鉀組、氧嗪酸鉀+姜黃素(聯(lián)合)組，每組12只。氧嗪酸鉀組及聯(lián)合組給予750 mg/kg氧嗪酸鉀灌胃[溶于5 g/L羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)中]4周，制備HUA模型[8]。模型成功后，聯(lián)合組給予姜黃素200 mg/kg， 1次/d灌胃，進(jìn)行8周，對(duì)照組及氧嗪酸鉀組給予等量的10 g/L CMC-Na混懸液灌胃，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行12周。

1.3檢測(cè)項(xiàng)目及方法實(shí)驗(yàn)0、4、12周稱體重，12周將大鼠放入代謝籠留24 h尿量，期間自由進(jìn)食，自由飲水，將收集的尿液3 000 r/min離心5 min后取上清液，用日立全自動(dòng)生化儀檢測(cè)24 h尿蛋白定量；采眶靜脈血1.5 mL，4 500 r/min離心10 min，取血清，用日立全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、胱抑素C(Cys-C)。

1.4腎臟病理學(xué)檢查和腎臟組織中TGF-β1、NF-κB蛋白檢測(cè)于第12周水合氯醛腹腔注射麻醉后處死大鼠，心臟取血后迅速分離雙側(cè)腎臟，置于40 g/L多聚甲醛固定液固定24 h，石蠟包埋后切片，厚度3 μm，行HE染色及Masson染色，光鏡下觀察腎臟組織病理變化，并行TGF-β1、NF-κB免疫組織化學(xué)染色，陽性信號(hào)為棕黃色著色，在高倍鏡視野下選取10個(gè)不重疊的視野，用Image-pro-plus version 6.0圖像分析軟件測(cè)定TGF-β1、NF-κB在腎臟組織中的表達(dá)量，并進(jìn)行半定量評(píng)分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組大鼠BUN、Scr、Cys-C、24 h尿蛋白定量水平的差異，應(yīng)用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清UA水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般狀況比較實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組大鼠一般狀況良好，飲食正常；氧嗪酸鉀組大鼠出現(xiàn)精神欠佳，皮毛干枯，發(fā)黃，光澤度差； 聯(lián)合組大鼠經(jīng)過治療干預(yù)后，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，毛發(fā)改善。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均無死亡。

2.2各組大鼠生化指標(biāo)比較見表1。

2.3各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清UA水平比較見表2。實(shí)驗(yàn)前，3組大鼠血清UA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)第4、12周，與對(duì)照組相比，氧嗪酸鉀組及聯(lián)合組UA水平升高(P<0.05)，氧嗪酸鉀組與聯(lián)合組尿酸水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4各組大鼠腎臟病理改變見圖1。對(duì)照組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清楚，基底膜厚度均一，毛細(xì)血管腔開放良好，間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生；氧嗪酸鉀組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯腫大，部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小管輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織成分明顯；聯(lián)合組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清楚，無明顯腫大，毛細(xì)血管腔開放良好，腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤較氧嗪酸鉀組明顯減輕，纖維組織成分明顯減少。

2.5各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、NF-κB蛋白檢測(cè)結(jié)果見表3、圖2。對(duì)照組大鼠腎小球及腎小管TGF-β1、NF-κB均少量表達(dá)；氧嗪酸鉀組及聯(lián)合組表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，主要在腎小球及腎小管表達(dá)；與氧嗪酸鉀組相比，聯(lián)合組表達(dá)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠BUN、Scr、Cys-C、24 h尿蛋白定量水平比較(n=12)

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與氧嗪酸鉀組比較，P<0.05

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清UA水平比較(n=12) μmol/L

F組別=202.209，F(xiàn)時(shí)間=348.146，F(xiàn)交互=13.758；P均<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05

表3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、NF-κB蛋白半定量分析比較 (n=12)

FTGF-β1=51.551,FNF-κB=40.288,P均<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與氧嗪酸鉀組比較，P<0.05

1：HE染色；2：Masson染色；A：對(duì)照組； B：氧嗪酸鉀組；C：聯(lián)合組圖1 3組大鼠腎臟病理學(xué)變化(HE和Masson染色,×400)

3 討論

傳統(tǒng)認(rèn)為，HUA主要通過尿酸鹽晶體在腎臟沉積引起腎臟損傷，其機(jī)制類似痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；近年來多項(xiàng)研究[9-12]表明，無癥狀HUA可通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)等引起腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氧嗪酸鉀組及聯(lián)合組于第4周血清UA水平升高，提示單獨(dú)應(yīng)用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀可成功建立HUA模型。研究[6]發(fā)現(xiàn)，在糖尿腎病等慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展中，姜黃素可通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及調(diào)控多種細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)第12周，與對(duì)照組比較，氧嗪酸鉀組的Scr、BUN及Cys-C水平均明顯升高；經(jīng)姜黃素干預(yù)后，聯(lián)合組的Scr、BUN及Cys-C均明顯下降，提示姜黃素對(duì)HUA引起的腎損傷具有保護(hù)作用。正常情況下，大部分蛋白不能通過腎小球?yàn)V過膜，尿中的蛋白量極少，當(dāng)腎小球?yàn)V過膜受損時(shí)可出現(xiàn)蛋白尿增加[13]。本研究結(jié)果顯示，12周氧嗪酸鉀組的24 h尿蛋白定量較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述報(bào)道相符，但其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1：TGF-β1；2：NF-κB；A：對(duì)照組； B：氧嗪酸鉀組；C：聯(lián)合組圖2 3組大鼠腎臟組織中TGF-β1、NF-κB蛋白表達(dá)(SP，×400)

姜黃素是姜黃的主要成分，屬于植物多酚，具有廣泛的生物活性， 如抗炎、抗氧化、抗癌和促進(jìn)傷口愈合等特性[14]。TGF-β1是目前主要的致組織纖維化的細(xì)胞因子，TGF-β1高表達(dá)與腎臟損傷關(guān)系密切，不僅參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[15-16]，在HUA腎病中也發(fā)揮重要作用[2-3]。TGF-β1在正常腎組織內(nèi)較少表達(dá)，而在受損的腎小球、腎小管內(nèi)表達(dá)增加。TGF-β1不僅能夠抑制ECM降解，還能夠誘導(dǎo)包括黏連蛋白在內(nèi)的多種ECM成分表達(dá)并積聚在腎小球、腎間質(zhì)內(nèi)，引起腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化[17-18]。Zhu等[19]的研究結(jié)果顯示，姜黃素通過調(diào)控mTOR/Akt通路，下調(diào)TGF-β1表達(dá)，減緩EMT，在慢性腎臟病及腎移植中發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。Ho等[20]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過拮抗Wnt/β-catenin信號(hào)抑制TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞EMT，從而延緩糖尿病腎病間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，氧嗪酸鉀組TGF-β1表達(dá)量較其他組明顯增強(qiáng)，其在腎小球、腎小管均強(qiáng)陽性表達(dá)；與氧嗪酸鉀組比較，聯(lián)合組TGF-β1表達(dá)明顯減少，且聯(lián)合組腎功能及腎間質(zhì)纖維化程度較氧嗪酸鉀組均明顯好轉(zhuǎn)，表明姜黃素可通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

普遍被認(rèn)為NF-κB是許多細(xì)胞因子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6 的表達(dá)，從而在機(jī)體的炎癥、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、凋亡等方面發(fā)揮重要作用[3]。研究[21]表明：在糖尿病腎病大鼠模型中，姜黃素可通過下調(diào)P-300及NF-κB的表達(dá)，減輕腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)和腎組織纖維化。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氧嗪酸鉀組NF-κB表達(dá)量增加，且以腎小管間質(zhì)表達(dá)為主；聯(lián)合組NF-κB表達(dá)明顯減少，腎功能也較模型組模型改善，但UA水平無明顯下降。本研究結(jié)果提示姜黃素可能通過減輕氧化應(yīng)激調(diào)控NF-κB的表達(dá)，減輕腎臟炎癥反應(yīng)及腎組織纖維化。

近年來，姜黃素的在HUA的藥理作用受到極大關(guān)注，Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)在果糖引起的HUA大鼠模型中，姜黃素可能通過抑制JAK-STAT的激活及TGF-β1的過表達(dá)，上調(diào)腎臟NO水平，起到改善腎臟內(nèi)皮功能障礙和提高尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能力，從而具有降UA及腎臟保護(hù)作用。Ao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過抑制尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1，促進(jìn)UA排泄，從而有望成為新型的治療痛風(fēng)的藥物。本研究結(jié)果顯示，與氧嗪酸鉀組相比，聯(lián)合組UA值未見明顯下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與本實(shí)驗(yàn)周期短及樣本量少有關(guān)，有待增大樣本及延長實(shí)驗(yàn)周期進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，單獨(dú)應(yīng)用氧嗪酸鉀可成功建立HUA模型；HUA可上調(diào) TGF-β1及NF-κB的表達(dá)，引起腎臟損傷；姜黃素具有抗氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，可以通過下調(diào)TGF-β1和NF-κB的表達(dá)，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，為HUA的治療提供新思路。

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