陳亞利，歐陽軍，孟晶茜，劉 丁，張文吉,崔琴琴,趙瑛瑛

1)鄭州大學第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學醫(yī)藥科學研究院內(nèi)分泌實驗室 鄭州 450052

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是一種尿酸合成增加和(或)尿酸排泄減少所引起的代謝性疾病。近年來，隨著人們生活水平提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，HUA發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢，HUA可通過炎癥反應、氧化應激等途徑引起腎小球硬化及腎間質(zhì)腎纖維化[1]。研究[2-3]表明，轉(zhuǎn)錄生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)高表達是導致HUA腎損害的重要環(huán)節(jié)，HUA可誘導上調(diào)TGF-β1的表達，趨化炎癥細胞誘導上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控一些細胞因子、趨化因子和蛋白基因的表達，參與HUA腎損害的炎癥反應、氧化應激、免疫反應及細胞增殖等過程[4-6]。姜黃素是一種從姜黃提取出來的植物多酚，具有強大的抗炎、抗氧化作用。研究[7]發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病等慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展中，姜黃素可通過減輕氧化應激、炎癥反應等過程發(fā)揮腎臟保護作用。但目前關(guān)于姜黃素對HUA腎臟保護作用的研究較少，本研究擬通過建立HUA大鼠模型，觀察姜黃素對HUA大鼠腎臟組織中TGF-β1及NF-κB表達的影響，探討姜黃素腎臟保護作用的可能機制。

1 對象與方法

1.1實驗動物和試劑SPF級雄性SD大鼠36只，200～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證書編號：43004700032287。每籠4只，予12 h光照、12 h黑暗交替，溫度(22±2)℃，相對濕度控制在50%～60%，自由飲水及進食。氧嗪酸鉀、羧甲基纖維素鈉和姜黃素(美國Sigma公司)，兔抗鼠TGF-β1抗體(英國Abcam公司)，兔抗鼠NF-κB 抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2HUA模型制備及處理方法大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、氧嗪酸鉀組、氧嗪酸鉀+姜黃素(聯(lián)合)組，每組12只。氧嗪酸鉀組及聯(lián)合組給予750 mg/kg氧嗪酸鉀灌胃[溶于5 g/L羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)中]4周，制備HUA模型[8]。模型成功后，聯(lián)合組給予姜黃素200 mg/kg， 1次/d灌胃，進行8周，對照組及氧嗪酸鉀組給予等量的10 g/L CMC-Na混懸液灌胃，實驗共進行12周。

1.3檢測項目及方法實驗0、4、12周稱體重，12周將大鼠放入代謝籠留24 h尿量，期間自由進食，自由飲水，將收集的尿液3 000 r/min離心5 min后取上清液，用日立全自動生化儀檢測24 h尿蛋白定量；采眶靜脈血1.5 mL，4 500 r/min離心10 min，取血清，用日立全自動生化儀檢測血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、胱抑素C(Cys-C)。

1.4腎臟病理學檢查和腎臟組織中TGF-β1、NF-κB蛋白檢測于第12周水合氯醛腹腔注射麻醉后處死大鼠，心臟取血后迅速分離雙側(cè)腎臟，置于40 g/L多聚甲醛固定液固定24 h，石蠟包埋后切片，厚度3 μm，行HE染色及Masson染色，光鏡下觀察腎臟組織病理變化，并行TGF-β1、NF-κB免疫組織化學染色，陽性信號為棕黃色著色，在高倍鏡視野下選取10個不重疊的視野，用Image-pro-plus version 6.0圖像分析軟件測定TGF-β1、NF-κB在腎臟組織中的表達量，并進行半定量評分。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0進行分析，應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組大鼠BUN、Scr、Cys-C、24 h尿蛋白定量水平的差異，應用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析比較各組大鼠不同時間點血清UA水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般狀況比較實驗期間，對照組大鼠一般狀況良好，飲食正常；氧嗪酸鉀組大鼠出現(xiàn)精神欠佳，皮毛干枯，發(fā)黃，光澤度差； 聯(lián)合組大鼠經(jīng)過治療干預后，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，毛發(fā)改善。實驗期間各組大鼠均無死亡。

2.2各組大鼠生化指標比較見表1。

2.3各組大鼠不同時間點血清UA水平比較見表2。實驗前，3組大鼠血清UA水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，實驗第4、12周，與對照組相比，氧嗪酸鉀組及聯(lián)合組UA水平升高(P<0.05)，氧嗪酸鉀組與聯(lián)合組尿酸水平差異無統(tǒng)計學意義。

2.4各組大鼠腎臟病理改變見圖1。對照組大鼠腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清楚，基底膜厚度均一，毛細血管腔開放良好，間質(zhì)未見炎性細胞浸潤、纖維組織增生；氧嗪酸鉀組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯腫大，部分腎小管上皮細胞腫脹，腎小管輕度擴張，腎間質(zhì)少量炎性細胞浸潤，纖維組織成分明顯；聯(lián)合組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清楚，無明顯腫大，毛細血管腔開放良好，腎小管間質(zhì)炎性細胞浸潤較氧嗪酸鉀組明顯減輕，纖維組織成分明顯減少。

2.5各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、NF-κB蛋白檢測結(jié)果見表3、圖2。對照組大鼠腎小球及腎小管TGF-β1、NF-κB均少量表達；氧嗪酸鉀組及聯(lián)合組表達量明顯增加(P<0.05)，主要在腎小球及腎小管表達；與氧嗪酸鉀組相比，聯(lián)合組表達量減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠BUN、Scr、Cys-C、24 h尿蛋白定量水平比較(n=12)

*：與對照組比較，P<0.05；#：與氧嗪酸鉀組比較，P<0.05

表2 各組大鼠不同時間點血清UA水平比較(n=12) μmol/L

F組別=202.209，F(xiàn)時間=348.146，F(xiàn)交互=13.758；P均<0.001；*：與對照組比較，P<0.05

表3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、NF-κB蛋白半定量分析比較 (n=12)

FTGF-β1=51.551,FNF-κB=40.288,P均<0.001；*：與對照組比較，P<0.05；#：與氧嗪酸鉀組比較，P<0.05

1：HE染色；2：Masson染色；A：對照組； B：氧嗪酸鉀組；C：聯(lián)合組圖1 3組大鼠腎臟病理學變化(HE和Masson染色,×400)

3 討論

傳統(tǒng)認為，HUA主要通過尿酸鹽晶體在腎臟沉積引起腎臟損傷，其機制類似痛風性關(guān)節(jié)炎；近年來多項研究[9-12]表明，無癥狀HUA可通過炎癥反應、氧化應激及激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)等引起腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，氧嗪酸鉀組及聯(lián)合組于第4周血清UA水平升高，提示單獨應用尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀可成功建立HUA模型。研究[6]發(fā)現(xiàn)，在糖尿腎病等慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展中，姜黃素可通過減輕氧化應激、炎癥反應及調(diào)控多種細胞因子的表達，發(fā)揮腎臟保護作用。本研究結(jié)果顯示：實驗第12周，與對照組比較，氧嗪酸鉀組的Scr、BUN及Cys-C水平均明顯升高；經(jīng)姜黃素干預后，聯(lián)合組的Scr、BUN及Cys-C均明顯下降，提示姜黃素對HUA引起的腎損傷具有保護作用。正常情況下，大部分蛋白不能通過腎小球濾過膜，尿中的蛋白量極少，當腎小球濾過膜受損時可出現(xiàn)蛋白尿增加[13]。本研究結(jié)果顯示，12周氧嗪酸鉀組的24 h尿蛋白定量較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，與上述報道相符，但其確切機制有待進一步研究。

1：TGF-β1；2：NF-κB；A：對照組； B：氧嗪酸鉀組；C：聯(lián)合組圖2 3組大鼠腎臟組織中TGF-β1、NF-κB蛋白表達(SP，×400)

姜黃素是姜黃的主要成分，屬于植物多酚，具有廣泛的生物活性， 如抗炎、抗氧化、抗癌和促進傷口愈合等特性[14]。TGF-β1是目前主要的致組織纖維化的細胞因子，TGF-β1高表達與腎臟損傷關(guān)系密切，不僅參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[15-16]，在HUA腎病中也發(fā)揮重要作用[2-3]。TGF-β1在正常腎組織內(nèi)較少表達，而在受損的腎小球、腎小管內(nèi)表達增加。TGF-β1不僅能夠抑制ECM降解，還能夠誘導包括黏連蛋白在內(nèi)的多種ECM成分表達并積聚在腎小球、腎間質(zhì)內(nèi)，引起腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化[17-18]。Zhu等[19]的研究結(jié)果顯示，姜黃素通過調(diào)控mTOR/Akt通路，下調(diào)TGF-β1表達，減緩EMT，在慢性腎臟病及腎移植中發(fā)揮腎臟保護作用。Ho等[20]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過拮抗Wnt/β-catenin信號抑制TGF-β1誘導腎小管上皮細胞EMT，從而延緩糖尿病腎病間質(zhì)纖維化的進展。本研究結(jié)果顯示，氧嗪酸鉀組TGF-β1表達量較其他組明顯增強，其在腎小球、腎小管均強陽性表達；與氧嗪酸鉀組比較，聯(lián)合組TGF-β1表達明顯減少，且聯(lián)合組腎功能及腎間質(zhì)纖維化程度較氧嗪酸鉀組均明顯好轉(zhuǎn)，表明姜黃素可通過下調(diào)TGF-β1的表達而發(fā)揮腎臟保護作用。

普遍被認為NF-κB是許多細胞因子的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控多種細胞因子如TNF-α、IL-6 的表達，從而在機體的炎癥、免疫應答、細胞增殖、凋亡等方面發(fā)揮重要作用[3]。研究[21]表明：在糖尿病腎病大鼠模型中，姜黃素可通過下調(diào)P-300及NF-κB的表達，減輕腎間質(zhì)炎癥反應和腎組織纖維化。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，氧嗪酸鉀組NF-κB表達量增加，且以腎小管間質(zhì)表達為主；聯(lián)合組NF-κB表達明顯減少，腎功能也較模型組模型改善，但UA水平無明顯下降。本研究結(jié)果提示姜黃素可能通過減輕氧化應激調(diào)控NF-κB的表達，減輕腎臟炎癥反應及腎組織纖維化。

近年來，姜黃素的在HUA的藥理作用受到極大關(guān)注，Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)在果糖引起的HUA大鼠模型中，姜黃素可能通過抑制JAK-STAT的激活及TGF-β1的過表達，上調(diào)腎臟NO水平，起到改善腎臟內(nèi)皮功能障礙和提高尿酸轉(zhuǎn)運蛋白能力，從而具有降UA及腎臟保護作用。Ao等[23]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過抑制尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運體1，促進UA排泄，從而有望成為新型的治療痛風的藥物。本研究結(jié)果顯示，與氧嗪酸鉀組相比，聯(lián)合組UA值未見明顯下降，差異無統(tǒng)計學意義，考慮可能與本實驗周期短及樣本量少有關(guān)，有待增大樣本及延長實驗周期進一步驗證。

綜上所述，單獨應用氧嗪酸鉀可成功建立HUA模型；HUA可上調(diào) TGF-β1及NF-κB的表達，引起腎臟損傷；姜黃素具有抗氧化應激及炎癥反應，可以通過下調(diào)TGF-β1和NF-κB的表達，發(fā)揮腎臟保護作用，為HUA的治療提供新思路。

[1] ROMI MM, ARFIAN N, TRANGGONO U, et al. Uric acid causes kidney injury through inducing fibroblast expansion, Endothelin-1 expression, and inflammation[J]. BMC Nephrol, 2017, 18(1): 326

[2] HONG Q, YU S, GENG X, et al. High concentrations of uric acid inhibit endothelial cell migration via miR-663 which regulates phosphatase and tensin homolog by targeting transforming growth factor-β1[J]. Microcirculation, 2015, 22(4): 306

[3] 林章梅,張榮山,范晨雪,等.非布司他對高尿酸血癥大鼠腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血清IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子β1的影響[J].中華內(nèi)科雜志,2017,56(5):338

[4] GUIJARRO C, EGIDO J. Transcription factor-kappa B (NF-kappa B) and renal disease[J]. Kidney Int, 2001, 59(2): 415

[5] ZHOU Y, FANG L, JIANG L, et al. Uric acid induces renal inflammation via activating tubular NF-κB signaling pathway[J]. PLoS One, 2012, 7(6): e39738

[6] LIU H, XIONG J, HE T, et al. High uric acid-induced epithelial-mesenchymal transition of renal tubular epithelial cells via the TLR4/NF-κB signaling pathway[J]. Am J Nephrol, 2017, 46(4): 333

[7] ALI BH, AL-SALAM S, AL SULEIMANI Y, et al. Curcumin ameliorates kidney function and oxidative stress in experimental chronic kidney disease[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2018, 122(1): 65

[9] MAZZALI M, HUGHES J, KIM YG, et al. Elevated uric acid increases blood pressure in the rat by a novel crystal-independent mechanism[J]. Hypertension, 2001, 38(5): 1101

[10]SANCHEZ-LOZADA LG, SOTO V, TAPIA E,et al. Role of oxidative stress in the renal abnormalities induced by experimental hyperuricemia[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,295(4):F1134

[11]CHOI YJ, YOON Y, LEE KY, et al. Uric acid induces endothelial dysfunction by vascular insulin resistance associated with the impairment of nitric oxide synthesis[J]. FASEB J, 2014, 28(7): 3197

[12]SANCHEZ-LOZADA LG, TAPIA E, SANTAMAra J, et al. Mild hyperuricemia induces vasoconstriction and maintains glomerular hypertension in normal and remnant kidney rats [J].Kidney Int,2005,67(1):237

[13]ASAKAWA S, SHIBATA S, MORIMOTO C, et al. Podocyte injury and albuminuria in experimental hyperuricemic model rats[J]. Oxid Med Cell Longev, 2017, 2017: 3759153

[14]AGGARWAL BB, SUNG B. Pharmacological basis for the role of curcumin in chronic diseases: an age-old spice with modern targets[J]. Trends Pharmacol Sci, 2009, 30(2): 85

[15]楊瑞鳳,王建生,張宛哲, 等.活性維生素 D3對糖尿病大鼠腎臟 BMP-7及 TGF-β1表達的影響[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2013,48(5):616

[16]徐靜,易蘭蘭,張春虹, 等.二酯酰甘油-蛋白激酶C信號傳導系統(tǒng)和細胞因子與糖尿病腎病的關(guān)系[J].西安交通大學學報(醫(yī)學版),2006,27(2):168

[17]ZEISBERG M, DUFFIELD JS. Resolved: EMT produces fibroblasts in the kidney[J]. J Am Soc Nephrol, 2010, 21(8): 1247

[18]DERYNCK R, ZHANG YE. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling[J]. Nature, 2003, 425(6958): 577

[19]ZHU FQ, CHEN MJ, ZHU M, et al. Curcumin suppresses epithelial-mesenchymal transition of renal tubular epithelial cells through the inhibition of Akt/mTOR pathway[J]. Biol Pharm Bull, 2017, 40(1): 17

[20]HO C, HSU YC, LEI CC, et al. Curcumin rescues diabetic renal fibrosis by targeting superoxide-mediated Wnt signaling pathways[J]. Am J Med Sci, 2016, 351(3): 286

[21]CHIU J, KHAN ZA, FARHANGKHOEE H, et al. Curcumin prevents diabetes-associated abnormalities in the kidneys by inhibiting p300 and nuclear factor-kappaB[J]. Nutrition, 2009, 25(9): 964

[22]ZHANG DM, LI YC, XU D, et al. Protection of curcumin against fructose-induced hyperuricaemia and renal endothelial dysfunction involves NO-mediated JAK-STAT signalling in rats[J]. Food Chem, 2012, 134(4): 2184

[23]AO GZ, ZHOU MZ, LI YY, et al. Discovery of novel curcumin derivatives targeting xanthine oxidase and urate transporter 1 as anti-hyperuricemic agents[J]. Bioorg Med Chem, 2017, 25(1): 166