徐晶晶，張可擎，林麗珍，向云亞

（1.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建廈門361023； 2.河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院，河南鄭州450000）

側(cè)柏葉為柏科植物側(cè)柏（Platycladus orientalis(L.)Franco）的干燥枝梢和葉。中醫(yī)認(rèn)為側(cè)柏葉氣清香，味苦澀，性寒，歸肺、肝、脾經(jīng)，具有涼血止血、化痰止咳，生發(fā)烏發(fā)之功效，用于吐血、衄血、咯血、便血、崩漏下血、肺熱咳嗽、血熱脫發(fā)、須發(fā)早白[1]。側(cè)柏葉作為傳統(tǒng)的中藥，其烏發(fā)功能一直被人忽略。而在諸多古今文獻(xiàn)中記載其主要功能為烏發(fā)和生發(fā)，在《本草綱目》中謂其：浸油，生發(fā)，燒汁，黑發(fā)。和豬脂，沐發(fā)長黑[2]。側(cè)柏葉單獨或配伍白鮮皮、何首烏、骨碎補等浸酒，浸液外涂患處，治療脫發(fā)效果良好[3]。鮮側(cè)柏葉浸泡于60%vol的酒精中，7 d后濾取藥液，涂擦毛發(fā)脫落部位，每日3次可治療脂溢性皮炎與脫發(fā)、發(fā)早白等[4-7]。趙永光等[8]研究認(rèn)為，側(cè)柏葉的生發(fā)烏發(fā)作用主要在于側(cè)柏葉總黃酮提取液可激活毛母細(xì)胞和促進(jìn)頭皮血液循環(huán)，復(fù)活毛發(fā)生長能力衰退的毛囊和促進(jìn)血液循環(huán)，增加頭部的營養(yǎng)成分而發(fā)揮養(yǎng)發(fā)、生發(fā)作用。本實驗采用正交試驗設(shè)計，以總黃酮含量、槲皮苷含量的綜合評分為指標(biāo)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提時間對側(cè)柏葉生發(fā)酒提取工藝的影響，優(yōu)化側(cè)柏葉生發(fā)酒的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

試藥：鮮側(cè)柏葉藥材購自北京同仁堂，經(jīng)鑒定為柏科植物側(cè)柏（Platycladus orientalis(L.)Franco）的干燥枝梢和葉。蘆丁(四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq16101104，純度＞98%)，槲皮苷(四川省維克奇生物科技有限公司，批號為wkq16080402，純度＞98%)。水為純凈水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：Waters2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，UV-1800紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；CP124C型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；RT-04型粉碎機，北京興時利和科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試驗方法

見實驗步驟及方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 側(cè)柏葉總黃酮的含量測定

2.1.1 供試液的制備

對照液的制備：精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品10.74 mg于小燒杯中，取適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容至50 mL搖勻，即得蘆丁對照品母液（每1 mL中含無水蘆丁0.21 mg）。

樣品溶液的制備：精密量取5 mL側(cè)柏葉酒，置于水浴上蒸干，以甲醇溶解，過濾，濾液至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻即得[9]。

2.1.2 實驗條件的選擇

2.1.2.1 吸收波長的確定

取側(cè)柏葉酒1號樣品溶液10 mL置于50 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液2 mL，搖勻，放置6 min(不斷振搖)，加入10%硝酸鋁溶液2 mL，搖勻，放置6 min(不斷振搖)，加1 mol/L氫氧化鈉溶液20 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，采用分光光度計法，200～800 nm處掃描，由掃描結(jié)果確定測定波長為500 nm[10-11]。

2.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精確量取標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL和12.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，各加水至12 mL，添加5%的亞硝酸鈉溶液2.0 mL，混勻，放置6 min，加10%的硝酸鋁溶液2.0 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol/L的氫氧化鈉試液20.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，在分光光度計500 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。線性回歸方程為y=11.735x-0.0101，相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2.3 樣品含量的測定

吸取待測樣液10 mL及10 mL蒸餾水作為空白對照，分別置于50 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液2 mL，搖勻，放置6 min(不斷振搖)，加入10%硝酸鋁溶液2 mL，搖勻，放置6 min(不斷振搖)，加1 mol/L氫氧化鈉溶液20 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，在分光光度計500 nm波長處測定吸光度，對比標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算總黃酮含量，結(jié)果見表1。

2.1.3 重復(fù)性實驗

取待測樣液6份，按照方法2.1.2.3測定樣液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和稀釋倍數(shù)，計算側(cè)柏葉酒中的總黃酮含量，得到RSD=2.59%（n=6），重復(fù)性良好。

2.1.4 加樣回收率實驗

取已測定含量的側(cè)柏葉酒樣品溶液，按照已知含量的80%、100%、120%加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按照方法2.1.2.3測定回收率，結(jié)果見表1。

2.2 槲皮苷含量的測定

2.2.1 色譜條件

表1 側(cè)柏葉酒中總黃酮回收率實驗

圖2 側(cè)柏葉酒的HPLC

Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm,5 μm），流動相為甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液-冰醋酸（40∶60∶1.5），檢測波長 254 nm[1，12]，體積流量1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，見圖2。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮苷對照品4.83 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，添加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密量取側(cè)柏葉酒1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進(jìn)樣前用0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取槲皮苷對照品溶液0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得槲皮苷系列對照品溶液。將各對照品溶液，按2.2.1項中色譜條件測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得槲皮苷回歸方程為Y=27595X+629（R2=0.9996），線性范圍為3.864～13.524 μg。

表2 槲皮苷的加樣回收率試驗

2.2.5 精密度試驗

分別取2.2.4項中槲皮苷高、中、低3個質(zhì)量濃度的對照品溶液，按照2.2.1項中色譜條件，每個濃度分別重復(fù)進(jìn)樣5次，槲皮苷高、中、低質(zhì)量濃度的RSD分別為0.2%、0.6%、1.0%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h按照2.2.1項中色譜條件進(jìn)樣，測得槲皮苷質(zhì)量濃度的RSD為0.6%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗

取側(cè)柏葉酒樣品，按照2.2.3項中處理方法平行制備5份，按照2.2.1項中的色譜條件進(jìn)樣，計算含量。其RSD為0.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的側(cè)柏葉酒1 mL，分別按含量的80%、100%、120%加入槲皮苷對照品溶液，按照2.2.1項中的色譜條件進(jìn)樣，計算槲皮苷的平均加樣回收率為100.60%、100.30%、101.01%，RSD為1.89%、1.49%、1.19%，結(jié)果見表2。

2.3 側(cè)柏葉生發(fā)酒制備工藝的優(yōu)化

選用L9(34)正交試驗，以總黃酮含量、槲皮苷含量的綜合評分為指標(biāo)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、料液比(B)和提取時間(C)對提取效果的影響，從而確定最佳提取工藝條件。權(quán)重分配總黃酮含量占0.7，槲皮苷含量占0.3。具體計算方法為9個樣品中，每一個樣品的總黃酮、槲皮苷含量分別除以9個樣品中總黃酮、槲皮苷含量的最大值，然后乘以權(quán)重系數(shù)，得到總黃酮、槲皮苷含量在該樣本中的綜合評分的貢獻(xiàn)值，同一樣品的總黃酮、槲皮苷含量貢獻(xiàn)值之和即為該樣品的綜合評分[13]。因素水平見表3，試驗安排及結(jié)果見表4，方差分析見表5。由表4極差分析結(jié)果可知，各因素對結(jié)果的影響順序為C＞A＞B，即提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比。由表5方差分析可知提取時間對提取工藝有顯著影響，并根據(jù)綜合評分結(jié)果，選擇最優(yōu)工藝條件A1B3C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶12，提取時間12 d。

表3 側(cè)柏葉生發(fā)酒的提取工藝正交試驗因素水平

2.4 驗證試驗

稱取新鮮側(cè)柏葉藥材粉末各6 g，按最佳工藝條件A1B3C3重復(fù)3次試驗，驗證該工藝條件的穩(wěn)定性，結(jié)果總黃酮的平均含量為12.56 mg/g，槲皮苷的平均含量為1.35 mg/g，結(jié)果無顯著性差異，證明該工藝穩(wěn)定可行。

表4 側(cè)柏葉生發(fā)酒的提取工藝正交試驗

表5 綜合評分方差分析

3 討論

白發(fā)的病因與發(fā)病機理復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，可能與遺傳、衰老、疾病等導(dǎo)致的黑素干細(xì)胞衰老、黑素細(xì)胞減少等有關(guān)，機制包括bcl-2基因缺失、氧化損傷、氧化應(yīng)激、微量元素缺乏等。其中，酪氨酸酶(tyrosinase)表達(dá)量減少或活性降低是一個重要的因素[14-15]。

側(cè)柏葉中所含化學(xué)成分復(fù)雜，包括黃酮類化合物、鞣質(zhì)和揮發(fā)油等，可應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、化妝品等領(lǐng)域[8]。在諸多古今文獻(xiàn)中記載其主要功能為烏發(fā)和生發(fā)，其中最常用的方法就是將鮮側(cè)柏葉浸泡于高濃度的酒精中，濾取藥液，涂擦毛發(fā)脫落部位。但該提取工藝的參數(shù)尚缺乏實驗依據(jù)，都是根據(jù)前人經(jīng)驗而得，本研究考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提時間對側(cè)柏葉生發(fā)酒提取工藝的影響，優(yōu)化了側(cè)柏葉生發(fā)酒的提取工藝。

側(cè)柏葉主要含槲皮苷、楊梅樹素、扁柏雙黃酮、穗花杉雙黃酮等黃酮成分[16]。這些成分化學(xué)結(jié)構(gòu)中都有可與鋁離子生成具色絡(luò)合物的供電子體。因此，本文用比色法測定側(cè)柏葉中總黃酮成分含量?！吨袊幍洹肥珍泜?cè)柏葉生品中槲皮苷的含量測定方法，本實驗同時測定兩者含量的變化情況，可為側(cè)柏葉生發(fā)酒的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

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