沈燦 胡正軍 汪碧麗 張婷 許斌 許健

胰腺癌是一種常見的惡性消化道腫瘤，其預(yù)后差，病死率高，5年生存率僅5%，平均生存期＜6個月［1］。吉西他濱是胰腺癌化療的一線臨床藥物，但由于毒副作用大，不良反應(yīng)多及腫瘤細胞的耐藥性使其療效并不理想［2］。研究表明冬凌草甲素對白血病、宮頸癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤細胞均有明顯殺傷或抑制作用［3］。另外研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可通過多種信號通路促進腫瘤細胞凋亡蛋白的表達，影響細胞周期及調(diào)控miRNAs的表達等多種途徑抑制腫瘤的生長，最終誘導(dǎo)細胞的凋亡和細胞的自噬［4］。2016年10月至2017年10月作者通過實驗研究，探討冬凌草甲素逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞耐藥性的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1由中國科學(xué)院上海細胞生物研究所提供。耐吉西他濱胰腺癌PANC-1/Gem細胞由本實驗室經(jīng)誘導(dǎo)耐藥建立獲得。鹽酸吉西他濱由江蘇豪森藥廠股份有限公司提供，冬凌草甲素由格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司提供。

1.2 動物 BALB/C（nu/nu）無胸腺裸鼠20只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心采購并提供無特殊病原體（SPF）飼養(yǎng)環(huán)境。

1.3 誘導(dǎo)建立人胰腺癌耐吉西他濱細胞株P(guān)ANC-1/Gem 人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液和37℃、5%CO2的恒定培養(yǎng)箱中，當細胞匯合度達80%的致密單層后，改用含吉西他濱的培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)6個月的藥物不斷誘導(dǎo)建立人胰腺癌耐吉西他濱細胞株P(guān)ANC-1/Gem。

1.4 CCK-8法檢測藥物對增殖活力的影響 PANC-1和PANC-1/Gem細胞傳代培養(yǎng)于96孔板中。每組加入不同濃度的藥物作用細胞，每組5個復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，每孔中加入CCK-8溶液，2h后450nm波長處檢測各孔吸光度值，并計算細胞對藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥倍數(shù)。采用Chou-Talalay法計算藥物相互作用的聯(lián)合指數(shù)（CI）。

1.5 Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達 將PANC-1和PANC-1/Gem細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，不同藥物組培養(yǎng)24h后裂解各組細胞提取蛋白，測定各組蛋白濃度，每孔按30μg的蛋白樣品進行電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。經(jīng)封閉，一抗，二抗孵育后顯色液顯影，曝光。采集與分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白表達量以內(nèi)參β-actin進行標準化，對比分析各實驗組間蛋白表達的差異情況。

1.6 建立皮下異種移植瘤模型 ?。?～3）×106的單細胞懸液接種于裸鼠右肩背部皮下，密切觀察皮下腫瘤生長情況，待肉眼可見腫瘤時，隨機將小鼠分為不同組別。吉西他濱組和聯(lián)合組腹腔注射，1次/周，冬凌草甲素組腹腔注射，1次/d。

1.7 免疫組化法觀察組織中相關(guān)耐藥蛋白表達 剝?nèi)⌒∈竽[瘤組織及正常胰腺組織，經(jīng)10%中性甲醛固定、組織脫水、二甲苯透明、石蠟包埋切片，免疫組織化學(xué)染色，標志物為MRP1，光學(xué)顯微鏡下觀察組織染色情況，拍照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素和吉西他濱對胰腺癌細胞增殖活力的影響 與空白組比較，冬凌草甲素和吉西他濱均能抑制胰腺癌細胞增殖，且呈濃度依賴性。PANC-1/Gem相比PANC-1細胞對吉西他濱的敏感性降低，耐藥倍數(shù)=3.68（P＜0.01）。兩株細胞對冬凌草甲素的半數(shù)抑制率濃度分別為60.23μmol/L，57.42μmol/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1、2。

2.2 冬凌草甲素和吉西他濱聯(lián)合使用對PANC-1/Gem細胞增殖活力的影響 兩藥在不同濃度作用下的聯(lián)合指數(shù)（CI）均為協(xié)同作用（CI＜1）。見表2、3。

表1 不同濃度吉西他濱對PANC-1/Gem和PANC-1細胞增殖的影響（x±s）

表2 不同濃度的吉西他濱對PANC-1/Gem和PANC-1細胞增殖的影響（x±s）

表3 不同濃度冬凌草甲素聯(lián)合吉西他濱對PANC-1/Gem細胞的增殖抑制率（%）

表4 不同濃度冬凌草甲素聯(lián)合吉西他濱對PANC-1/Gem細胞的聯(lián)合指數(shù)

2.3 冬凌草甲素和吉西他濱對胰腺癌細胞耐藥相關(guān)蛋白表達的影響 與PANC-1細胞比較，PANC-1/Gem中MRP1及GST-π蛋白的表達明顯增高。冬凌草甲素和聯(lián)合組作用后細胞中MRP1及GST-π蛋白明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖 1。

圖1 冬凌草甲素和吉西他濱對胰腺癌細胞耐藥相關(guān)蛋白表達的影響

2.4 冬凌草甲素和吉西他濱對PANC-1/Gem細胞體內(nèi)生長的影響 與對照組腫瘤體積比較，吉西他濱組、冬凌草甲素組、聯(lián)合組腫瘤體積均明顯減?。≒＜0.05，P＜0.01）。見圖 2。

圖2 冬凌草甲素和吉西他濱對PANC-1/Gem細胞體內(nèi)生長的影響

2.5 冬凌草甲素和吉西他濱對移植瘤耐藥相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組和吉西他濱腫瘤組織比較，冬凌草甲素組和聯(lián)合組中腫瘤組織中MRP1蛋白明顯下降。見圖3。

圖3 冬凌草甲素和吉西他濱對PANC-1/Gem腫瘤組織中MRP1 蛋白表達的影響

3 討論

近年來，我國胰腺癌發(fā)病率呈快速上升趨勢。由于起病隱匿，缺乏早期診斷指標，80%胰腺癌患者確診時已是晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)指征。以吉西他濱為基礎(chǔ)的化療是目前臨床上治療晚期胰腺癌的主要手段，但中位生存時間及1年生存率方面并無突破［5］，其中腫瘤細胞對吉西他濱的耐藥性增高是化療失敗的主要原因之一。開展新的治療藥物和提高化療藥物的效果，對改善胰腺癌的預(yù)后有著重要意義。

本研究通過體外藥物誘導(dǎo)建立耐吉西他濱胰腺癌細胞PANC-1/Gem。相比親本細胞，PANC-1/Gem對吉西他濱的耐藥性明顯上升。冬凌草甲素作用兩株胰腺癌細胞后能顯著抑制細胞的增殖，結(jié)果與其他研究報道相符［6］。兩株胰腺癌細胞對冬凌草甲素的敏感性無明顯差異，提示冬凌草甲素能夠逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性。在冬凌草甲素聯(lián)合吉西他濱作用耐吉西他濱胰腺癌PANC-1/Gem細胞研究中，聯(lián)合用藥較單藥組比較明顯抑制細胞的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且兩藥合用的聯(lián)合指數(shù)（CI）＜1.0，表明冬凌草甲素和吉西他濱具有協(xié)同抑制胰腺癌細胞增殖的作用，結(jié)果與國內(nèi)學(xué)者的研究相符［7］。

胰腺癌的耐藥機制非常復(fù)雜，其中藥物外排泵及藥物解毒酶系統(tǒng)在胰腺癌耐藥中發(fā)揮重要作用。ATP結(jié)合盒（ABC）是膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族一類ATP驅(qū)動泵，廣泛分布各種生物體中，通過細胞膜或胞漿與細胞核之間藥物攝入和外流改變使細胞內(nèi)藥物濃度，使進入到腫瘤細胞內(nèi)的細胞毒藥物排除到細胞外，從而使細胞內(nèi)的藥物濃度低于能夠?qū)е录毎劳龅拈摑舛?，對細胞起到保護作用［8］。其中P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）、肺耐藥蛋白（LRP）被證明在胰腺癌中呈高表達并在胰腺癌對化療藥物的耐藥起到重要作用［9］。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）是谷胱甘肽參與反應(yīng)的關(guān)鍵酶，可催化GSH與親電子藥物相結(jié)合，形成谷胱甘肽-S-共軛物復(fù)合物，從而增加藥物的水溶性，加速排泄，使藥物在細胞內(nèi)的濃度降低。研究表明胰腺癌中GST表達較正常組織明顯增高，通過抑制GST的表達可恢復(fù)化療藥物對胰腺癌的敏感性［10］。實驗結(jié)果表明耐吉西他濱胰腺癌PANC-1/Gem較親本細胞MRP1以及GST-π蛋白表達明顯上升，吉西他濱作用后MRP1和GST-π蛋白進一步增高，表明MRP1和GST-π蛋白在胰腺癌對吉西他濱的耐藥中起到了關(guān)鍵作用。冬凌草甲素及聯(lián)合用藥均可降低MRP1和GST-π蛋白的表達，證明冬凌草甲素能夠逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性。通過體內(nèi)實驗進一步驗證冬凌草甲素能夠協(xié)同吉西他濱抑制胰腺癌生長，同時降低相關(guān)耐藥蛋白的表達，恢復(fù)胰腺癌對吉西他濱的敏感性。

綜上所述，冬凌草甲素能夠抑制胰腺癌細胞的增殖，通過降低MRP1及GST-π耐藥蛋白的表達逆轉(zhuǎn)PANC-1/Gem對吉西他濱的耐藥性，增強吉西他濱對胰腺癌細胞的殺傷作用。冬凌草甲素逆轉(zhuǎn)胰腺癌細胞耐藥性的機制仍不完善，有待進一步的研究證明。

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