張 磊,許 靜,魏 佳,張 政,吳 斌,3,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,新疆烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實驗室,新疆烏魯木齊 830091)

紅地球葡萄(VitisviniferaL. cv Redglobe)果肉脆硬,耐貯藏,果皮中含有豐富的花色素苷[1]。葡萄果梗、果軸表面分布有大量的皮孔和氣孔,而表皮無氣孔,僅有少量皮孔且多栓化,SO2氣體主要通過果梗進入葡萄果實中[2]。

花色素苷(Anthocyanin)屬于黃酮類化合物,是一種存在于植物細胞液泡中的水溶性色素。主要存在于植物的葉片、果實、根、莖、幼苗中,因為具有吸光性通常呈現(xiàn)出紅色、藍色或紫色等顏色。其含量是影響葡萄果皮顏色的主要因素[3-5]。二氧化硫(SO2)氣體熏蒸已經(jīng)被廣泛應(yīng)用商業(yè)化鮮食葡萄貯運保鮮中,SO2熏蒸能夠延緩葡萄果實衰老,增強貯藏保鮮效果[6]。研究表明SO2處理還能延長無花果[7]、龍眼[8]和荔枝[9]的貯藏期和貨架期壽命。但SO2保鮮劑使用劑量和方式不合適會對葡萄果皮產(chǎn)生漂白作用,造成SO2殘留量超標;還會造成果實衰老、腐敗加速、風味變異等[10]。研究報道適宜濃度的SO2處理可以降低對葡萄果皮花色素苷的褪色作用[11],SO2與葡萄花色素苷的反應(yīng)在葡萄酒行業(yè)中也被廣泛應(yīng)用[12]。目前對SO2處理葡萄的研究主要集中在貯藏品質(zhì),其對鮮食葡萄果皮漂白傷害機理至今還不明確。

本研究以“紅地球”葡萄為試材,分析SO2氣體對葡萄細胞超微結(jié)構(gòu)和果皮褪色的影響,研究花色素苷相關(guān)酶活性和基因表達的差異性,從分子生物學方面探討SO2可能的化學和生理作用,為降低SO2對葡萄果皮花色素苷的影響和SO2在商業(yè)化貯運中的精準應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅地球葡萄 于2016年10月14日采摘,挑選大小均一、無機械損傷、無病蟲害的葡萄果實,采后當日置于(0±1) ℃實驗室冷庫中進行預冷處理,預冷時間24 h,新疆烏魯木齊三坪農(nóng)場葡萄種植園;熒光定量試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、TIANScript試劑盒、6×DNA Loading Buffer、Mark D2000、GoldenView 核酸染料天根生化科技有限公司;丙酮、乙二胺四乙酸、乙酸鈉 天津市福晨化學試劑廠;十六烷基三甲基溴化銨、瓊脂糖、Ttis-Base 北京索萊寶科技有限公司;聚乙二醇6000、氯仿、水飽和酚 天津市致遠化學試劑有限公司;硼酸 天津市光復科技發(fā)展有限公司;氯化鋰、焦碳酸二乙酯 Sigma公司;戊二醛 天津市盛奧化學試劑有限公司;以上試劑均為國產(chǎn)分析純;二氧化硫(SO2)氣體(純度為99.99%) 廣州世源氣體有限公司。

S-570型掃描電子顯微鏡 日本日立公司;SK7200H超聲波清潔器 上?？茖С晝x器有限公司;LGJ-10真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;Firereadear-100凝膠成像系統(tǒng) 英國Firereadear公司;DYY-6D核酸電泳儀 北京市六一儀器廠;Biometra 070-851PCR儀 德國耶拿分析儀器公司;LightcyCler ? 96熒光定量儀 羅氏公司;LDZX-50KBS壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理方法 將整筐葡萄以品字型碼垛,置于1 m3的熏蒸室內(nèi)。在前期課題組的研究基礎(chǔ)上,通過濃度篩選,確定了100和500 μL/L SO2濃度最適,故此實驗分別用100和500 μL/L標準SO2氣體熏蒸葡萄2 h(每隔10 d熏蒸一次,共熏蒸11次),以不使用SO2間歇熏蒸處理為對照。熏蒸結(jié)束后內(nèi)襯吸水紙,外套PVC保鮮袋并扎口,在(0±1) ℃和濕度(RH)=95%條件下貯藏100 d。至貯藏結(jié)束,每20 d取樣一次(共6次),每次取樣2 kg,每個處理重復3次。由于對照果貯藏至100 d時,果實腐爛現(xiàn)象極為嚴重,無法取樣,故對照果只取樣至80 d。

1.2.2 果梗超微結(jié)構(gòu)的觀察 電鏡樣品的制備參考趙曉敏等[13]的方法,稍有改動。隨機抽取紅地球葡萄,用刀片切5 mm×2 mm稍果皮小塊和5 mm的果梗小段,置于樣品臺上,噴金后在1300倍下觀察果梗氣孔的形態(tài)。

1.2.3 果梗氣孔導度的測定 當掃描電鏡拍攝完畢以后,選擇氣孔結(jié)構(gòu)完整清晰電鏡圖,進行果梗導度測定。參考劉龍博等[14]的方法,利用圖像采集系統(tǒng)(MShot Digital Imaging System)拍攝氣孔圖片,并用測微尺和Adobe Photoshop 6.0軟件測出尺寸,再根據(jù)比例尺計算實際大小。

1.2.4 果皮花色素苷及其相關(guān)酶活性總花色素苷含量的測定 取果肉組織混勻,用液氮研磨儀研成粉末后錫箔紙包裹,于-80 ℃保存進行各項活性指標的測定?；ㄉ剀盏臏y定參照張家榮等[15]的方法;花色素苷酶的測定參照Martino等[16]的方法;苯丙氨解氨酶(PAL)的測定參照曹建康等[17]的方法;4-香豆酸CoA連接酶(4CL)的測定參照杜紅豆[18]的方法。

1.2.5 果皮花色素苷相關(guān)基因表達 參照改良的CTAB法[17]進行葡萄果皮RNA的提取,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。采用實時熒光定量PCR方法測定PAL、4CL、DFR和LDOX的表達量。引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計,序列見表1。以KyActin1為內(nèi)參,進行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為50 μL,其中包括:8 μL 10×Tap buffer II(Mg2+plus),4 μL dNTP,1.5 μL上游引物,1.5 μL下游引物,4 μL模板cDNA,0.5 μL Taq DNA Polymerase,28.5 μL滅菌超純水。反應(yīng)采用兩步法,其條件為:94 ℃預變性3 min,94 ℃變性1 min,65 ℃退火30～45 s,共32～35個循環(huán)。根據(jù)目的基因和KyActin1的閾值循環(huán)(Ct),采用2-ΔΔCt法,計算樣品中基因相對表達量。

表1 用于Real-Time PCR 的特異引物設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Sigma Plot 12.0軟件作圖,SPSS 19.5進行數(shù)據(jù)方差分析并利用Duncan法進行均值比較。p<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SO2熏蒸對紅地球葡萄果梗氣孔導度的影響及其掃描電鏡觀察

氣孔是外界與植物體內(nèi)氣體進行交換的通道,SO2濃度過高時就會影響氣孔的正常開啟與關(guān)閉[20]。由圖1可知,在整個貯藏期間,對照果的氣孔導度呈先下降后上升的變化趨勢。而SO2處理果梗氣孔導度基本呈下降的趨勢。貯藏前期(0～60 d)對照果氣孔導度下降幅度反而大于SO2處理果,但在貯藏第60 d后,對照果氣孔導度開始大幅增加,而SO2處理果氣孔導度開始減小,尤其貯藏至100 d時,對照果氣孔導度分別比100和500 μL/L SO2處理果高了25.53%和30.85%(p<0.05)。這表明,一定濃度SO2處理能夠誘導葡萄貯藏后期果梗氣孔導度的減小。

圖1 不同處理對紅地球葡萄果梗氣孔導度影響

圖2電鏡掃描觀察結(jié)果表明,第20 d,果梗氣孔結(jié)構(gòu)和表面均正常(圖A～圖C);第60 d,對照果果梗氣孔導度較大,果梗周圍表面出現(xiàn)小的顆粒狀突起,而SO2處理果果梗氣孔導度減小,保衛(wèi)細胞突起明顯,形成明顯的環(huán)狀的凸起(圖D～圖F)。第100 d,對照果果梗周圍表面破損加重、裂縫增大、失水加速,氣孔結(jié)構(gòu)嚴重受損。而SO2處理果氣孔保衛(wèi)細胞下陷明顯,100、500 μL/L SO2處理果梗氣孔導度為貯藏期內(nèi)的最小值(圖G～圖I)。

圖2 不同處理對葡萄果梗氣孔結(jié)構(gòu)的影響(1300×)

2.2 SO2熏蒸對紅地球葡萄花色素苷含量和花色素苷酶的影響

花色素苷(anthocyanin)屬于類黃酮類色素,參與了紅葡萄顏色的形成[21]?；ㄉ剀彰?anthocyanase)能催化花色苷β-糖苷鍵斷裂,使花色苷水解使其褪色[22]。由圖3A可知,貯藏前期(0～80 d)對照果和100 μL/L SO2處理果中花色素苷的含量無顯著差異(p>0.05),但是貯藏至100 d時,對照果已經(jīng)腐爛,而100和500 μL/L SO2處理果仍能維持花色素苷含量,并且保證葡萄的品質(zhì)(圖3B)。結(jié)果表明,一定濃度SO2處理能夠維持葡萄貯藏后期花色素苷的含量。

圖3 不同處理對紅地球葡萄果皮花色素苷含量(A)以及花色素苷酶活性(B)的影響

2.3 SO2熏蒸對紅地球葡萄PAL和4CL活性的影響

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是花色素苷及其他類黃酮生物合成的直接前體[23]。從圖4A可知,對照果和SO2處理果中PAL活性均呈先上升后下降的趨勢。對照果和500 μL/L SO2處理果PAL活性均顯著低于100μL/L SO2處理果(p<0.05)。這表明100μL/L SO2對PAL活性具有明顯的誘導作用。4-香豆酸CoA連接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)能夠為花色素苷提供豐富的前提物質(zhì)[24]。由圖4B可知,對照果和100 μL/L SO2處理果4CL活性均呈先上升的趨勢,而500 μL/L SO2處理果呈先上升后下降的趨勢。表明,100 μL/L SO2處理可以促進4CL的活性的增長(p<0.05),500 μL/L SO2處理則會在后期(60～100 d)抑制4CL的活性。

圖4 不同處理對紅地球葡萄果皮PAL(A)和4CL酶(B)活性的影響

2.4 SO2熏蒸對紅地球葡萄PAL、4CL、DFR和LDOX基因相對表達量的影響

PAL基因表達量增加,能為后期花色苷合成提供充足的前體物質(zhì)[25]。由圖5A可知,第20、40 d,SO2處理果PAL基因相對表達量顯著高于對照果(p<0.05),100 μL/L SO2處理果PAL基因整體轉(zhuǎn)錄水平高于500 μL/L SO2處理果。由圖5B可知,500 μL/L SO2處理果4CL基因相對表達量在貯藏期間呈先上升后下降的趨勢,在貯藏第40 d時,4CL基因相對表達量達到峰值,而100 μL/L SO2處理果4CL基因相對表達量始終呈現(xiàn)上升的趨勢。第100 d,4CL基因轉(zhuǎn)錄表達量是貯藏初期的2.75倍(p<0.05)。結(jié)果表明,100 μL/L SO2處理促進葡萄PAL和4CL基因表達。

圖5 不同處理對紅地球葡萄果皮PAL(A)、4CL(B)、DFR(C)、LDOX(D)基因相對表達量的影響

二氫黃酮醇4-還原酶(Dihydronavonul 4-reductase,DFR)對花色素苷的最終形成起決定性作用,是一個重要的調(diào)控點[26]。由圖5C可知,對照果和SO2處理果DFR基因表達均呈下降的趨勢。除了第20 d外,100 μL/L SO2處理果DFR基因下調(diào)趨勢均高于500 μL/L SO2處理果。貯藏至第100 d時,100 μL/L SO2處理果DFR基因表達量僅為500 μL/L SO2處理果的60.6%(p<0.05)。無色花色素雙加氧酶(Leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX)可將無色原花色素催化生成有色花色素,對花青素的合成也至關(guān)重要[27]。由圖5D可知,對照果和SO2處理果LDOX基因的表達均經(jīng)歷逐漸升高后下降的趨勢。第60 d,100 μL/L SO2處理LDOX基因轉(zhuǎn)錄水平最高(p<0.05)。結(jié)果表明,100 μL/L SO2處理可促進葡萄果皮LDOX基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào),但抑制了DFR基因的表達。

2.5 葡萄果皮中花色素苷合成相關(guān)酶及其基因的相關(guān)分析

由表2可知,在貯藏期間,葡萄的果皮中花色素苷的含量與花色素苷合成相關(guān)酶的活性和基因表達是相互關(guān)聯(lián)的,可能與4CL酶的活性與DFR基因的轉(zhuǎn)錄表達有關(guān)系。而果皮花色素苷的含量與果皮的色澤又有一定的關(guān)系。

表2 果皮花色素苷含量、花色素苷酶活性及花色素苷合成酶及其基因的相關(guān)分析

3 討論與結(jié)論

本研究通過超微結(jié)構(gòu)分析表明,較低濃度SO2處理紅地球葡萄,通過刺激保衛(wèi)細胞,減少了氣孔導度,阻礙部分SO2進入植物,降低SO2對植物的傷害,從而延緩了花色素苷含量的下降。而高濃度SO2可能導致氣孔開閉調(diào)節(jié)失調(diào),促進SO2氣體進入葡萄果皮,使果皮pH偏酸性,在有機酸的作用下形成亞硫酸氫根,其對花色苷C4親核攻擊生成無色的花色苷亞硫酸鹽復合物[28]。從而促進花色苷降解,導致果皮漂白。

在本研究中100 μL/L SO2可以抑制DFR基因表達,但上調(diào)PAL、4CL、LDOX基因的轉(zhuǎn)錄表達?；ㄉ盏纳锖铣陕窂娇梢苑譃閮蓚€階段:第一階段由苯丙氨酸到4-香豆酰CoA,這是許多次生代謝共有的;第二階段由4-香豆酰CoA轉(zhuǎn)化為各種黃酮類化合物,其生物合成過程受結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因控制[29-31]。100 μL/L SO2處理上調(diào)了PAL、4CL基因的表達,這與100 μL/L SO2處理果PAL和4CL活性變化情況一致。該階段PAL、4CL基因的上調(diào)表達促進了苯丙烷類的代謝,為后一階段中類黃酮的代謝提供必需的化合物。葡萄中PAL活性與花色素苷的含量呈顯著正相關(guān)[32],4CL基因很可能在植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)中通過影響類黃酮代謝路徑碳流的方向和流速,進而達到調(diào)控葡萄果實顏色的變化[33]。可見PAL、4CL基因的上調(diào)表達對花色苷的合成有一定的促進作用。DFR是紅蘋果果皮著色所必須的結(jié)構(gòu)基因[34]。文習成[35]發(fā)現(xiàn)紅葉桃葉片在秋季時DFR基因的表達水平隨著花色素苷的積累而升高。而本實驗結(jié)果表明DFR的轉(zhuǎn)錄水平與花色苷相關(guān)性比較低,推測其原因可能是由于實驗品種、處理方式、溫度差異不同而導致的。LDOX是葡萄花色苷合成中的關(guān)鍵酶,能夠催化無色的原花色素氧化生成有色的花翠素[36-37]。隨著貯藏時間的延長,100 μL/L SO2處理果中LDOX的表達水平高于500 μL/L SO2處理果。Kobayashi等[38]研究發(fā)現(xiàn)LDOX在紅色葡萄品種成熟的果皮中表達強,而在白色品種上表達弱或不表達。這與100 μL/L SO2處理紅地球葡萄,果皮顏色更深結(jié)果相一致?？赡苁怯捎贚DOX基因的上調(diào)表達,促進了果皮花色素苷的合成。PAL、4CL、DFR、LDOX表達的結(jié)果共同說明了葡萄果皮花色素苷的合成可能受到了多個基因的協(xié)同調(diào)控。

綜上所述,100 μL/L SO2熏蒸處理調(diào)節(jié)了紅地球葡萄果梗氣孔導度,誘導葡萄果皮中花色素苷酶、PAL、4CL活性增強,上調(diào)了PAL、4CL、LDOX基因的表達,下調(diào)了DFR基因表達,從而減緩葡萄果皮中花色素苷含量的下降,維持色澤。

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