呂春暉,劉 皓,方國臻,王 碩

(1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院,天津 300350;2.天津科技大學(xué),天津 300222)

恩諾沙星(ENRO)是氟喹諾酮類藥物中第一個畜禽專用獸藥,具有廣譜抗菌性,體內(nèi)分布廣、消除速率慢、組織滲透力強(qiáng)、高效價廉,被廣泛應(yīng)用于畜禽產(chǎn)品,各國均對動物性食品中恩諾沙星的最大殘留限量有嚴(yán)格規(guī)定[1-2]。目前用于食品中恩諾沙星殘留檢測的方法有微生物法[3-4]、高效液相色譜法[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-8]、毛細(xì)管電泳法[9]、免疫分析法[10-12]等。與其它方法相比,免疫分析法不需要復(fù)雜的樣品前處理,不需昂貴儀器設(shè)備、操作簡便省時,易于推廣,適用于現(xiàn)場進(jìn)行獸藥殘留的快速篩選檢測。但是由于抗體本身存在缺點(diǎn),如制備繁瑣、需要犧牲動物、對溫度、濕度等環(huán)境敏感、不可重復(fù)利用等,影響免疫分析的廣泛應(yīng)用。針對這種現(xiàn)實(shí)情況,開發(fā)建立一種準(zhǔn)確、靈敏、快速、經(jīng)濟(jì)的仿生免疫分析方法檢測恩諾沙星對于我國食品安全管理與指導(dǎo)畜牧業(yè)生產(chǎn)養(yǎng)殖合理用藥具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。將分子印跡聚合物(MIP)作為人工抗體取代生物抗體已有研究[13-16],其與生物抗體相比制備簡單、不需犧牲動物、有更好的穩(wěn)定性和耐用性等優(yōu)點(diǎn)。

本文采用表面印跡法,在96孔酶標(biāo)板表面直接合成恩諾沙星分子印跡聚合物膜,并將其用于恩諾沙星的檢測,旨在建立一種準(zhǔn)確、靈敏、快速、經(jīng)濟(jì)的仿生酶聯(lián)免疫分析法檢測恩諾沙星,進(jìn)一步開拓分子印跡免疫分析技術(shù)在獸藥殘留檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

恩諾沙星 純度≥99.9%,中國食品藥品檢定研究院;雞胸肉 市購；甲基丙烯酸(MAA) 分析純,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA) 分析純,美國Sigma公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 分析純,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;辣根過氧化氫酶(HRP) 酶活≥250 U/mg色譜純,美國Roche公司;N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),純度≥99%、偶氮二異丁腈(AIBN) 化學(xué)純,Sigma-Aldrich公司;N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 純度≥98%,Sigma-Aldrich公司。

Thermo Labsystems,Multiskan Specbium酶標(biāo)儀 美國Thermo公司;1575型微孔板清洗器 美國BIO-RAD公司;單道微量可調(diào)移液器和8道微量可調(diào)移液器 法國Gilson公司;QL-901型振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;LC-20A高效液相色譜儀 RF-10AXL熒光檢測器 日本島津公司;C18色譜柱(4.6 mm×150 mm) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 恩諾沙星分子印跡聚合物膜的制備 準(zhǔn)確稱取0.36 g(1 mmol)恩諾沙星,均勻溶解于溶劑(甲醇/甲苯,3∶1,V/V)中,緩慢滴加340 μL(4 mmol)功能單體 MAA,室溫下磁力攪拌2 h以使模板分子與功能單體充分自組裝形成模板分子-功能單體復(fù)合物,隨后緩慢滴加3 mmol交聯(lián)劑EDMA,磁力攪拌30 min后,加入50 mg引發(fā)劑AIBN,待其完全溶解,將圓底燒瓶放入超聲清洗器中脫氣5 min。用微量移液器將預(yù)聚合溶液加入到96孔酶標(biāo)板表面,每孔50 μL,置于真空干燥箱中45 ℃熱引發(fā)聚合12 h,連續(xù)超聲振蕩洗脫12 h(換三次洗脫液)至洗脫液中檢測無恩諾沙星即為洗脫干凈,經(jīng)37 ℃干燥,即得到恩諾沙星分子印跡聚合物(MIP)膜[17]。見圖1所示合成路線。

圖1 恩諾沙星分子印記聚合物膜的合成路線

作為對照,非印跡聚合物(NIP)膜在與1.2.1同樣的制備條件與步驟下合成,不添加模板分子恩諾沙星。

1.2.2 恩諾沙星分子印跡聚合物膜的表征及結(jié)合性能實(shí)驗(yàn) 參見呂春暉等[18]方法進(jìn)行紅外光譜分析及電鏡掃描結(jié)構(gòu)分析，確定印跡聚合物膜的合成,進(jìn)行吸附平衡結(jié)合實(shí)驗(yàn)與吸附動力學(xué)實(shí)驗(yàn),并采用Scatchard分析來評價分子印跡聚合物對模板分子的結(jié)合特性,并確定平衡鍵合常數(shù)以及鍵合位點(diǎn)數(shù)目。結(jié)果表明,合成的聚合物膜可以應(yīng)用于競爭性免疫吸附分析。

1.2.3 酶標(biāo)記半抗原的合成 采用傳統(tǒng)活化酯法。根據(jù)王忠斌[19]的方法進(jìn)行酶標(biāo)抗原的合成:精確稱取恩諾沙星8.9 mg溶于150 μL DMF,加入3.5 mg NHS和12.4 mg DCC,混合溶液室溫下緩慢輕攪8 h,離心除去沉淀。冰浴條件下,將上層清液(活化酯溶液)緩慢滴加到溶有10 mg HRP的碳酸氫鈉(3 mL,130 mmol/L,pH=8.1)溶液中,4 ℃下攪拌反應(yīng)過夜,之后將反應(yīng)液于4 ℃在磷酸緩沖鹽溶液(pH=9.3,PBS)中透析(截留分子量14000 Da)3 d。收集透析后的酶標(biāo)溶液,加入等體積的甘油,置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酶標(biāo)抗原稀釋度的選擇 將連接好的酶標(biāo)抗原原液從1∶500開始進(jìn)行3 倍梯度稀釋,每孔加入100 μL 酶標(biāo)稀釋液,室溫孵育1 h。1 h 后棄去酶標(biāo)稀釋液,用磷酸鹽緩沖溶液(PBST：由pH=7.5的PBS配制)洗板5 次。每孔再加入150 μL 底物顯色液,顯色30 min。30 min 后每孔加入50 μL 終止液。每孔吸出150 μL 顯色后的溶液立即在雙波長方式(450～650 nm)下用酶標(biāo)儀讀取吸光度值讀數(shù)。選擇對應(yīng)的吸光度值在0.8～1.2 之間的酶標(biāo)稀釋度就是后續(xù)直接競爭反應(yīng)所用的酶標(biāo)溶液稀釋倍數(shù)。

1.2.5 標(biāo)樣稀釋度pH的確定 分別在pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5的PBS中進(jìn)行競爭免疫反應(yīng)，計(jì)算IC50以評價靈敏度，以適應(yīng)辣根過氧化物酶的最適pH。

1.2.6 直接競爭仿生ELISA方法步驟 直接將恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品提取液添加到各孔中,每孔添加100 μL,再加入100 μL稀釋后的酶標(biāo)抗原溶液,以不含恩諾沙星的PBS溶液或樣品提取液的孔作為空白,室溫下置于水平振蕩器上振搖1 h,進(jìn)行競爭反應(yīng),用洗滌液洗板5次,每孔分別加入150 μL配制好的底物溶液,顯色30 min后,加入50 μL終止液終止反應(yīng),立即將樣液在雙波長(450～650 nm)方式下用酶標(biāo)儀測定吸光度值。

1.2.7 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用PBS(pH=7.5)溶液將恩諾沙星儲備液稀釋為10000、1000、100、10、1、0.1 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.4步驟進(jìn)行直接競爭反應(yīng)得到一系列吸光度值。

按照公式(1)計(jì)算出不同濃度的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液在競爭反應(yīng)中的抑制率值:

式(1)

式中：IC(%)-恩諾沙星對抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的抑制率;A對照-僅加酶標(biāo)溶液的平均吸光度值;A樣品-恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品提取液的平均吸光度值;A空白-不加酶標(biāo)及恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

以抑制率為縱坐標(biāo),恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,每次實(shí)驗(yàn)前均需重新繪制。

1.2.8 樣品添加回收實(shí)驗(yàn)及液相驗(yàn)證 準(zhǔn)確稱取三份各2.0 g雞胸肉組織樣品,分別加入0.5 mg/L恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液300、60、10 μL,渦旋振蕩5 min,充分混勻后靜置10 min。加入提取液10 mL,渦旋振蕩5 min,于4 ℃條件下4000 r/min離心15 min,將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,重復(fù)上述提取步驟,合并兩次上清液進(jìn)行液液萃取,加入10 mL正己烷萃取3 min,靜置分層取下層清液,重復(fù)萃取兩次,50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸干,用1 mL PBS(pH=7.5)復(fù)溶,過0.45 μm濾膜過濾,4 ℃下保存待測。

三份豬尿樣也分別加入0.5 mg/L恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液300、60、10 μL,渦旋混勻后,直接經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,4 ℃下保存待測。

色譜條件為:色譜柱:C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫箱溫度:30 ℃;檢測器:熒光檢測器;激發(fā)波長:280 nm;檢測波長:450 nm;流動相:0.05 mol/L磷酸溶液∶乙腈(80∶20,V/V);流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

選擇8種恩諾沙星的結(jié)構(gòu)類似物分別進(jìn)行仿生ELISA分析,通過計(jì)算出的交叉反應(yīng)率(CR%)(見公式2)來評價方法的選擇性,交叉率越小說明方法選擇性越好、特異性越強(qiáng)。

CR(%)=[IC50(恩諾沙星)/IC50(恩諾沙星結(jié)構(gòu)類似物)]×100

式(2)

所有的測量數(shù)據(jù)都重復(fù)測量三次,結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。制作ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,以抑制率為15%時對應(yīng)的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度評價方法檢出限,抑制率為50%時對應(yīng)的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度評價方法靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶標(biāo)濃度的選擇

將合成好的酶標(biāo)探針從1∶500的比例開始進(jìn)行梯度稀釋,其中以不加酶標(biāo)探針溶液為空白,其余各行分別加入不同稀釋度的酶標(biāo)探針溶液,以PBS代替恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行免疫反應(yīng)。為了使檢測結(jié)果準(zhǔn)確靈敏,選擇吸光度值在0.8～1.2之間的酶標(biāo)稀釋度作為直接競爭仿生ELISA方法的酶標(biāo)溶液稀釋度數(shù),即以1∶4000的比例作為酶標(biāo)溶液稀釋度數(shù)。

2.2 標(biāo)樣稀釋液pH的確定

不同pH下的IC50結(jié)果如圖2,在pH為7.5時,IC50最小,即方法靈敏度最高。在此pH溶液中,恩諾沙星(pKa1=5.94±0.09,pKa2=8.70±0.44)[20]能夠保持兩性離子狀態(tài),既有利于恩諾沙星的羧基與MAA形成氫鍵,也有利于喹啉環(huán)上的胺基與MAA進(jìn)行離子交換。

圖2 不同標(biāo)樣稀釋液pH與ELISA方法IC50值對應(yīng)曲線

2.3 直接競爭仿生ELISA方法的特征量分析

2.3.1 直接競爭仿生ELISA方法的靈敏度與檢出限 以制備的恩諾沙星印跡聚合物膜作為仿生抗體,按照上述優(yōu)化條件建立直接競爭仿生ELISA,在0.1～10000 μg/L的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖3,印跡聚合物(MIP)的最高抑制率達(dá)到76%,而非印跡聚合物(NIP)的最高抑制率只有45%。方法檢出限以MIP的IC15表示為0.80 μg/L,靈敏度以MIP的IC50表示為65.93 μg/L,與王忠斌[19]合成的恩諾沙星多克隆抗體建立的直接競爭ELISA方法(IC15=0.02 μg/L;IC50=0.35 μg/L)相比,檢出限與IC50較高,但是與分子印跡聚合物應(yīng)用于固相萃取進(jìn)行的HPLC檢測恩諾沙星分析方法相比,有更好的檢出限與靈敏度,而且檢出限已滿足中國、歐盟、日本等國家規(guī)定的檢測標(biāo)準(zhǔn)。方法線性分析范圍為1～1000 μg/L,與多克隆抗體相比有很大提高,這是由吸附位點(diǎn)的異質(zhì)性所決定的[21]。

圖3 恩諾沙星印跡聚合物膜與非印跡聚合物膜作為仿生抗體建立的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

這種直接競爭仿生ELISA分析方法,由于其不需要抗體包被和牛血清白蛋白的封閉過程,而節(jié)約了分析時間。綜上所述,合成MIP膜比在動物體內(nèi)生成抗體更加省時經(jīng)濟(jì)。因此,非常適合于大量樣品中恩諾沙星殘留的快速篩選。

2.3.2 直接競爭仿生ELISA方法的精密度 方法精密度結(jié)果分析見表1,板間變異均大于板內(nèi)變異,且變異系數(shù)隨著恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的減小而呈遞增趨勢,但是變異系數(shù)均小于20%,說明所建立的方法具有較高的精密度。

表1 直接競爭仿生ELISA 板內(nèi)變異與板間變異(%)

2.3.3 直接競爭仿生ELISA方法的選擇性 由表2可知,聚合物對環(huán)丙沙星等6種氟喹諾酮類藥物幾乎均有交叉反應(yīng),而對氟甲喹、西諾沙星沒有交叉反應(yīng),由此可見,哌嗪環(huán)作為藥物結(jié)構(gòu)之間的主要差別,在聚合物膜識別過程中起了較大作用。環(huán)丙沙星作為恩諾沙星在動物體內(nèi)的代謝物,與恩諾沙星有十分相似的結(jié)構(gòu),更容易被特異性吸附位點(diǎn)識別并進(jìn)入孔穴,因此交叉反應(yīng)率最大。此外,由于各種喹諾酮類物質(zhì)的解離常數(shù)有所不同,在溶劑中的狀態(tài)有所偏差,也會影響它們對印跡位點(diǎn)的吸附結(jié)合。

表2 恩諾沙星及其結(jié)構(gòu)類似物的IC50值和交叉反應(yīng)率(CR%)

總體來講,所建立的直接競爭仿生ELISA方法有較高的選擇性,這種選擇性源于分子印跡聚合物膜的印跡效果,識別位點(diǎn)的特異性取決于孔穴結(jié)構(gòu)的形狀、大小,官能基團(tuán)的空間排列,以及吸附溶液的種類性質(zhì),在實(shí)際應(yīng)用中本方法可以進(jìn)行同時檢測恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星。

2.4 樣品添加回收實(shí)驗(yàn)及液相驗(yàn)證

由表3可知,所建立的仿生ELISA法有較好的添加回收率,兩種樣品不同濃度的添加回收率均在90%～105%之間,其中雞肉組織樣品的添加回收率為97.30%～103.56%,豬尿樣品的添加回收率為94.48%～96.53%。所建立的仿生ELISA方法與HPLC方法對于不同ENRO添加濃度的雞肉組織樣品和豬尿樣品的回收率均值無顯著性差異(p>0.05),說明兩種方法有較好的一致性。

表3 仿生ELISA法在雞肉、豬尿樣品中恩諾沙星的添加回收率(n=3)

3 結(jié)論

本文以聚苯乙烯酶標(biāo)板為載體,利用表面分子印跡技術(shù)合成恩諾沙星印跡聚合物膜,得益于表面印跡的優(yōu)勢,吸附位點(diǎn)位于或靠近聚合物膜表面,大分子酶標(biāo)探針更易于識別結(jié)合吸附位點(diǎn),有利于印跡聚合物膜應(yīng)用于仿生ELISA檢測方法。另外,通過對直接競爭仿生ELISA方法條件的優(yōu)化,成功的建立了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)的方法檢測恩諾沙星。在聚苯乙烯酶標(biāo)板表面直接合成的對恩諾沙星具有吸附特異性的印跡聚合物膜能夠作為仿生抗體應(yīng)用于ELISA檢測實(shí)際樣品中的恩諾沙星。

[1]Withdrawal of approval of the new animal drug application for enrofloxacin in poultry(Docket No. 2000N-1571)[S]. Department of Health and Human Services,U.S. Food and Drug Administration,USA,28 July 2005,p. 22.

[2]EU Commission Regulation No. 37/2010,off. J. Eur. Communities[S]. European Communities,2010.

[3]胡鯤,李怡,朱澤聞,等.微生物顯色法快速檢測水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報,2009,18(4):472-47.

[4]Dang P K,Degand G,Danyi S,et al.Validation of a two-plate microbiological method for screening antibiotic residues in shrimp tissue[J].Analytical Chimica Acta,2010,672:30-39.

[5]徐剛,王周芹,宋禾,等. 豬排泄物中恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量的HPLC檢測方法[J].中國畜牧獸醫(yī),2016(4):1058-1065.

[6]Evaggelopoulou E N,Samanidou V F.HPLC confirmatory method development for the determination of seven quinolones in salmon tissue(SalmosalarL.)validated according to the European Union Decision 2002/657/EC[J].Food Chemistry,2013,136(2):479-484.

[7]趙建,呂燕,許秀琴,等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中6大類50種藥物[J]. 分析實(shí)驗(yàn)室,2014,33(6):713-718.

[8]李洪波,許小友,黃志偉,等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中的恩諾沙星和喹乙醇藥物的含量[J].飼料工業(yè),2016,37(22):53-37.

[9]Xu X Y,Liu L H,Jia Z M,et al. Determination of enrofloxacin and ciprofloxacin in foods of animal origin by capillary electrophoresis with field amplified sample stacking-sweeping technique[J].Food Chemistry,2015,176:219-225.

[10]Wang Z H,Zhang H Y,Ni H J,et al. Development of a highly sensitive and specific immunoassay for enrofloxacin based on heterologous coating aptens[J]. Analytica Chimica Acta,2014,820:152-158.

[11]Yu F,Yu S C,Yu L L,et al. Determination of residual enrofloxacin in food samples by a sensitive method of chemiluminescence enzyme immunoassay[J]. Food Chemistry,2014,149:71-75.

[12]徐逍,楊彩根,付監(jiān)貴,等. ELISA 法檢測不同條件下中華絨螯蟹中恩諾沙星的殘留量[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(11):399-403.

[13]文永佳,張峰,杜幸潔,等. 呋喃唑酮代謝物分子印跡聚合物的合成及其酶聯(lián)免疫吸附檢測方法的建立[J]. 應(yīng)用化工,2013,42(7):1347-1350.

[14]彭麗芳,李樺. 縮膽囊素神經(jīng)肽分子印跡膜的制備及熒光免疫分析應(yīng)用[J]. 分析科學(xué)學(xué)報,2017,33(1):1-5.

[15]Ge C,Mao J J,Peng F D,et al. A sensitive chemiluminescence enzyme immunoassay based on molecularly imprinted polymers solid-phase extraction of parathion[J]. Analytical Biochemistry,2017,530:87-93.

[16]Jie L,Ju X L,Xu G Q,et al. A study on biomimetic immunoassay-capillary electrophoresis method based on molecularly imprinted polymer for determination of trace trichlorfon residue in vegetables[J]. Food Chemistry,2017,221:1285-1290.

[17]Fang G Z,Lu J P,Pan M F,et al. Substitution of antibody with molecularly imprinted film in enzyme-linked immunosorbent assay for determination of trace ractopamine in urine and pork samples[J]. Food Analytical Methods,2011,4(4):590-597.

[18]呂春暉,方國臻,王碩,等. 恩諾沙星分子印跡聚合物膜的制備及吸附性能研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2017,33(11):1-6.

[19]王忠斌. 食品中恩諾沙星殘留免疫學(xué)檢測方法的研究[D]. 天津:天津科技大學(xué),2007

[20]Liondo M,Pons M,Gallardo M,et al. Physicochemical properties of enrofloxcin[J]Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,1997,15:1845-1849.

[21]Mosbach K,Ramstrom O. The emerging technique of molecular imprinting and its future impact on biotechnology[J]. Biotechnology,1996,14:163-170.