孫永才,孫京新,*,王寶維,黃 明,徐幸蓮,于 冰

(1.青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,山東青島 266109;2.南京農(nóng)業(yè)大學國家肉品質量安全控制工程技術研究中心,江蘇南京 210095)

鴨血具有高蛋白、低脂肪、低糖、微量元素豐富等特點,且鴨血蛋白中富含八種人體必需氨基酸,特別是賴氨酸[1]，但是也存在血腥味大,血紅蛋白等大分子不易被人體消化吸收等弊端。目前,畜禽血液的加工程度低,大多數(shù)被加工為血豆腐[2-3]、血粉[4]等初級加工產(chǎn)物,產(chǎn)品附加值很低[5]。已經(jīng)有學者研究了提取鴨血中的血紅素[6]、營養(yǎng)肽[7-8]、抗氧化肽[9]等來提高鴨血的附加值。利用霉菌發(fā)酵血液,提高血液水解度,應用到飼料中已有較多研究,馬小元[10]、Zheng等[11]研究了黑曲霉發(fā)酵豬血的工藝參數(shù)優(yōu)化,為水解血粉飼料的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎。范遠景等[12]優(yōu)化了枯草芽孢桿菌發(fā)酵豬血粉懸液制備豬血多肽的最佳工藝參數(shù),為微生物發(fā)酵豬血粉制備高營養(yǎng)的動物蛋白飼料和提取功能性多肽提供了實驗依據(jù)。

霉菌在傳統(tǒng)的發(fā)酵食品中起著舉足輕重的作用,已經(jīng)有7個青霉屬(包括納地青霉)被認為是對發(fā)酵產(chǎn)品品質有益的[13]。霉菌酶系發(fā)達、代謝能力強,通過對發(fā)酵產(chǎn)品中脂肪和蛋白的分解產(chǎn)生特有的外觀和特異的“霉菌香味”[14],一些青霉還具有抑抑細菌、抗氧化的作用而被用于干腌肉制品的發(fā)酵[15]。在法國、意大利等歐洲國家,干腌香腸中有60%以上是霉菌發(fā)酵香腸,納地青霉是主要的霉菌發(fā)酵劑之一,對促進產(chǎn)品后熟過程中風味的形成具有重要的作用[16-18]。Castro等[19]利用納地青霉發(fā)酵意大利香腸,并對香腸的風味物質、脂肪酸等指標進行了測定,結果表明納地青霉能顯著提高意大利香腸的品質。Jacobsen等[20]研究了納地青霉在葡萄糖、蛋白胨、脂肪酸和豬肉提取物培養(yǎng)基上的生長情況,分離出醇類、酮類、酯類、醛類多種風味物質,認為納地青霉產(chǎn)生的特殊風味主要來自對脂肪酸的分解,與培養(yǎng)基成分無關。Nal?ovy干酪在發(fā)酵過程中納地青霉附著在干酪表面生長,顏色從潔白逐漸變?yōu)榉奂t色甚至紅色,干酪胚也成熟為典型的橙黃色[21]。Mrázek等[22]研究了8株納地青霉對干酪的影響并與卡門伯特青霉作對比,發(fā)現(xiàn)納地青霉均能促進干酪蛋白的成熟,增加蛋白水解度,并有納地青霉成熟后特有的外觀顏色,感官評分也顯著提高。

目前,對于血液發(fā)酵制品的研究多應用于動物飼料的生產(chǎn),在深加工食品領域的應用相對較少,而納地青霉目前多用于發(fā)酵干腌香腸、干酪等,關于采用納地青霉發(fā)酵鴨血的研究還未見報道。本文以高溫滅菌的熟制鴨血為原料、納地青霉為發(fā)酵劑,進行純菌種發(fā)酵,為獲得具有特定質地、風味、營養(yǎng)成分的發(fā)酵鴨血制品提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鴨血 青島市大潤發(fā)流通事業(yè)股份有限公司;納地青霉(AS3.4357) 中國科學院微生物研究所;察氏瓊脂培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術有限公司;牛血清蛋白(純度97%)、考馬斯亮藍G-250 北京索萊寶科技有限公司;三氟乙酸、乙腈、磺基水楊酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、HCl 均為國產(chǎn)色譜純。

DPX-916恒溫培養(yǎng)箱 上海福瑪實驗設備有限公司);TA-XT.Plus型物性分析儀 英國Stable Micro Systems公司;UV-2000型分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;H-1650臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司;日立L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司;5975B/6890N氣相色譜質譜聯(lián)用儀(GC-MS) 美國Agilent公司;DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭(50 μm) 美國supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納地青霉菌株活化及發(fā)酵劑的制備 將納地青霉菌株接入察氏培養(yǎng)基斜面,置(27±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d,然后再從斜面上挑取菌苔接入另一個斜面上,重復以上的操作,連續(xù)轉接3次,即獲得活化菌株。將活化好的斜面菌株,用適量無菌生理鹽水反復沖洗吹打菌落,將孢子和菌絲移入滅菌的50 mL三角瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預置數(shù)粒玻璃珠),充分振搖后用6層無菌紗布進行過濾,并沖洗濾渣2～3次,最后使濾液體積達到10 mL,即為孢子懸浮液。將孢子懸浮液進行梯度稀釋,采用血球板計數(shù)法進行計數(shù),選擇106CFU/mL左右濃度的梯度稀釋液作為發(fā)酵劑[23]。

1.2.2 鴨血預處理及接種 將鴨血于平底容器中90 ℃水浴加熱30 min,凝固成塊后,用手術刀切成3 cm×3 cm×3 cm的小塊,取三塊于平皿(Φ10 cm)中。在121 ℃條件下滅菌20 min,取制備好的發(fā)酵劑0.5 mL無菌操作下均勻涂抹在鴨血表面,以涂抹無菌生理鹽水組作為空白對照組,27 ℃條件下發(fā)酵5 d,得到待測樣品。

1.2.3 質構的測定 用手術刀取塊型完整、均勻一致的待測樣品,采用TPA二次下壓法,利用物性分析儀(TA-XT. plus)測定。具體參數(shù):探頭型號為P/0.5R,測試前速度2.0 mm/s,測試速度1.0 mm/s,測試后速度1.0 mm/s,下壓距離10 mm。從TPA特征曲線計算出硬度(g)、彈性、黏著性(g·s)。每組樣品做3次平行實驗。

1.2.4 可溶性蛋白含量 采用考納斯亮藍法[24]測蛋白質濃度。

標準曲線的繪制:先準確配制1 mg/mL牛血清蛋白(BSA)母液,再往母液中加0.1 mol/L的PBS(pH=7.2)配制一組濃度分別為0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL的BSA溶液。取不同濃度的1 mL BSA溶液加入到試管中,再依次加入4 mL考馬斯亮藍溶液反應10 min,用分光光度計測定595 nm波長處的吸光度,并繪制標準曲線，得y=6.757x-0.002,R2=0.9997。

樣品蛋白溶液的制備:準確稱取1.0000 g鴨血樣品于研缽中加入9 mL PBS(pH=7.2)充分研磨,全部轉移到10 mL離心管中,8000 r/min離心10 min,取上清液1 mL加入到試管中,再依次加入4 mL考馬斯亮藍溶液反應10 min,用分光光度計測定595 nm波長處的吸光度,并根據(jù)標準曲線計算樣品中可溶性蛋白含量。

1.2.5 游離氨基酸測定 將真空冷凍干燥后的發(fā)酵、未發(fā)酵鴨血樣品研成粉末,準確稱取0.5000 g,加入6.0 mL去離子水混勻,超聲(80 Hz,室溫)提取20 min,用去離子水定容至10.0 mL,混勻。準確量取提取液2.0 mL加入2.0 mL 10%的磺基水楊酸,于10 mL離心管振蕩混勻,靜置2 h,4000 r/min離心15 min,準確取上清液2.0 mL,加入1 mL 1% EDTA-Na2溶液和1.0 mL 0.06 mol/L HCl溶液混合,振蕩5 min,高速離心(15000 r/min,25 ℃,10 min),取上清液1.0 mL,采用全自動氨基酸分析儀測定。

1.2.6 揮發(fā)性物質檢測 采用氣相色譜質譜聯(lián)用儀進行測定,將待測樣品切碎黃豆粒大小,取10 g(精確至0.0001)于固相微萃取瓶中,固相微萃取頭在氣相色譜儀進樣口老化60 min(280 ℃)后插入瓶中頂空部分,在60 ℃條件下萃取60 min,吸附結束后,拔出萃取頭,再于氣相色譜儀進樣口250 ℃下解吸2 min。

色譜條件:采用TR-5-MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min至200 ℃,再以10 ℃/min至240 ℃,保留10 min,運行總時間45 min;檢測溫度240 ℃;載氣為He;流速 1.6 mL/min;恒壓13.02 kPa;離子源溫度240 ℃;電子能量70 ev。

質譜定量分析:化合物經(jīng)過計算機檢索同時與NIST Library、Wiley Library、Mainlib數(shù)據(jù)庫匹配。匹配度和反匹配度大于600(最大值1000)的作為定性結果。采用相對百分含量按峰面積歸一化法處理,進行風味成分的定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 18.0的ANOVA軟件進行方差分析,并用Duncan’s多重比較,差異顯著性水平p<0.05，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 質構分析

由表1可知,發(fā)酵后鴨血的硬度顯著低于未發(fā)酵鴨血(p<0.05),但其粘性卻顯著增大(p<0.05),這可能是由于納地青霉在生長繁殖過程中分泌的蛋白酶作用于鴨血蛋白質肽鍵兩側的氨基酸殘基,致使肽鍵斷裂,蛋白質的二級結構被破壞,從而破壞了鴨血蛋白質的凝膠網(wǎng)絡結構,造成鴨血硬度減小。與此同時,蛋白質分解產(chǎn)生的多肽和氨基酸以及納地青霉自身分泌的多糖等小分子物質的出現(xiàn)也會導致鴨血表面粘性增加;與未發(fā)酵鴨血相比,發(fā)酵后鴨血的彈性有所增大,但是不顯著(p>0.05)。這可能是因為霉菌在生長繁殖過程中會消耗一定的水分,鴨血的水分活度下降,從而導致彈性的略微增大[25]。

表1 鴨血樣質構的變化

2.2 可溶性蛋白含量的比較分析

由圖1可知,與未發(fā)酵鴨血相比,發(fā)酵鴨血的可溶性蛋白含量顯著增加(p<0.05),由4.823 mg/g增加到8.443 mg/g。崔莎莎[26]發(fā)現(xiàn)蛋白質經(jīng)水解后,其表面疏水性會降低,溶解度隨水解程度的增大而增大。可溶性蛋白含量增加可能是納地青霉的蛋白酶作用于鴨血后,鴨血中的部分大分子蛋白質分解為小分子蛋白和多肽類物質所致。Mora等[27]研究了干腌肉制品中多肽的水解途徑,認為微生物在增加多肽和游離氨基酸含量方面具有非常大的作用,而且新增加的二肽、三肽主要是微生物分泌的二肽酶、三肽酶、氨肽酶和羧肽酶的作用結果。劉成梅等[7]認為鴨血中的血漿蛋白經(jīng)酶解后產(chǎn)生小分子肽和氨基酸,但是中等程度的水解也會產(chǎn)生苦味肽,苦味肽可進一步被水解為無苦味小肽。鴨血中蛋白質水解產(chǎn)生的小肽物質具有良好的溶解性、抗氧化性、可以直接被人體利用,提高了鴨血中大分子蛋白在人體中的利用率增加了鴨血的營養(yǎng)價值[28]。

圖1 未發(fā)酵鴨血與發(fā)酵鴨血可溶性蛋白含量變化

2.3 游離氨基酸的比較分析

由表2可知,在鴨血中共檢測出17種氨基酸,發(fā)酵鴨血與未發(fā)酵鴨血相比,除精氨酸含量變化不顯著(p>0.05)外,其他游離氨基酸的含量均顯著增加(p<0.05);其中,經(jīng)過發(fā)酵,鴨血中谷氨酸含量變化最大,增加了0.583%,其次是苯丙氨酸、亮氨酸和丙氨酸,分別增加了0.560%、0.520%、0.360%。納地青霉分泌多種蛋白酶,首先由內(nèi)切蛋白酶將鴨血蛋白水解為長鏈肽,然后由外切蛋白酶進一步水解為小分子肽和氨基酸,消除苦味肽,增加風味肽[29]。發(fā)酵后鴨血中游離氨基酸的總量是發(fā)酵前的20.58倍,該結果與Mrázek等[22]的研究結果一致。

表2 鴨血樣中游離氨基酸的含量(%)

2.4 揮發(fā)性物質的比較分析

由圖2、圖3及表3可知，與未發(fā)酵鴨血中各揮發(fā)性物質的含量相比,發(fā)酵鴨血樣品中酯類、醛類和酰胺類物質的含量和種類顯著增加(p<0.05),酯類物質主要來源于納地青霉對鴨血中蛋白質分解形成羥基和脂肪分解產(chǎn)生的羧基相結合產(chǎn)生,醛類則是由醇羥基氧化產(chǎn)生的[30]。三甲胺是產(chǎn)生魚腥味的主要物質,2,6-壬二烯醛也屬于風味閾值低、有異味的物質[31]。在發(fā)酵鴨血中,另外2,6-壬二烯醛顯著低于未發(fā)酵鴨血(p<0.05)。另外,三甲胺、苯甲醛(堅果香)、4-丁基苯酚(中藥氣味)、正辛醇(刺激性氣味)、癸酮(油膩的脂肪氣味)在發(fā)酵鴨血中均未檢出,有可能是在發(fā)酵過程中參與其他反應或者揮發(fā)盡了。鴨血在發(fā)酵過程中在納地青霉的作用下發(fā)生明顯的水解作用,同時也發(fā)生復雜的氧化還原反應、美拉德反應,最終使發(fā)酵鴨血的揮發(fā)性成分復雜多樣,變化顯著(p<0.05)。酯類物質多帶有水果味,某些酯類(乙酸乙酯、壬酸乙酯等)還帶有輕微的酯香味。因此,以納地青霉發(fā)酵鴨血,不僅能夠有效較少鴨血的腥味,還可產(chǎn)生多種新的芳香類物質,對發(fā)酵鴨血起到增香增味的作用。

圖2 未發(fā)酵鴨血揮發(fā)性物質總離子流色譜圖

圖3 發(fā)酵鴨血揮發(fā)性物質總離子流色譜圖

表3 GC-MS分析鴨血樣中主要揮發(fā)性物質成分組成

3 結論

本研究以納地青霉為發(fā)酵劑,高溫高壓滅菌的鴨血為發(fā)酵底物進行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前后鴨血的硬度顯著降低(p<0.05),粘性顯著增大(p<0.05),而彈性變化不顯著(p>0.05)。相比于未發(fā)酵鴨血,發(fā)酵鴨血的可溶性蛋白、游離氨基酸的含量顯著增加(p<0.05),鴨血的營養(yǎng)價值得到提升。此外,發(fā)酵前后鴨血揮發(fā)性成分的種類及含量也有較為明顯的變化。發(fā)酵鴨血中揮發(fā)性物質主要為醛類和酯類物質,而鴨血中的腥味物質如2,6-壬二烯醛顯著減少(p<0.05),三甲胺等未檢出，血腥味幾乎消失,這為鴨血的開發(fā)利用提供了新的思路和方法。

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