湯佳鵬,汪建雄

(1.南通大學(xué)航海醫(yī)學(xué)研究所,生化與藥學(xué)研究室,江蘇南通 226019;2.南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物工程系,江蘇南通 226019)

蛹蟲草是一種歷史悠久的著名中藥,現(xiàn)在作為新資源食品和一類新藥已獲得衛(wèi)生部和國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進(jìn)入市場[1]。蟲草素是蛹蟲草中最重要的生理活性物質(zhì)之一,具有多種藥理學(xué)活性,包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降血脂等,因此越來越受到人們的重視[2]。目前,蛹蟲草液體發(fā)酵中蟲草素分泌于胞外可直接進(jìn)行提取,優(yōu)于固體發(fā)酵而被廣泛研究。鐘建江等[3]利用液體深層發(fā)酵和添加小分子效應(yīng)物的方法,蟲草素產(chǎn)量達(dá)到596.59 mg/L。路等學(xué)等[4]利用振蕩和靜置的發(fā)酵方式液體發(fā)酵蛹蟲草,蟲草素產(chǎn)量達(dá)到936.225 μg/mL。Sakakibara等[5-8]通過長期研究利用離子束誘變菌株,采用液體表面培養(yǎng)(即靜置發(fā)酵)代替液體深層發(fā)酵,添加前體物質(zhì),優(yōu)化培養(yǎng)基的方法,蟲草素產(chǎn)量達(dá)到14.3 g/L,已經(jīng)成為大規(guī)模蛹蟲草發(fā)酵的主流。本實(shí)驗(yàn)室采用液體表面培養(yǎng),通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,蟲草素產(chǎn)量達(dá)到6.5 g/L[9],但是液體表面發(fā)酵菌體生長緩慢,且蟲草素產(chǎn)量仍較日本水平低,已經(jīng)成為制約我國蛹蟲草及蟲草素進(jìn)一步研究開發(fā)利用的瓶頸[10]。

植物生長調(diào)節(jié)劑以其特殊的生理調(diào)控機(jī)制,能夠通過影響生物的生長發(fā)育,達(dá)到增加產(chǎn)量、優(yōu)化品質(zhì)、代謝調(diào)節(jié)等目的，已經(jīng)在固態(tài)發(fā)酵和液體深層發(fā)酵蛹蟲草中被深入研究[11-14]。通過添加2,4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸能夠促進(jìn)蟲草素的積累;玉米素、吲哚乙酸的添加能夠加快子實(shí)體生長及增加子實(shí)體多糖含量。三十烷醇是一種從蜂蠟中提取的天然的長碳鏈植物生長調(diào)節(jié)劑,且作用靶點(diǎn)多元化,既能增加細(xì)胞膜的透性,又能激活葡萄糖-6-磷酸脫氫酶[4];赤霉素是一種產(chǎn)自真菌赤霉菌的激素,本研究所采用的菌株也屬于真菌;6-BA,即6-芐基腺嘌呤是一種腺嘌呤的衍生物,而本研究的主要產(chǎn)物蟲草素也是腺嘌呤的衍生物。另外,這三種化合物均有作為真菌發(fā)酵(主要是擔(dān)子菌)效應(yīng)物的報(bào)道。

本文將不同濃度的三種植物生長調(diào)節(jié)劑三十烷醇(TRIA)、赤霉素(GA)和6-芐基腺嘌呤(6-BA)加入到蛹蟲草液體表面培養(yǎng)培養(yǎng)基中,探究植物生長調(diào)節(jié)劑對蛹蟲草菌絲生長和蟲草素積累的影響規(guī)律,并通過中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD)和響應(yīng)面方法優(yōu)化植物生長調(diào)節(jié)劑添加組合,以期提高蟲草素的生產(chǎn)效率,為蛹蟲草發(fā)酵生產(chǎn)的規(guī)?；?、工廠化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種和材料

蛹蟲草(CordycepsmilitarisCICC 14014) 中國工業(yè)微生物保藏中心;斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯汁200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、VB1微量;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖42 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏6 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、K2HPO40.5 g/L、腺嘌呤 4.0 g/L、花生油 4%(V/V),用5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.80;TRIA 上海麥克林生化科技有限公司;GA和6-BA 阿拉丁試劑(上海)有限公司;蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品購自中檢所。

LDZX-75KBS立式全自動滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-1BU超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;PHS-3E酸度計(jì) 上海精科雷磁儀器廠;LC-20AD高效液相色譜儀(SPD-20A紫外檢測器) 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸液的制備 蛹蟲草在斜面培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)7～10 d后,用無菌水將孢子刮下,經(jīng)玻璃珠振蕩30 min后,用4層無菌紗布過濾,收集孢子懸液,利用血球計(jì)數(shù)板測定孢子濃度[15],并將孢子懸液濃度稀釋到1.0×103個(gè)/mL。

1.2.2 蛹蟲草液體表面培養(yǎng) 以10%(V/V)的接種量將孢子懸液接入到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,充分振蕩混勻。在27 ℃靜置培養(yǎng)28 d。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。

1.2.3 生物量和蟲草素含量檢測 取培養(yǎng)一定時(shí)間的發(fā)酵液,10000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后利用高效液相色譜法檢測蟲草素濃度。色譜條件:色譜柱為Ultimate AQ-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動相為無水甲醇∶10 mmol/L KH2PO4溶液=15∶85,柱溫40 ℃,流速1 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,檢測波長為260 nm。蟲草素濃度的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=4.8×107X-129340(Y,峰面積;X,蟲草素濃度,g/L),相關(guān)系數(shù)R2為0.9997。蟲草素含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程采用外標(biāo)法計(jì)算。蟲草素產(chǎn)量根據(jù)以下公式計(jì)算:

式中:P為蟲草素產(chǎn)量,g/L;c為蟲草素含量,g/L;V為三角瓶中收集的發(fā)酵液體積,mL;V0為三角瓶中初始加入的培養(yǎng)基體積,mL。

離心得到的沉淀用水洗滌3遍,110 ℃烘干至恒重,計(jì)算生物量。

菌體比生長速率按以下公式計(jì)算:

式中:μ為菌體的比生長速率,d-1;X為菌體生物量,g/L;t為培養(yǎng)時(shí)間,d。

1.2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑的單因素實(shí)驗(yàn) 在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的各種植物生長調(diào)節(jié)劑(表1),進(jìn)行液體表面培養(yǎng)28 d,測定蟲草素產(chǎn)量和生物量。

表1 各種植物生長調(diào)節(jié)劑的加入終濃度

1.2.5 植物生長調(diào)節(jié)劑的中心復(fù)合設(shè)計(jì) 以蟲草素產(chǎn)量為評價(jià)指標(biāo),采用3因素中心復(fù)合設(shè)計(jì)優(yōu)化蛹蟲草液體表面培養(yǎng)中的植物生長調(diào)節(jié)劑組合,將單因素實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果作為中心復(fù)合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn),中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)為6次,因素水平見表2。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素編碼水平表

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 用Design-Expert v8.0.6對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)回歸分析。利用方差分析評估實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性。3D圖顯示變量間相互作用對蟲草素產(chǎn)量的影響。模型的準(zhǔn)確性利用R2來評價(jià)。擬合方程的統(tǒng)計(jì)顯著性由方差分析中的F檢驗(yàn)來評價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRIA濃度對蛹蟲草菌體生長和蟲草素積累的影響

由圖1可知,發(fā)酵初始的0～8 d菌體生長緩慢,為蛹蟲草菌體生長的適應(yīng)期。孢子進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中需要適應(yīng)新的生長環(huán)境,因此該階段菌體合成相應(yīng)的酶類為快速生長做準(zhǔn)備。TRIA的加入對蛹蟲草生長的適應(yīng)期沒有顯著影響。發(fā)酵8 d后,菌體快速生長,進(jìn)入快速生長期。發(fā)酵12 d,對照組的菌體最大比生長速率為0.376 d-1,0.2 mg/L TRIA的加入使菌體最大，生長速率達(dá)到0.459 d-1(8 d),比對照組提高了22.1%。發(fā)酵至28 d時(shí),培養(yǎng)基中加入0.2 mg/L TRIA的菌體生物量達(dá)到37.56 g/L,比對照組高出130%。隨著TRIA濃度的增加,菌體生物量逐漸下降。因此,為了促進(jìn)蛹蟲草菌體的生長,TRIA的最佳加入量為0.2 mg/L。TRIA活性的作用部位可能在細(xì)胞膜上[16],適當(dāng)濃度的TRIA能夠增加細(xì)胞膜的透性,促進(jìn)氮源和碳源的吸收、轉(zhuǎn)化,加快菌絲生長。但是濃度過高時(shí),細(xì)胞膜透性減弱,營養(yǎng)吸收受到阻礙,會抑制菌體的萌發(fā)[16]。

圖1 TRIA對蛹蟲草菌體生長的影響

由圖2可知,隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中TRIA加入量的增加,蟲草素產(chǎn)量也逐漸增加。當(dāng)TRIA加入量為0.6 mg/L時(shí),其促進(jìn)蟲草素合成的效果最佳,培養(yǎng)28 d蟲草素產(chǎn)量達(dá)到5.24 g/L,比對照組提高了173%。當(dāng)TRIA加入量繼續(xù)增大時(shí),蟲草素產(chǎn)量又逐漸下降。TRIA能激活菌體內(nèi)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶[16],該酶是蟲草素前體的合成途徑(包括磷酸戊糖途徑及核苷酸合成途徑)的關(guān)鍵酶,因此適當(dāng)濃度的TRIA能夠促進(jìn)蟲草素的合成。

圖2 TRIA對蛹蟲草蟲草素積累的影響

2.2 GA濃度對蛹蟲草菌體生長和蟲草素積累的影響

由圖3可知,對照組菌體的適應(yīng)期為8 d,而GA加入條件下,菌體適應(yīng)期僅為4 d。這說明GA的加入縮短了蛹蟲草孢子萌發(fā)的適應(yīng)期。同時(shí),GA的加入可以明顯促進(jìn)菌體生長。這可能是由于GA對細(xì)胞伸長和細(xì)胞分裂具有促進(jìn)作用[17]。發(fā)酵至8 d,對照組的菌體比生長速率達(dá)到最大(0.367 d-1),而10 mg/L GA的加入將菌體比生長速率提高到0.634 d-1(4 d)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入10 mg/L GA時(shí),菌體生長最旺盛,發(fā)酵至28 d,生物量累積達(dá)到40.66 g/L。但是隨著GA濃度的繼續(xù)增加,蛹蟲草的生物質(zhì)積累逐漸下降,即GA的促生作用僅在低濃度時(shí)最顯著。

圖3 GA對蛹蟲草菌體生長的影響

由圖4可知,除了促生作用之外,GA也能促進(jìn)蟲草素的合成。當(dāng)GA濃度為0～20 mg/L時(shí),隨著GA濃度的增大,蟲草素產(chǎn)量呈上升趨勢;當(dāng)GA濃度超過20 mg/L時(shí),隨著GA濃度的增加,蟲草素產(chǎn)量呈下降趨勢。即20 mg/L GA對蛹蟲草表面液體發(fā)酵合成蟲草素的促進(jìn)作用最明顯。發(fā)酵至28 d,蟲草素的產(chǎn)量達(dá)到3.16 g/L,比對照組提高了65%。

圖4 GA對蛹蟲草蟲草素積累的影響

2.3 6-BA濃度對蛹蟲草菌體生長和蟲草素積累的影響

圖5顯示的是不同濃度的6-BA對表面液體發(fā)酵條件下蛹蟲草菌體生長的影響。由圖5可知,6-BA同GA一樣,都有縮短蛹蟲草孢子萌發(fā)適應(yīng)期的作用。這可能是由于在擔(dān)子菌生長過程中,6-BA促進(jìn)了菌體中核酸和蛋白的合成代謝[18-19],從而促進(jìn)孢子的生長發(fā)育。在一定濃度范圍內(nèi),6-BA能夠促進(jìn)菌體生長。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有1.6 mg/L 6-BA時(shí),其促生作用最為顯著。發(fā)酵28 d,蛹蟲草生物量達(dá)到27.32 g/L。

圖5 6-BA對蛹蟲草菌體生長的影響

另外,由圖6可知,6-BA也能夠促進(jìn)蟲草素的積累。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有0～1.6 mg/L 6-BA時(shí),隨著6-BA加入量的增加,蟲草素的積累也逐漸增加。當(dāng)6-BA的濃度增加到2.0 mg/L時(shí),蟲草素產(chǎn)量反而有所下降。因此,為了提高蟲草素的產(chǎn)量,單獨(dú)添加6-BA時(shí),6-BA的最佳濃度為1.6 mg/L。此時(shí),發(fā)酵28 d的蟲草素積累達(dá)到4.36 g/L,比對照組高出127%。

圖6 6-BA對蛹蟲草蟲草素積累的影響

2.4 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)

菌體生長是蟲草素積累的前提，但菌體生長又與蟲草素合成競爭性利用碳源和氮源。從上述單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)植物生長調(diào)節(jié)劑導(dǎo)致的菌體生長改變和蟲草素積累變化，兩者關(guān)系是復(fù)雜的。由單因素實(shí)驗(yàn)可知,分別單獨(dú)加入TRIA、GA、6-BA時(shí),加入量為0.60、20.00和1.60 mg/L時(shí),均能獲得較高的蟲草素產(chǎn)量。因此,以此組合作為中心復(fù)合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn),利用Design-Expert v8.0.6軟件設(shè)計(jì)中心復(fù)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以蟲草素產(chǎn)量為響應(yīng)值,運(yùn)用Design-Expert v8.0.6軟件對表3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析,得到方程為Y=7.21-0.25A+0.40B+0.29C-0.13AB-0.52AC-0.035BC-0.89A2-0.79B2-0.85C2?；貧w方程的方差分析及模型擬合度見表4。

表4 回歸方程的方差分析

由圖7及軟件分析可知,回歸方程存在最高點(diǎn),通過對回歸方程求導(dǎo)及極值分析可知,TRIA為0.55 mg/L,GA為22.64 mg/L,6-BA為1.69 mg/L,此條件下預(yù)測得到的蟲草素產(chǎn)量為7.32 g/L。另外,通過方差分析(表4)和響應(yīng)面(圖7)的結(jié)果分析,TRIA一方面增加細(xì)胞膜透性,促進(jìn)了營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞,另一方面激活葡萄糖-6-磷酸脫氫酶促進(jìn)五碳糖和嘌呤核苷酸的合成[16],而GA或6-BA則加速同化作用,強(qiáng)化了細(xì)胞的分裂,增加蟲草素合成的單元[17-19]。因此,GA與6-BA和TRIA均存在互補(bǔ)效應(yīng),在蟲草素合成上TRIA能夠與GA或6-BA產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)作用。但是,GA與6-BA作用靶點(diǎn)重復(fù),交互作用不明顯。

圖7 三十烷醇濃度、赤霉素濃度與6-芐基腺嘌呤濃度對蟲草素產(chǎn)量的響應(yīng)面圖

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面方法回歸方程預(yù)測結(jié)果是否可靠,采用上述最佳條件進(jìn)行液體表面培養(yǎng)。最終,蟲草素產(chǎn)量達(dá)到7.31±0.19 g/L(n=5)。與方程預(yù)測值相比,相對誤差在1%以內(nèi)。這表明響應(yīng)面法擬合的回歸方程可以用于預(yù)測實(shí)際的蟲草素產(chǎn)量。

3 結(jié)論

本文利用三種植物生長調(diào)節(jié)劑TRIA、GA和6-BA對蛹蟲草液體表面培養(yǎng)過程的菌體生長、蟲草素合成進(jìn)行調(diào)控,并結(jié)合多因素響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)研究了植物生長調(diào)節(jié)劑的組合對蛹蟲草蟲草素積累的影響規(guī)律。三種植物生長調(diào)節(jié)劑TRIA、GA和6-BA均能不同程度的促進(jìn)蛹蟲草的生長,但不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑促進(jìn)效果不同。經(jīng)中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),三種植物生長調(diào)節(jié)劑的最佳組合為0.55 mg/L TRIA、22.64 mg/L GA與1.69 mg/L 6-BA,在該條件下蟲草素最大產(chǎn)量達(dá)到7.31 g/L接近預(yù)測值，可用于預(yù)測實(shí)際蟲草素產(chǎn)量。

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