周小兵,林路英,彭 燦,何小芬,李 卉,蘇 敦,*

(1.深圳市華大農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究院,廣東深圳 518083;2.深圳華大生命科學研究院,廣東深圳 518120)

乳酸片球菌,能夠產(chǎn)生片球菌素[1],具有抑菌[2]、降低膽固醇[3]等益生功能,主要應(yīng)用在食品發(fā)酵[4]、防腐[5]等方面。益生菌是指通過攝取適當?shù)牧?對宿主的身體健康能發(fā)揮有益作用的活菌[6],近年來由于益生菌在調(diào)節(jié)腸道、增強免疫力、降低膽固醇、抗癌等方面的功能逐漸被發(fā)現(xiàn)[7],其研究和應(yīng)用越來越受到廣泛關(guān)注。國家衛(wèi)生計生委于2014年4月16日發(fā)布公告批準乳酸片球菌為新食品原料[8],乳酸片球菌在我國正式被納入可食用益生菌范疇,大大拓展了乳酸片球菌的應(yīng)用空間。

真空冷凍干燥是生產(chǎn)和保存活細胞最有效的方法之一,在低溫下凍結(jié)物料使之成為固態(tài),然后在真空環(huán)境下使水分直接升華從而實現(xiàn)物料干燥[9]。真空冷凍干燥是冷凍和干燥技術(shù)的有機結(jié)合,菌體在凍干過程中會經(jīng)歷冷凍和干燥兩個過程的刺激,不可避免的會造成損傷[10]。由于冷凍而導(dǎo)致對生物系統(tǒng)的損傷主要來自于兩個方面,即細胞膜脂肪酸物理性狀的改變和相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)的改變,干燥過程對益生菌細胞造成損傷的兩大根源是膜的融合與脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變[11]。凍干前在菌懸液中加入適當?shù)谋Ｗo劑能有效避免冷凍和干燥過程中的細胞損傷,從而提高細胞的存活率[12]。朱奇奇等[13]采用海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、脫脂乳粉作為植物乳桿菌凍干保護劑,存活率達到83.32%;沈頤涵[14]以脫脂奶粉、甘露醇、VC-Na、味精為保護劑,嬰兒雙歧桿菌凍干存活率由43%提高到85.42%;許娜等[15]通過添加脫脂奶粉、海藻糖、甘油作為保護劑,鼠李糖乳桿菌的凍干存活率為86.69%。凍干存活率不僅受保護劑影響,微生物自身特性也會影響凍干效果,不同微生物最合適的保護劑成分和保護劑配方不同[16]。

本研究以實驗室篩選的專利菌株乳酸片球菌為研究對象,采用響應(yīng)面法進行研究,以確定最佳凍干保護劑配方,為乳酸片球菌的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸片球菌 中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏編號CGMCC10512;海藻糖、甘露醇 生工生物工程有限公司;硫酸錳 天津市大茂化學試劑廠;抗性淀粉 西安沛森生物科技有限公司;茶粉 廣東天池茶業(yè)股份有限公司;MRS培養(yǎng)基 美國BD DIFCO；實驗所用試劑 均為分析純。

Alpha 1-4 LD plus真空冷凍干燥機 德國Christ;壓力蒸汽滅菌器 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;5810R冷凍高速離心機 德國Eppendorf;生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;DW-86L490超低溫保存箱 青島海爾股份有限公司;Vortex-5渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司、pHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 甘油管保藏的菌體在MRS固體培養(yǎng)基平板上劃線,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落轉(zhuǎn)接到液體MRS培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h,以1%的接種量轉(zhuǎn)接,37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。

1.2.2 活菌計數(shù) 將發(fā)酵液用無菌生理鹽水進行梯度稀釋,選擇合適的梯度采用滾珠法涂布平板,37 ℃培養(yǎng)48 h進行菌落計數(shù),計算發(fā)酵液中活菌數(shù)量。

1.2.3 冷凍干燥 菌液經(jīng)4000 r/min、4 ℃離心10 min,棄上清,加等體積0.85%的生理鹽水懸浮,相同條件下再次離心,棄上清液,濕菌體與一定配比的保護劑以1∶6的比例再懸浮,置于4 ℃冰箱預(yù)凍1 h,再置于-20 ℃冰箱預(yù)凍1 h至固化,然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱凍結(jié)1 h。凍干機開機預(yù)凍5 min至溫度降為-55 ℃,將處理好的菌體轉(zhuǎn)移至凍干機凍干24 h,即獲得凍干粉[17]。

1.2.4 Plackett-Burman實驗 選取海藻糖濃度、甘油濃度、甘露醇濃度、可溶淀粉濃度、抗性淀粉濃度、乙酸鈉濃度、硫酸錳濃度、茶粉濃度八個因素設(shè)計Plackett-Burman實驗,按表2配方配制保護劑,冷凍干燥,比較凍干存活率。

表1 Plackett-Burman實驗因素與水平(g/L)

表2 Box-Behnken實驗因素與水平

1.2.5 最陡爬坡實驗 響應(yīng)面擬合方程只有在考察區(qū)域才能充分近似真實情形,首先需要逼近最佳區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。針對Plackett-Burman實驗所得顯著因素海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度,根據(jù)效應(yīng)的大小及正負設(shè)定步長和變化方向,設(shè)計實驗,冷凍干燥,比較凍干存活率。

1.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面實驗 以凍干存活率為響應(yīng)值,針對顯著影響因素海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度設(shè)計Box-Behnken實驗,按表2因素與水平配制保護劑,冷凍干燥,比較凍干存活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Minitab軟件進行Plackett-Burman實驗設(shè)計并進行顯著性分析;采用Design Expert軟件設(shè)計Box-Behnken實驗,對數(shù)據(jù)進行方差分析及二次多項回歸擬合。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman實驗篩選顯著影響因素

根據(jù)表3結(jié)果比較各因素顯著性,結(jié)果見表4。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

表4 Plackett-Burman實驗各因素效應(yīng)評價

由表4可知，各因素對凍干存活率影響顯著性排列：海藻糖濃度>甘露醇濃度>硫酸錳濃度>甘油濃度>可溶淀粉濃度>茶粉濃度>乙酸鈉濃度>抗性淀粉濃度,其中海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度對凍干存活率影響顯著。眾多研究表明海藻糖能對微生物細胞起很好的保護作用[17-19],關(guān)于海藻糖、甘露醇等多羥基物質(zhì),其保護作用有幾種假說:一種是改變了膜相變溫度,當磷脂干燥脫水時,海藻糖在失水部位以氫鍵和磷脂的極性端相連,防止狀態(tài)的轉(zhuǎn)變和復(fù)水時的滲漏,從而提高存活率[20];另一種是影響體系玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,海藻糖能夠促進玻璃體的形成,減少對蛋白質(zhì)及細胞有破壞作用的冰晶的生成,從而提高被保存物質(zhì)的穩(wěn)定性[21]。海藻糖t值為負說明對響應(yīng)值有負效應(yīng),濃度應(yīng)遞減,甘露醇和硫酸錳為正,濃度應(yīng)遞增。

2.2 最陡爬坡實驗研究最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域

通過Plackett-Burman實驗篩選出了對菌體凍干存活率影響最大的三個因素:海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度,最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果如表5所示，海藻糖濃度70 g/L,甘露醇濃度40 g/L,硫酸錳濃度1.5 g/L在最大響應(yīng)值區(qū)間。

表5 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果及響應(yīng)面分析

表6顯示了Box-Behnken實驗結(jié)果,對其進行方差分析,結(jié)果如表7所示。

表6 Box-Behnken實驗設(shè)計結(jié)果

表7 Box-Behnken實驗結(jié)果方差分析

圖1 海藻糖和甘露醇交互作用對菌體存活率影響的響應(yīng)面及等高線圖

圖2 海藻糖和硫酸錳交互作用對菌體存活率影響的等高線及響應(yīng)面圖

圖3 硫酸錳和甘露醇交互作用對菌體存活率影響的等高線及響應(yīng)面圖

以存活率最高為條件進行優(yōu)化,得到最優(yōu)解:海藻糖濃度為73.64 g/L,甘露醇濃度為43.76 g/L,硫酸錳濃度為1.91 g/L,預(yù)測凍干存活率為98.72%。采用優(yōu)化得到的結(jié)果進行三次凍干驗證實驗,得到存活率為98.10%±1.03%,與預(yù)測值接近,說明該優(yōu)化方法可信度較高,可以用來進行保護劑配方的篩選和優(yōu)化。

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法篩選和優(yōu)化了乳酸片球菌冷凍干燥保護劑配方。首先通過Plackett-Burman實驗研究8種保護劑成分對凍干存活率的影響,從中找出了影響顯著的三個因素:海藻糖濃度、甘露醇濃度、硫酸錳濃度。然后通過最陡爬坡實驗逼近了最大響應(yīng)區(qū)域,最后通過Box-Behnken實驗擬合出一個三元二次多項式方程,找到了最佳配方:海藻糖濃度為73.64 g/L,甘露醇濃度為43.76 g/L,硫酸錳濃度為1.91 g/L,其中海藻糖濃度和甘露醇濃度具有顯著的交互作用,將優(yōu)化的配方進行凍干驗證,乳酸片球菌凍干存活率為98.10%±1.03%，與預(yù)測值98.72%接近。該配方存活率高,具有較高應(yīng)用價值。

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