丁金花 ，馬旭升 ，蔡卓軒 ，肖盛中 ，吳鵬 ，盛金良 ，陳創(chuàng)夫

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

牛病毒性腹瀉/粘膜?。˙ovine viral diarrheamucosal disease，BVD-MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的傳染病[1]，各種年齡的牛均易感染、以犢牛易感性最高，同時(shí)對(duì)山羊和綿羊均存在持續(xù)性感染。給我國(guó)乃至全球養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。BVDV之所以無(wú)法消除，一個(gè)重要的原因就是持續(xù)性感染（PI）動(dòng)物的存在[3]。考慮到PI動(dòng)物為病毒傳播提供了重要的條件，控制BVDV的關(guān)鍵因素是識(shí)別和消除PI動(dòng)物[4]。

在全球范圍內(nèi)，消除牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）仍處于起步階段[5]。雖然BVDV感染可以從臨床癥狀中來(lái)確診，但由于病毒的基因型不同以及病程不同使得臨床癥狀表現(xiàn)出差異[6]，尤其是持續(xù)性感染牛通常無(wú)明顯的臨床癥狀，給診斷帶來(lái)了不便并使診斷結(jié)果變得不可靠[7]。在已經(jīng)建立的診斷方法中，如病毒分離、免疫組化、核酸檢測(cè)、病毒中和實(shí)驗(yàn)等均因其工作量大、需要專(zhuān)業(yè)人員和儀器等條件的制約，而無(wú)法在牧場(chǎng)推廣應(yīng)用[8]。而另外一種檢測(cè)方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）因其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異性而被廣泛應(yīng)用。

在BVDV病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中，E0是BVDV編碼蛋白中保守性很高的蛋白，其含有中和表位，可產(chǎn)生的中和抗體具有中和BVDV和CSFV的能力[9]。通過(guò)對(duì)E0氨基酸序列的分析，可得知E0中含有一段保守較高的結(jié)構(gòu)區(qū)域[10]，這使得E0在研究制備基因工程亞單位疫苗以及作為基因工程診斷的抗原中擔(dān)任了重要的角色。

在本研究中，首先對(duì)E0基因進(jìn)行原核表達(dá)載體的構(gòu)建，獲得E0蛋白。通過(guò)方陣滴定法初步建立了檢測(cè)BVDV血清抗體的間接ELISA方法，對(duì)收集的約88份血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，并與商品化的國(guó)外試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，以期為檢測(cè)BVDV提供了一種方法并為試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pACNR/NADL質(zhì)粒由石河子大學(xué)人畜共患病實(shí)驗(yàn)室保存，BVDV陽(yáng)性血清和陰性血清購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，牛布魯氏菌病陽(yáng)性血清、牛傳染性鼻氣管炎病毒陽(yáng)性血清、牛支原體陽(yáng)性血清、牛副結(jié)核陽(yáng)性血清和口蹄疫病毒陽(yáng)性血清勻由本實(shí)驗(yàn)室保存，HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG購(gòu)自北京博奧森；96微孔板購(gòu)自Costar公司，脫脂奶粉，牛血清白蛋白（BSA），明膠，TMB顯色液，酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 引物的合成

根據(jù)GenBank中公布的E0基因序列（登錄號(hào)：NC_001461.1），用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物，上、下游引物分別引入BglⅡ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，Erns基因上游：5'AGATCTGGAAAACATAACACAGTGG3'， 下 游 ：5'GTCGACAGCGTATGCTCCAAAC 3'下劃線部分分別為BglⅡ、SalⅠ酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增

以pACNR/NADL質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增 Erns，擴(kuò)增體系如下：ddH2O 9.7 μL，上下游引物各 0.4 μL，模板 2.0 μL，Mix 12.5 μL。

反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5min，94℃ 30 s，61 ℃ 35 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸7 min，置4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，備用。

1.2.3 pET-32a-E0表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

通過(guò)限制性酶切位點(diǎn) BglⅡ、SalⅠ將載體pET-32a（+）雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。用T4 DNA連接酶將E0基因與回收的pET-32a（+）載體在16℃進(jìn)行過(guò)夜連接。次日，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于LB固體培養(yǎng)基上（含100 μg/mL氨芐青霉素）37℃過(guò)夜培養(yǎng)。采用BglⅡ、SalⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。

1.2.4 E0蛋白的表達(dá)與檢測(cè)

將測(cè)序成功的pET-32a-E0質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，然后均勻涂布到 LB平板上（含100 μg/mL的氨芐青霉素），之后倒置于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜。從轉(zhuǎn)化的平板中挑選單克隆，接種到4 mL的 LB培養(yǎng)基中（含 100 μg/mL的氨芐青霉素），待培養(yǎng)至 OD600nm為 0.5-0.8，取出 1 mL菌液備用。向試管培養(yǎng)液中加入終濃度 0.1 mmol/L IPTG，分別誘導(dǎo) 2、4、6、8 h。

1.2.5 重組E0蛋白的純化與Western-Blot檢測(cè)

將得到的全菌蛋白用蛋白純化儀進(jìn)行純化，然后將純化的目的蛋白E0用SDS-PAGE和Western-Blot進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 間接ELISA方法的建立

將純化好的E0蛋白用包被液稀釋成一定濃度，加入96微孔板中，每孔100 μL，37℃包被2 h。取出包被好的微孔板，棄去包被液，用1%PBST洗滌4次。加入封閉液100 μL/孔，37℃恒溫箱封閉一定時(shí)間。洗滌同上，將待檢血清（陽(yáng)性和陰性）稀釋一定比例，加入96微孔板中100 μL/孔，37℃恒溫箱孵育一定時(shí)間。用1%PBST洗4次，將稀釋好的酶標(biāo)二抗100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，置于37℃恒溫箱孵育一定時(shí)間。洗滌同上，加入TMB顯色液，100 μL/孔，37℃恒溫箱孵育一定時(shí)間。濃硫酸終止50 μL/孔。酶標(biāo)儀測(cè)OD450nm。

1.2.7 特異性實(shí)驗(yàn)

用已建立的間接ELISA方法檢測(cè)牛布魯氏菌病陽(yáng)性血清、牛傳染性鼻氣管炎病毒陽(yáng)性血清、牛支原體陽(yáng)性血清、牛副結(jié)核陽(yáng)性血清和口蹄疫病毒陽(yáng)性血清作最佳稀釋度稀釋?zhuān)瑫r(shí)做BVDV陽(yáng)性和陰性血清對(duì)照，按照間接ELISA操作方法測(cè)定 OD450nm。

2017年7月以來(lái)，按照中央環(huán)保督察反饋意見(jiàn)和整改方案，湖南省委書(shū)記、省長(zhǎng)先后21次主持召開(kāi)與中央環(huán)保督察整改工作有關(guān)的會(huì)議，9次深入整改一線調(diào)研督導(dǎo)，20次對(duì)環(huán)保督察整改工作做出批示，督促地方加快解決突出環(huán)境問(wèn)題。各地堅(jiān)持高位推進(jìn)，集中資源，倒排工期，全力推進(jìn)整改攻堅(jiān)，加快解決了一批長(zhǎng)期未得到有效解決的突出問(wèn)題。

1.2.8 靈敏性實(shí)驗(yàn)

將陽(yáng)性血清做梯度稀釋 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200，其他條件不變，按照已建立的間接ELISA操作方法測(cè)定OD450nm，檢測(cè)其靈敏度。

1.2.8 商品化試劑盒的比較

應(yīng)用本研究建立的間接ELISA方法與和美國(guó)IDEXX公司的牛病毒性腹瀉病毒抗體檢測(cè)試劑盒比較，同時(shí)檢測(cè)來(lái)自不同牧場(chǎng)的88份牛血清樣品，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

圖1 PCR擴(kuò)增的Erns基因Fig.1 PCR amplification of Ernsgene

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增及pET-32a-E0表達(dá)載體的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果從pACNR/NADL中得到與預(yù)期大小相符的目的片段條帶（圖1）；將構(gòu)建成功的pET-32a-E0載體用酶BglⅡ和SalⅠ切割，得到2條DNA帶分別為683和5900 bp（圖 2）。

圖2 pET-32a-Erns重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定Fig.2 pET-32a-ErnsIndetification of the recombinant expressed plasmid

2.2 E0基因的表達(dá)、純化和Western-Blot檢測(cè)

結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 pET-32a-Erns表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 pET-32a-ErnsSDS-PAGE profile of expressed product

將重組菌誘導(dǎo)表達(dá) 2、4、6、8 h產(chǎn)物以及未誘導(dǎo)的菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未誘導(dǎo)的菌液未檢測(cè)到表達(dá)蛋白，經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的菌在45 kD處有蛋白條帶且在6和8 h表達(dá)量最高（圖3）。Western-Blot檢測(cè)結(jié)果表明該條帶與預(yù)期45 kD大小的蛋白一致(圖4)。

2.3 間接ELISA條件優(yōu)化

2.3.1 抗原包被濃度和血清稀釋比

按常規(guī)ELISA方法進(jìn)行方陣滴定實(shí)驗(yàn)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)其OD450nm。結(jié)果顯示，抗原E0包被量為5μg/mL、血清稀釋比為 1∶10時(shí)，陽(yáng)性血清OD450nm接近1.0，陰性血清值最小，且P/N的值最大，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 抗原包被濃度和血清稀釋比測(cè)定Tab.1 The concentration of antigen and serum dilution ratio were determined

2.3.2 最佳封閉液和封閉時(shí)間的確定

分別以5%脫脂奶粉、2%牛血清白蛋白（BSA）、1%明膠作為封閉液，加入微孔板中，100 μg/mL，37℃恒溫箱孵育2 h。

表2 封閉液的確定Tab.2 Determination of optional blocking solution

表3 封閉時(shí)間的確定Tab.3 Determination for blocking time

2.3.4 酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)及作用時(shí)間

將HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)為 1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、1∶10000，每孔 100 μL，37℃恒溫箱孵育 0.5、1.0、1.5 和 2 h。按常規(guī)ELISA方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，酶標(biāo)二抗稀釋比為1∶8000，且孵育時(shí)間為30min時(shí)結(jié)果最佳，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表4 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定Tab.4 Determination for optimum rabbit anti-mouse IgG/HRP concentration

表5 酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間的選擇Tab.5 The optimized incubation period of the labeled antibody

2.3.5 臨界值的確定

經(jīng)血凝試驗(yàn)檢測(cè)均為牛病毒性腹瀉病毒陰性的30份血清，測(cè)定其OD450nm值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算得到30份陰性血清OD450nm值平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(S)分別為0.2215和0.033，那么樣品臨界值X+2S為0.278，結(jié)果如表6所示。

表6 間接 ELISA陰陽(yáng)性臨界值的確定Tab.6 Determination of the threshold for ELISA

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

用該方法建立的間接ELISA檢測(cè)牛常見(jiàn)病毒和細(xì)菌，結(jié)果顯示該方法具有良好的特異性，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 ELISA特異性試驗(yàn)結(jié)果Tab.7 Result of specific test for indirect ELISA

2.5 靈敏性實(shí)驗(yàn)

用本文已建立的間接ELISA檢測(cè)7個(gè)稀釋度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清稀釋比為1∶1600時(shí)，仍檢測(cè)為陽(yáng)性（表8），說(shuō)明該間接ELISA方法具有較好的靈敏性。

表8 間接 ELISA敏感性試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Result of indirect ELISA sensitivity test

2.6 商品化試劑盒的比較

用間接ELISA和IDEXX試劑盒檢測(cè)88份臨床血清，結(jié)果顯示2種方法的符合率為86%。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表9。檢測(cè)結(jié)果用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對(duì)四格表卡方檢驗(yàn)，計(jì)算得到P=0.064>0.05，無(wú)顯著性差異。

表9 血清樣品的間接ELISA與IDEXX試劑盒檢測(cè)方法比較Tab.9 The comparision of serum detection by indirect ELISA and IDEXX

3 討論

BVDV是單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科瘟病毒屬[9]。自從1946年第一次在北美牛體中分離出BVDV以來(lái)[11]，在其病毒學(xué)、流行病學(xué)和病理學(xué)特征上已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，使BVDV成為全世界最重要的牛病毒病原體之一[12]。根據(jù)國(guó)家相關(guān)規(guī)定BVDV的檢查方法均為細(xì)胞培養(yǎng)法和免疫熒光抗體檢查法[13]，但該方法過(guò)程較繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果滯后；并且血樣中如果有抗體存在就會(huì)大大降低病毒的檢出率，導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)，不利于生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制。在大多數(shù)情況下，ELISA檢測(cè)方法卻得到了廣泛的推廣。

ELISA檢測(cè)法作為經(jīng)典的血清學(xué)檢測(cè)方法[14]，在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用。自20世紀(jì)90年代初以來(lái)，市面上已有一些用于檢測(cè)BVDV特異性抗體的ELISA試劑盒。這種方法之所以被廣泛應(yīng)用，其原因?yàn)椋核鼈儶?dú)立于細(xì)胞培養(yǎng)，可較容易地應(yīng)用于大規(guī)模快速檢測(cè)[15]。此法簡(jiǎn)單快速，且特異性良好，但鑒于制備特異性抗原困難，并且假陽(yáng)性、假陰性問(wèn)題的存在，使本方法在實(shí)際應(yīng)用上受到限制。

BVDV國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)試劑盒基本上被國(guó)外公司壟斷，價(jià)格昂貴，購(gòu)買(mǎi)周期太長(zhǎng)，不適用于中小型養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)戶。因此，有必要建立一種良好的ELISA方法為國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒做技術(shù)儲(chǔ)備。新疆是我國(guó)主要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地，也是該病流行的主要地區(qū)之一。研制出一種適用于新疆本地流行株的檢測(cè)方法對(duì)新疆的養(yǎng)殖業(yè)至關(guān)重要。另外，在BVDV結(jié)構(gòu)蛋白中E0是保守性很高的蛋白，在不同的毒株中變異系數(shù)很低[16]，更適合做為包被抗原。

本研究中成功獲得特異性抗原E0，并以此為基礎(chǔ)建立了間接ELISA方法。用建立的間接ELISA和IDEXX試劑盒對(duì)在克拉瑪依地區(qū)采集的88份牛血清進(jìn)行檢測(cè)，二者符合率為86%，用四格表卡方檢驗(yàn)分析，P=0.064>0.05，2種方法無(wú)顯著性差異，該方法的建立基本可以用于實(shí)驗(yàn)室臨床檢測(cè)。但就目前的技術(shù)水平，較高的BVDV抗體陽(yáng)性率僅代表牛群中血清抗體陽(yáng)性率的高低，不能準(zhǔn)確反應(yīng)牛群對(duì)該病的免疫保護(hù)率，其原因可能是牛群正處于疾病感染階段，另外，血清抗體為陰性的也可能是持續(xù)性感染的牛，需結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)進(jìn)行分析判斷。

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