加米拉·吐爾遜，陳云蕾，吾熱力哈孜·哈孜汗，馬亞茹，賽務(wù)加甫

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子832003）

哺乳動(dòng)物精子受精前需要在雌性生殖道內(nèi)停留一段時(shí)間，期間精子的形態(tài)和生理會(huì)發(fā)生必要的變化[1-3]，這樣精子就會(huì)具備受精所需的能力，這個(gè)過(guò)程稱之為獲能。獲能后的精子的代謝加強(qiáng)，主要表現(xiàn)包括活力增強(qiáng)，呼吸率增高、耗氧量增多以及尾部線粒體內(nèi)氧化磷酸酶功能旺盛等[4-6]。

研究發(fā)現(xiàn)該過(guò)程參與的并發(fā)揮作用的基因編碼蛋白數(shù)量約為1000種[7-11]，只有保證需要相關(guān)蛋白分子的適時(shí)表達(dá)，才能夠使精子結(jié)構(gòu)完整，并且可以將正確的基因和表觀遺傳信息傳給子代[12]。精子及時(shí)獲能和產(chǎn)生頂體反應(yīng)在自然受精過(guò)程中很重要，同樣維持精子在受精前未獲能狀態(tài)也非常關(guān)鍵。PLCζ在生殖發(fā)育中意義重大，其對(duì)精子的發(fā)生發(fā)育及卵母細(xì)胞激活等相關(guān)研究已成為生殖發(fā)育的研究熱點(diǎn)[13-14]。

家畜中的不孕癥一直都是比較重大的疾病之一[15]。PLCζ家族中的睪丸發(fā)育特異性蛋白-27基因(testis development specific protein gene 27，NYD-SP27)，被認(rèn)為是一種新的精子內(nèi)源性去能因子，在家畜的不孕癥方面起到非常大的作用[16]，但目前NYD-SP27在綿羊精子獲能中的作用未見相關(guān)報(bào)道。本研究在克隆新疆哈薩克羊NYD-SP27基因并在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行序列分析，旨在為NYD-SP27基因表達(dá)調(diào)控研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為揭示NYD-SP27在綿羊精子發(fā)生及獲能中的作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及動(dòng)物組織

克隆載體pMD19-T及DH5α感受態(tài)細(xì)胞由新疆兵團(tuán)動(dòng)物重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，綿羊睪丸組織采自石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院。挑選2周歲健康哈薩克公羊，屠宰并取出睪丸組織，將其裝入病料袋。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根科技有限公司；Transzol up RNA提取試劑盒、離心TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金公司；ExTaqDNA聚合酶，DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)，T4 DNA 連接酶、PrimeScript RT reagent Kit、RNA酶抑制劑、TaKaRa MiniBESTTMDNA Fragment Purification Kit Ver.4.0等均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

微量移液器 (Eppendorf公司)、超凈工作臺(tái)(ZHJH-1112)、水浴鍋(DKB-501A)、搖床(HZQ-X100)、超速離心機(jī) (eppendorf，centrifuge-5415D)；去離子水機(jī)、NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)、勻漿機(jī)（QIZGEN、Tissuelyser II）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中人NYD-SP27序列（登錄號(hào)：AY035866.1），利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物NYD-F和NYD-R，擴(kuò)增該基因完整的ORF區(qū)。比對(duì)分析后獲得綿羊NYD-SP27基因序列，將該序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)：KX905090)，根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)合成引物P2A-Flag-NYDSP-F和P2A-Flag-NYD SP-R。以上引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)中所需引物Tab.1 primers used in the study

1.2.2 總RNA的提取

先將采集的綿羊睪丸組織剪成小塊分裝在2 mL凍存管中，保存于液氮中待用；然后迅速稱量取出約500mg組織塊，置于DEPC水泡過(guò)的研缽中，多次加入適量液氮迅速進(jìn)行研磨直至研磨成粉末狀，之后將其轉(zhuǎn)移至1.5mL的無(wú)RNase離心管中，加入1 mL的Transzol up并按照總RNA提取試劑盒抽提睪丸組織總RNA，最后用NanoDrop 2000測(cè)定濃度并置于-80℃，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA制備

將 RNA 模板、5×PrimeScript Buffer、PrimeScript RT Enzyme Mix I、Oligo dT Primer、Random 6 mers和RNase Free dH2O置于冰上溶解后，將RNA模板量定為1 μg，總體積為20 μL，按照既定的合成體系（表2）加樣混合，并根據(jù)產(chǎn)品使用說(shuō)明書中的操作步驟，用PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：37℃ 條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)5min，85℃ 條件下持續(xù)8 s使反轉(zhuǎn)錄酶失活，瞬時(shí)離心，置于冰上冷卻后置于-20℃保存，備用。

表2 cDNA合成反應(yīng)體系Tab.2 Reaction system of synthetising cDNA

1.2.4 哈薩克羊NYD-SP27的PCR擴(kuò)增和純化

1.2.4.1 目標(biāo)基因的擴(kuò)增

由于真核生物基因中自身含有內(nèi)含子，故采用RT-PCR法克隆目的片段。以反轉(zhuǎn)錄的睪丸組織cDNA作為模版，采用所設(shè)計(jì)的特異性引物，使用TransStart FastPfu Fly高保真酶擴(kuò)增綿羊NYD-SP27基因，擴(kuò)增體系為25 μL，其中 2×Mix 12.5 μL、cDNA 2 μL、上下游引物(100 μmol/L)各 2 μL、補(bǔ)充去離子水至25 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5min；94℃40 s；61 ℃ 40 s；72 ℃ 2 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

1.2.4.2 目標(biāo)基因的純化及末端加A

將擴(kuò)增的目的基因取出2 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如果檢測(cè)有特異性條帶，則將剩余的擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)Takara MiniBEST DNA Fragment Purification Kit說(shuō)明書進(jìn)行純化。目標(biāo)基因純化后，為了增加連接效率需末端加A。按照以下體系混合樣品：將純化后的目的基因片段 30 μL，TaqDNA聚 合 酶 1 μL，dNTP 3 μL，Buffer 3 μL，ddH2O 13 μL。將混合好的樣品放入PCR儀中，設(shè)置程序?yàn)?2℃ 20min。

1.2.4.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

將加A后的目的片段，加入10 μL的Loading Buffer，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。若檢測(cè)有大小合適的目標(biāo)條帶，進(jìn)一步從凝膠中切下目的DNA條帶，切膠時(shí)要迅速并且切的盡量薄，放入無(wú)菌的離心管中，進(jìn)行回收純化。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定

把RT-PCR產(chǎn)物切膠回收后，依據(jù)PCR膠回收純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行對(duì)目的基因的回收純化試驗(yàn)。將回收純化的目的基因片段與pMDl8-T載體按照說(shuō)明書要求和條件進(jìn)行充分混勻，待混勻后密封避光于16℃水浴鍋中進(jìn)行連接反應(yīng)，待連接反應(yīng)12 h后，將連接產(chǎn)物按照說(shuō)明書和實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。將轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞中的連接產(chǎn)物，于含抗生素的固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-16 h，后觀察平板菌落，根據(jù)需要篩選單個(gè)、大小合適的陽(yáng)性克隆菌落。為了保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性以及實(shí)驗(yàn)所要求的嚴(yán)謹(jǐn)性，還需對(duì)克隆的菌株進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并對(duì)克隆菌落采用菌液PCR和酶切等方法鑒定，最后將初步鑒定正確的菌株或者質(zhì)粒送至上海生工進(jìn)行序列檢測(cè)，最終確保結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和真實(shí)性。

1.2.6 序列測(cè)定及分析

將鑒定為陽(yáng)性的克隆株由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行 DNA測(cè)序。利用 DNAman、DNAStar、Chromas等軟件，將所得到的cDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中近緣物種NYD-SP27基因序列進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的分離

所分離總RNA A260／A280為1.9，瓊脂糖凝膠電泳后清晰可見18S和28S 2條核糖體RNA條帶(圖1)，說(shuō)明睪丸組織總RNA提取過(guò)程中未發(fā)生降解。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose electrophoresisof total RNA

2.2 哈薩克羊NYD-SP27基因編碼區(qū)的克隆

提取的哈薩克羊睪丸組織中的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA（圖1）的完整性，并且測(cè)定A260/A280為1.89。將總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，以cDNA為模板，以特異性引物擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、末端加A后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析，出現(xiàn)特異性條帶（圖2），條帶大小為1000-2000 bp。

圖2 哈薩克羊NYD-SP27基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of ovine NYD-SP27 gene

2.3 哈薩克羊NYD-SP27基因序列分析結(jié)果

將通過(guò)高保真酶擴(kuò)增的目的基因，與pMD19-T連接后，挑選大量的單克隆菌落，進(jìn)行PCR驗(yàn)證（圖3），大量測(cè)序，通過(guò)分析比對(duì)，獲取哈薩克羊該基因的序列。確認(rèn)無(wú)誤后，向NCBI提交該基因序列（登錄號(hào)：KX905090）。在 NCBI上對(duì)綿羊 NYD-SP27基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)哈薩克羊NYD-SP27基因的保守結(jié)構(gòu)域(圖4)和人類的NYD-SP27(登錄號(hào)：AY035866)一致，均含有2個(gè)EF結(jié)構(gòu)域，1個(gè)PI-PLC結(jié)構(gòu)域(圖5)。1個(gè)C2結(jié)構(gòu)域。NYD-SP27保守結(jié)構(gòu)域與人源的PLCZ1的保守結(jié)構(gòu)域(圖6)分析后發(fā)現(xiàn)缺少1個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過(guò)分析，哈薩克羊NYD-SP27基因?qū)儆赑LCζ家族，基因全長(zhǎng)1901 bp，其中只含有1617 bp組成的開放閱讀框(ORF)，其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG，共編碼538個(gè)氨基酸(圖 7)；相對(duì)分子質(zhì)量 61995.66，理論 PI值為6.16，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為 61，負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為 67；分子式 C2798H4319N737O819S19；體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)46.96（不穩(wěn)定）；總平均吸水性-0.403。

圖3 單克隆菌株菌液PCR驗(yàn)證Fig.3 Detection of monoclonal strains by PCR

圖4 哈薩克羊NYD-SP27保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Conserved domain of ovine NYD-SP27

圖5 人源NYD-SP27保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 Conserved domain of human NYD-SP27

圖6 人源PLCZ1保守結(jié)構(gòu)域Fig.6 Conserved domain of human PLCZ1

3 討論

本研究用高保真酶擴(kuò)增哈薩克羊NYD-SP27基因，確保其擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性，之后通過(guò)對(duì)新疆多個(gè)樣品的測(cè)序分析，獲得其完整的編碼序列，對(duì)哈薩克羊NYD-SP27基因的保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)哈薩克羊NYD-SP27和人類的NYD-SP27結(jié)構(gòu)域類似。以往的研究發(fā)現(xiàn)人和小鼠的NYD-SP27基因與PLCZ1相比缺少N端的EF手型結(jié)構(gòu)域，EF手型結(jié)構(gòu)域是Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，缺少后會(huì)造成結(jié)合Ca2+能力下降，之前人們對(duì)綿羊PLCζ的功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它能夠引起卵母細(xì)胞內(nèi)Ca2+震蕩，從而激活卵母細(xì)胞。這些結(jié)構(gòu)上的差異可能是造成NYD-SP27基因與PLCζ功能的不同所在，也可能是其抑制PLC的原因。

相關(guān)的研究報(bào)道指出一種磷脂酶C的亞型NYD-SP27是一種內(nèi)源性的去能因子，研究證實(shí)其在胰腺中發(fā)揮抑制PLC偶聯(lián)的Ca2+的動(dòng)員作用，其后的研究中還證明抑制NYD-SP27的表達(dá)可導(dǎo)致ATP刺激的Ca2+依賴性胰腺陰離子分泌的增強(qiáng)[16]。研究發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于精子的頂體部，能夠在獲能和頂體反應(yīng)的過(guò)程中逐漸的丟失。從獲能培養(yǎng)液中去除HCO-3獲能活化因子，可使NYD-SP27不再丟失，同樣NYD-SP27的特異性抗體也會(huì)抑制NYD-SP27的丟失并能夠顯著的降低ATP和孕酮誘導(dǎo)的獲能和頂體反應(yīng)的精子的數(shù)量，同時(shí)還能夠抑制精子內(nèi)的激動(dòng)劑誘導(dǎo)的PLC偶聯(lián)的鈣離子動(dòng)員[17]，而這些結(jié)果與PLC抑制劑的作用相似。由此，我們可以推測(cè)出PLC生理性的抑制劑NYD-SP27，作為精子內(nèi)源性的去能因子防止獲能和頂體反應(yīng)的提前發(fā)生。

圖7 新疆哈薩克羊NYD-SP27基因cDNA序列以及推倒的氨基酸序列Fig.7 cDNA sequence and amino acid sequence of NYD-SP27 gene in Xinjiang Kazakh sheep

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