(.四川省自然資源科學(xué)研究院,四川 成都 6004;.四川農(nóng)業(yè)大學(xué),四川 成都 630)

礦產(chǎn)資源是國民經(jīng)濟(jì)的重要支柱,但礦產(chǎn)資源的開采會造成礦區(qū)土壤的嚴(yán)重破壞。據(jù)報道,我國采礦業(yè)形成的礦山、排土場、尾礦庫等導(dǎo)致約400萬hm2的土地受到破壞,并且以每年4萬hm2左右的速度增加[1]。近年來,盡管我國礦山治理取得了較大的進(jìn)展,廢棄地復(fù)墾系數(shù)已達(dá)到12%,但與發(fā)達(dá)國家100%的復(fù)墾率相比,仍存在著很大的差距,我國的礦山廢棄地復(fù)墾任重道遠(yuǎn)[2]。在礦區(qū)土壤復(fù)墾中，面臨較嚴(yán)重的問題是礦區(qū)土壤十分貧瘠。通過對礦區(qū)具有促進(jìn)植物生長的細(xì)菌篩選,篩選出具有解磷、解鉀等作用的細(xì)菌,且從礦區(qū)土壤中分離出的土著細(xì)菌具有抗重金屬脅迫的能力。通過該類細(xì)菌對高濃度重金屬耐受程度的測定,可進(jìn)一步篩選出既具有促生作用又能耐受礦區(qū)高含量重金屬的細(xì)菌菌株,為礦區(qū)污染土壤修復(fù)提供寶貴的微生物資源,也為增加土壤肥力的微生物菌種開發(fā)提供必要的條件。

攀枝花位于四川省西南部,是我國重要的釩鈦鋼鐵基地。攀枝花地區(qū)礦產(chǎn)資源豐富,已發(fā)現(xiàn)76種礦產(chǎn),潛在儲量在300億t以上,其中釩鈦磁鐵礦儲量96.6億t,鈦儲量占世界鈦總量的35.2%，為世界之最[3]。經(jīng)過幾十年的開采,攀枝花形成的廢礦區(qū)面積高達(dá)2724.93hm2,造成土地質(zhì)量和土壤承載能力大大降低,土壤酸化，重金屬污染，有機(jī)質(zhì)和氮、磷含量較低,持水能力差,土壤生態(tài)系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞[4]。當(dāng)?shù)卣e極采取措施治理工礦廢棄地,開始對廢棄礦地進(jìn)行退建復(fù)耕或還林還草,取得了一定的成效,2012年攀枝花成為我國工礦廢棄地復(fù)墾利用試點(diǎn)城市[5]?？傮w看,攀枝花廢棄礦區(qū)環(huán)境污染和生態(tài)破壞的局面未得到根本改觀[6]。尾礦是礦石經(jīng)選別出精礦后剩余的固體廢料,尾礦量大,侵占了大量土地資源,嚴(yán)重破壞了當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境[7]。尾礦中各種殘留成分對環(huán)境造成了嚴(yán)重破壞,部分篩選藥劑也有可能對生態(tài)環(huán)境造成不可逆的損害。如鐵礦、磷礦等尾礦中含有大量重金屬,隨著這些重金屬排放到土壤和河湖水體,將會嚴(yán)重破壞人類賴以生存的環(huán)境,同時重金屬會進(jìn)入人們的食物鏈,對人體造成嚴(yán)重的影響[8,9]。因此,為了減小礦業(yè)開采對生態(tài)環(huán)境的破壞,應(yīng)加強(qiáng)尾礦庫土地復(fù)墾和礦區(qū)土壤修復(fù),這是礦業(yè)持續(xù)發(fā)展有待解決的主要問題之一[10]。

目前,攀枝花礦區(qū)土壤復(fù)墾面臨的難題是復(fù)墾區(qū)的土壤貧瘠問題。由于尾礦區(qū)土壤營養(yǎng)成分缺乏,很多復(fù)耕植物生長差,急需提高土壤肥力以促進(jìn)復(fù)耕植物生長。磷元素是植物生長必需的三大主要元素之一,是生物體內(nèi)核酸和磷脂的重要組分,也是生物膜、原生質(zhì)和細(xì)胞核的組成成分之一[11]。我國大部分地區(qū)土壤中的含磷量平均僅為0.12%,土壤溶液中的濃度一般在0.005—1.0mg/kg,總磷含量雖然豐富但有效磷匱乏是磷元素的主要特征,可溶性磷含量較低不易被植物吸收利用,施入土壤的磷肥利用率僅為5%—25%[12]。土壤中磷元素含量較高,但大多是以難溶于水的復(fù)雜化合物,植物吸收這些大分子含磷化合物較困難。大分子含磷化合物在微生物尤其是在細(xì)菌的作用下,將不溶于水的含磷化合物分解為可溶性化合物,是解決土壤缺磷的主要途徑。微生物代謝產(chǎn)生的植酸酶、核酸酶和磷酸酶等可加速含磷有機(jī)化合物分解,極大地改善了植物的磷素營養(yǎng)狀況,可在不增加化學(xué)磷肥的狀況下提高土壤磷元素含量[12-15]。通過篩選開發(fā)具有溶磷效應(yīng)的微生物菌劑,改善礦區(qū)尾礦復(fù)耕區(qū)的有效磷含量是提高尾礦復(fù)耕率的重要措施之一[16]。在實(shí)際應(yīng)用中,特別是在尾礦修復(fù)中,尾礦中的重金屬含量和其他有害藥劑超標(biāo),很多具有促進(jìn)解磷溶磷效果的菌劑很難在重金屬含量較高的尾礦庫土壤中生長,溶磷作用受到嚴(yán)重抑制。本研究以尾礦庫土壤為研究對象,從中篩選出兼具溶磷效果和抗重金屬脅迫的細(xì)菌菌種。由于該細(xì)菌對生長環(huán)境的自然選擇,本身具有很好的抗重金屬能力,可結(jié)合兩種功效,促進(jìn)尾礦區(qū)復(fù)耕。

目前,對微生物參與難溶態(tài)磷素利用的研究多在芽孢桿菌,其次主要在真菌和放線菌等方面[17,18]。溶磷細(xì)菌主要包含以下類別:芽胞桿菌(Bacillus)、歐文氏菌(Erwinia)、假單胞桿菌(Pseudomonas)、土壤桿菌(Agrobacterium)、沙雷氏菌(Serratia)、黃桿菌(Flarobacterium)、腸細(xì)菌(Enterbacter)、微球菌(Micricoccus)、固氮菌(Azotobacter)、根瘤菌(Rhizobium)、沙門氏菌(Salmonella)、色桿菌(Chromobacterium)、產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)、節(jié)細(xì)菌(Arthrobacter)、硫桿菌(Thiobacillus)、埃希氏菌(Escherichia)[19];解磷真菌在數(shù)量上遠(yuǎn)低于解磷細(xì)菌,主要分布在曲霉(Spergillus)、青霉(Penicillium)、鐮刀菌(Fusarium)、小絲核菌(Sclerotium)等屬種。在解磷微生物種中,不同種類的微生物不但解磷能力差異大,且解磷機(jī)理也不盡相同[20]。多數(shù)研究認(rèn)為,解磷菌的解磷作用是微生物的次生代謝產(chǎn)物導(dǎo)致含磷化合物的可溶性改變,微生物產(chǎn)生的有機(jī)酸對含磷化合物的可溶性提高起到了關(guān)鍵作用,微生物改變了土壤中的pH,最終導(dǎo)致磷酸鹽的可溶性變化[18,21,22]。

本研究從攀枝花釩鈦磁鐵尾礦土中分離篩選到具有較好溶磷效果的細(xì)菌菌株,運(yùn)用分子方法鑒定出細(xì)菌的種屬,并在室內(nèi)條件下初步研究了溶磷能力和菌株生長量[20]。然后在重金屬脅迫下測定解磷菌株,分析對重金屬的耐受性和在重金屬脅迫下解磷菌的溶磷效果,得出重金屬鎘對解磷菌株的抑制濃度和致死濃度。最后篩選和構(gòu)建高效解磷菌株,為利用解磷菌提高尾礦磷素利用效率提供理論依據(jù),也為尾礦土壤的生物修復(fù)和尾礦堆積物的復(fù)墾提供可利用的解磷菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

解磷細(xì)菌:本研究的土壤細(xì)菌主要來源于攀枝花朱家包包礦區(qū)的廢礦土壤。

培養(yǎng)基與試劑:①(PKO)無機(jī)磷固體培養(yǎng)基。葡萄糖10g、磷酸鈣5g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.2g、MgSO40.03g、MnSO40.03g、FeSO40.003g、瓊脂18g、KCl 0.2g、去離子水1L、pH6.8—7.0。②PKO液體培養(yǎng)基。葡萄糖10g、磷酸鈣5g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.2g、MgSO40.03g、MnSO40.03g、FeSO40.003g、KCl 0.2g、去離子水1L、pH7.2[23]。③TY培養(yǎng)基。葡萄糖10.0g、NaC l5.0g、蛋白胨2.0g、酵母膏5.0g、pH7.2。④鉬銻抗試劑。稱取酒石酸銻鉀(KSbOC4H4O6)0.9g,緩慢溶于100mL水中,制成5%的溶液。稱取鉬酸銨20g溶于雙蒸水450mL,緩慢加入208.3mL(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%)濃硫酸,同時用玻棒攪動散熱,再將0.5%的酒石酸銻鉀100mL加入到鉬酸銨液中,定容至1L,充分搖勻,貯于棕色瓶中避光保存[24]。

1.2 方法

礦土樣采集:將攀枝花朱家包包廢礦區(qū)作為具體測試點(diǎn),隨機(jī)選擇三個采樣區(qū)域(廢礦區(qū)Ⅰ、廢礦區(qū)Ⅱ、廢礦區(qū)Ⅲ),每個區(qū)域間距根據(jù)廢礦區(qū)具體情況而定(間距相同),包括廢礦新區(qū)、老區(qū)和尾礦區(qū),做好登記;每個采礦區(qū)域選取5點(diǎn)(梅花型布點(diǎn)),兩點(diǎn)之間至少相距5m(圖1),采集0—30cm土層樣品,混合后四分法分取并裝入無菌聚乙烯塑料袋中,運(yùn)回學(xué)校實(shí)驗(yàn)室做下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 廢礦區(qū)采集樣點(diǎn)分布

尾礦土壤細(xì)菌的分離與純化:尾礦土壤細(xì)菌的分離主要采用稀釋平板涂布法。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備裝有9mL無菌水的試管24支、滅菌移液管7支、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板12個、無菌培養(yǎng)皿9個、尾礦土壤土樣5.0g;將土樣加入5mL無菌水的三角瓶,搖30min混均勻,再用移液槍吸取1mL加入9mL無菌水的試管,逐一稀釋,細(xì)菌分別稀釋到10-6、10-5、10-4;另吸取150μL不同濃度的稀釋液用涂布棒在牛肉膏培養(yǎng)基上涂布均勻,每個做3個重復(fù),置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天,挑選出不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行劃線純化,做革蘭氏染色后鏡檢,菌株形態(tài)單一的視為獲得純化菌株,然后在牛肉膏斜面(4℃)和甘油管(-80℃)中保種。

解磷細(xì)菌定性分析:采用PKO平板培養(yǎng)法,每個平板采用點(diǎn)接法,每株菌株接3個平板,28℃培養(yǎng)7天。同時，觀察并測量菌落直徑大小以及其周圍透明圈的大小,根據(jù)透明圈評判該菌株是否具有溶磷作用。

解磷細(xì)菌定量分析:將30mL液體PKO置入50mL的三角瓶中,121℃滅菌30 min,按1%接種量在30mL液體PKO培養(yǎng)基中接入各供試菌株種子液,每株菌3個重復(fù),并在同樣的PKO液體培養(yǎng)基中接入等量無菌水作為對照。在28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)7天后,取出培養(yǎng)液8000 r/min離心10min,稀釋上清液后用鉬銻抗比色法測定培養(yǎng)液中的有效磷。

解磷菌株的產(chǎn)量確定分析:配制1L的PKO液體培養(yǎng)基,每支試管分裝5mL,滅菌后冷卻至室溫,按照1%的接種量接種,每株菌株3個重復(fù)。對照CK為相同的PKO液體培養(yǎng)基中接種入等量無菌水。接種完成后置入溫度28℃、轉(zhuǎn)速150r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng),分別培養(yǎng)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天,再分別在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天取出培養(yǎng)液,在轉(zhuǎn)速8000r/min離心機(jī)中離心5min,取上清液,用鉬銻抗比色法在波長660nm下比色,測定培養(yǎng)液的磷含量,最后確定解磷細(xì)菌解磷產(chǎn)量最高的一天,并篩選出磷含量最高的菌株進(jìn)行下一步研究。

基因組DNA的提取:將篩選出解磷效果較好的菌株進(jìn)行DNA提取,采用GUTC法(異硫氰酸胍),操作步驟見圖2。

圖2 GUTC法提取細(xì)菌總DNA流程

解磷菌株16S rRNA擴(kuò)增與測序:以總DNA為模板,選用引物27F和1492R擴(kuò)增16S rRNA[25],引物序列為:

圖3擴(kuò)增程序

反應(yīng)體系(25μL):2×PCR Mix 12.5μL;27F(10pmol)0.15μL;1492R(10pmol)0.15μL;模板DNA(50ng/ml)1μL;雙蒸水補(bǔ)足至25μL,石蠟油1滴覆蓋。擴(kuò)增程序見圖3。

16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴(kuò)增片段長度為1.5Kb,檢測后送上海生工基因公司測序。然后,將16S rRNA序列在GeneBank中進(jìn)行Blast分析以確定其同源性，并將16S rRNA序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以分析尾礦土壤中解磷菌株的多樣性。

解磷細(xì)菌對重金屬鎘的耐受性分析:將濃度為5×10-5mol/L的Cd2+按照一定的含量梯度加入優(yōu)勢菌株的TY溶液中,每株菌株3個重復(fù)。以接種到不含重金屬TY液體培養(yǎng)基作為CK。在28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)1天后取出,取一定量的菌液用分光光度計(jì)(波長660nm)測定,進(jìn)行OD值與空白對照比較,確定重金屬鎘抑制濃度和致死濃度。

重金屬鎘對解磷細(xì)菌的影響分析:每支試管裝入5mLPKO液體培養(yǎng)基,121℃滅菌30min,冷卻至室溫,在無菌工作臺上進(jìn)行接種,分別接入濃度為5×10-5mol/L的Cd2+,接入量依次為0、2.5μL、5.0μL、7.5μL、10μL、12.5μL、15μL、17.5μL、20μL、22.5μL、25μL,將篩選出優(yōu)勢細(xì)菌分別接入試管內(nèi);按1%接種量置入5mLTY液體培養(yǎng)基中,再置入各供試菌株種子液,每株菌3個重復(fù),以同樣在TY液體培養(yǎng)基中接入等量無菌水作為CK。接種完成后放入28℃、150 r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)3天后,取培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)速8000r/min離心機(jī)里離心5min,然后取上清液用鉬銻抗比色法在分光光度計(jì)(波長660nm)下比色,測定磷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 尾礦土壤細(xì)菌分離結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用稀釋平板涂布法從攀枝花朱家包包廢礦土壤中分離出純化細(xì)菌,在挑選單菌落時主要根據(jù)菌落形態(tài)的大小、顏色、形狀等挑選不同菌落特征的菌株136個。在純化過程中利用顯微鏡觀察菌體形態(tài),其中大部分細(xì)菌為革蘭氏陽性細(xì)菌,菌體形態(tài)為桿狀。

表1 解磷細(xì)菌定性篩選結(jié)果

2.2 解磷細(xì)菌的篩選結(jié)果

解磷細(xì)菌的初篩結(jié)果:對136株尾礦土壤細(xì)菌菌株進(jìn)行初篩后得到4株菌株具有解磷效果,其溶磷圈直徑見表1。從表1可見,分別為WDGJ-20、WDN-5、KX-2、BDGJ-15菌株。

解磷細(xì)菌定量時間測試分析:將篩選出的4株優(yōu)勢解磷菌株進(jìn)行解磷定量測試,通過7個不同時間點(diǎn)取樣測試,評估得到不同時間點(diǎn)的解磷效果:4株優(yōu)勢細(xì)菌在第5天時的解磷效果最明顯,其中WDN-5比其他3株菌的溶磷量高(圖4)。

圖4 不同培養(yǎng)時間下解磷菌的溶磷量

2.3 解磷細(xì)菌分子鑒定

我們將篩選出的4株解磷菌株進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴(kuò)增條帶約1400bp,PCR產(chǎn)物送交測序公司進(jìn)行測序。對4株解磷菌株的16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對,分析溶磷效果較好的4株解磷菌株的同源性與種屬均屬于Bacillus屬(表2)。其中,WDN-5為效果最好的1株解磷菌,將WDN-5 16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結(jié)果顯示，與標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus subtillis GU086413在同一個分支上,且相似度為99%,說明屬于Bacillus subtillis。

表2 解磷菌株16sRNA基因測序及同源性分析

2.4 重金屬鎘脅迫下解磷細(xì)菌解磷能力測定

解磷細(xì)菌對重金屬鎘的耐受性分析:通過在解磷菌優(yōu)勢菌株WDN-5培養(yǎng)液中加入不同含量的重金屬鎘,以不加重金屬鎘的優(yōu)勢菌株WDN-5培養(yǎng)液為對照CK,在28℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)1d后取出,取約2mL的培養(yǎng)液經(jīng)過分光光度計(jì)測定,測定出空白對照CK的OD值為0.307。從圖6可知,致死濃度為300mg/L,所以選取0—300 mg/L作為培養(yǎng)濃度進(jìn)行重金屬鎘脅迫試驗(yàn)。

重金屬鎘脅迫下的解磷菌解磷能力測定:根據(jù)解磷細(xì)菌對鎘的耐受性分析,耐受性選取0—300mg/L作為培養(yǎng)含量進(jìn)行重金屬鎘脅迫試驗(yàn)。通過設(shè)計(jì)鎘的不同含量梯度重金屬脅迫實(shí)驗(yàn),用鉬銻抗比色法測定磷含量。WDN-5菌株在重金屬鎘0—300 mg/L濃度之間隨著濃度逐漸增加對其解磷能力逐漸減少(圖7)。

圖5 WDN-5的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 鎘對WDN-5抑制濃度和致死濃度

圖7 鎘脅迫下WDN-5的解磷作用

3 結(jié)論與討論

本研究將具有解磷作用的菌株接種到含有難溶性磷酸鹽的固體培養(yǎng)基上,在適宜的溫度條件下培養(yǎng),通過測定菌落周圍產(chǎn)生的透明圈的直徑大小來判定該微生物溶磷能力。

本研究通過從尾礦土中分離篩選微生物,經(jīng)過在PKO平板上28℃培養(yǎng)7天后,初步篩選出的4株細(xì)菌透明圈直徑均超過了2cm,這些透明圈表明該細(xì)菌具有很好的解磷溶磷作用。溶磷暈圈直徑的大小可定性地反映細(xì)菌的溶磷磷能力,而要定量評價菌株的解磷能力,則需要通過溶磷時間分析實(shí)驗(yàn)確定。通過溶磷定量時間分析,本研究篩選出溶磷效果最好的WDN-5菌株在培養(yǎng)后第5天的效磷含量為77.14μg/mL,在上清液中的溶磷量達(dá)到71.92μg/mL。本研究分離得到的WDN-5為芽孢桿菌,培養(yǎng)第5天后的溶磷作用達(dá)到77.14μg/mL,具有較好的溶磷效果。此外,本研究是從礦土分離得到細(xì)菌,其生活的環(huán)境決定了自身具有很好的抗逆性和抗重金屬脅迫性。通過后續(xù)的研究表明,WDN-5在較高重金屬鎘的脅迫下具有解磷效應(yīng),可更好地應(yīng)用到重金屬超標(biāo)的尾礦庫中和較高重金屬含量的農(nóng)田中,應(yīng)用前景廣闊。

高濃度的重金屬是礦區(qū)土壤生物修復(fù)過程中最重要的限制性因素,Cu、Cd、Pb、Cr對芽孢桿菌有明顯的抑制作用,其中以大芽孢桿菌更為敏感。因此,需要篩選一些具有較強(qiáng)的能夠的優(yōu)勢菌株作為菌劑使用,為尾礦土壤的生物修復(fù)和尾礦堆積庫的復(fù)墾提供可利用的解磷菌株資源。本研究從釩鈦磁鐵礦區(qū)表層土壤中所篩選到的解磷細(xì)菌WDN-5,除了具有很強(qiáng)的解磷能力外,對鎘的耐受性也很好,雖然它不能直接富集重金屬,但可作為尾礦庫的植物修復(fù)提供必要的條件。

通過測定在含有重金屬鎘的培養(yǎng)基中解磷細(xì)菌WDN-5解磷能力的變化情況,表明該細(xì)菌的溶磷作用會隨著重金屬濃度的增高而降低,WND-5對鎘的致死濃度為300 mg/L;在50—300 mg/L的鎘脅迫下,隨著鎘濃度的增加,WDN-5的溶磷量逐漸降低。本研究開發(fā)的細(xì)菌可用于含有重金屬鎘的尾礦庫中,通過溶磷細(xì)菌的溶磷作用,增加尾礦庫土壤的養(yǎng)分含量,為尾礦庫的植物修復(fù)提供了土壤條件。本研究主要對耐受重金屬鎘的解磷細(xì)菌開展菌株篩選和耐受性研究,對細(xì)菌耐受重金屬的機(jī)理未進(jìn)行深入研究,這是下一步的研究工作,以期為重金屬污染的土壤開展植物修復(fù)提供更多的微生物菌群。

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